外周血染色体标本的制备法

附件一外周血染色体标本的制备法

该法是制备各种染色体标本的基础。

一、操作过程：

1、采血：先在采血者肘部用碘酒棉球及酒精棉球消毒皮肤，再取 2 毫升干燥灭菌

注射器，配上针头（6?7号），并吸取0.2%的肝素液（Heparin ）0.2毫升，湿润针筒。再从肘部静脉采血0.7?1毫升，轻轻转动针筒，使之与肝素混匀。

2、培养：拔去抽血用针头，立即插入灭菌试管内，送入无菌操作箱（此时操作者必须用肥皂洗刷双手，并用自来水冲洗干净，然后双手进入无菌操作箱，依次用碘酒及酒精棉球消毒双手，在火焰旁将血液平均滴入2?3 个已盛好培养基的小瓶内（培养基

的组合：RPMI1640 或Eagle 或M199 毫升，小牛血清1 毫升，PHA5 毫克，用5%NaHC3O 调pH至7.0?7.4 ）,盖上翻口瓶盖，轻轻摇动。如到外地采血培养亦可因地制宜，无需在无菌操作箱内接种，方法是：抽血完毕，转动针筒，将血液与肝素混匀，拔去针头，重新换上灭菌注射针头，将血液直接从翻口橡皮塞（用碘酒及酒精棉班干部消毒）上插入，将血液缓缓滴入培养瓶内，轻轻摇动，置370C温箱中培养66?72小时。

秋水仙素（Colchieine ）处理：在终止培养前4?6 小时，将事先配制好的0.01% 秋水仙素1滴（每毫升50滴约2卩g）加入培养瓶内，轻轻摇动，放回温箱中，继续培养4?6 小时，这样使细胞分裂停止在中期。

4、离心：用吸管吸取培养物，并移入刻度离心管内，以1000 转/分离心8分钟，吸去上清液，留底层离心沉淀物。

5、低渗处理：加5毫升预温（370C）的0.75M KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，仍放回370C温箱中，静止15分钟。这样使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。

6、预固定：在低渗15分钟后，加固定剂（冰醋酸:甲醇，1:3）1 毫升，打匀。

7、再离心：为了收集细胞，以1000转/ 分离心8分钟，然后吸去上层液，保留沉淀物。

8、固定：沿离心管管壁加入新配制固定液（甲醇:冰醋酸，3:1 ）5毫升，过5 分钟后，用吸管将底部沉淀物轻轻打匀，继续固定30分钟。

9、再离心：以1000转/分离心8分钟，弃去上清液。

10、再固定：再加入新配固定液 5 毫升，打匀，静止30分钟。

11、再离心：以1000 转/分离心8分钟，弃去上清液。

12、四次固定：加入新配固定液0.5?1 毫升，打匀制成细胞悬液。

13、制片：用滴管吸细胞悬液2?3滴，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，并在酒精灯的火焰下通过几次，促使细胞平铺于载玻片上，并在空气中晾干或用电吹风吹干。

14、染色：用Giemsa染液染色30分钟（取Giemsa原液1份，pH7.4的磷酸9份），然后取出玻片，用蒸馏水轻轻冲洗，并晾干。

15、镜检及摄影：将染色后的玻片先用低倍镜作全面检查，寻到良好的分裂相后，换用高

倍镜和油镜进行观察，进行研究分析，必要时选择几个分裂相好的标本，进行显微镜摄影，冲洗放大。

16、核型分析：将放大后的照片上的染色体一一剪下，将大小相同的，成对的排在一起(按丹佛体制) ，计数并分辨各个染色体的形态，注意有否异常。根据这些特点，做出正确的分析判断，然后写出报告。

二、注意事项：

1、外周染色体标本制备失败最常见的原因:

( 1)器皿洗涤不净、有酸碱残留。

(2)培养液太酸或太碱均不利细胞生长，可用5%MaHCO或0.2%的HCL调节pH至

7.2?7.4左右。

( 3)种人细胞数太多或太少。

( 4)无菌操作不严，严重污染。

( 5) PHA 是成败的关键，如果保存不善，效价低或数量不足，则作用差，但浓度过大红细胞凝块，这些都会影响细胞生长。

( 6)培养细胞的温度严格掌握在37±50C。

( 7)药品称量要十分准确，否则造成渗压高或低。

2、标本质量不佳的最常见原因:

( 1)秋水仙素一次配制后冰冻保存不超过半年，用量过大，染色体过度收缩，乃至染色体离散，用量小则影响分裂相。

( 2)低渗处理极为重要，低渗不够则染色体团在一起，太过则往往细胞全部破碎，染色体丢失不全。

( 3)细胞太多或太少均会影响分裂相的多少及标本质量。

( 4)离心速度太高，细胞团块不易打散，速度太低则会丢失大量分裂相。

( 5)机械打散无力，细胞成团，若用力过猛，细胞容易破碎，染色体不完整。

( 6)固定液加入太快，混匀太快，会使固定作用过强，染色体扭转，固定液作用不足，染色体出与毛刷状，因此固定液纯度要高，临时用新鲜配制，应沿管壁慢慢加入，固定后彻底打匀。

( 7)玻片应严格清洁，去除酸碱，如有油脂或冷却不够灰影响细胞的铺开。