缓冲溶液的配制

缓冲溶液

缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持pH值基本不变的溶液。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合物溶于溶剂（即纯水）所得的溶液，溶液内所溶解的溶质（化合物）称之为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得不同pH的缓冲液。

缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，而且受到氢离子浓度的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动需要一定的pH值，体内pH环境的任何改变都将引起与代谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。下表列出某些人体体液的pH值：

7.1 基本概念

⑴Br?nsted-Lowry酸碱理论（又称酸碱质子理论）。1923年由

丹麦化学家J.N.Br ?nsted 和英国化学家T.M.Lowry 同时提出了酸碱质子学说，发展了酸碱理论，被后人称为酸碱质子理论或Br ?nsted-Lowry 酸碱理论。他们认为凡能释放质子的分子或离子（如：H 2O ，HCl ，NH 4+，HSO 4— 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H 2O ，NH 3，Cl —等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。

A —H ＋

B — A ＋ B —H 酸1 碱2 碱1 酸2

酸1 是 碱1的共轭酸， 碱2 是 酸2 的共轭碱。 如盐酸在水中的解离： HCl Cl — ＋ H + HCl 是酸，Cl —是它的共轭碱。 ⑵ 缓冲体系的设计：

强电解质溶于水几乎全部解离为正负离子，弱电解质溶于水时，则不完全解离，只有部分的分子解离出正负离子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA ）及其盐溶于水时，只有部分HA 解离为 H + 和 A —离子，其平衡方程式如下： K 1

HA A — ＋ H + (1-1)

K2

][]][[HA A H K a -+=

∴

][]

[][-+=A HA K H a

(1-2)

(1-2)式两边取负对数：

][]

[lg

lg ]lg[HA A K H a -+

=＋－－ (1-3)

(1-3)式中： [HA] — 为弱酸的浓度

[H +] — 为HA 解离出的氢离子浓度 [A —] — 为HA 的共轭碱的离子浓度 K 1 — 为酸解离的速度常数

K 2 — 为A —与H + 缔合的速度常数

K a — 为反应方程(1-1)达平衡时HA 的解离平衡常数

现将HA 的pK a 定义为 －lg K a ，将HA 溶液的pH 定义为 －log[H +]，

∴ (1-3)式可写为 ：

][]

[lg

HA A pK pH a -=＋ (1-4) 或：

][]

[lg

未离解形式离解形式＋a pK pH = ( 1-5)

方程(1-4)称为：Henderson-Hassel-Balch 方程，此方程对于生物化学学科，在理论与实践上都具有重要意义。该方程表示了溶液pH 与溶质中可解离基团pK a 之间的关系。很明显，当[A —]＝[HA]时： ∴ pH ＝ pK a

这就意味着当[HA]有一半解离时，溶液的pH 等于 pK a ，此弱酸－碱缓冲体系的pK a 即代表缓冲范围的中点。一个缓冲体系的有效缓冲范围，通常是在pK a 值为中点的两个pH 单位范围内，即：缓冲剂的有效pH 范围＝pK a ±1，所以，当缓冲溶液的pH 等于该缓冲剂的pK a 时，缓冲能力最大。若要设计一个新的缓冲体系时，只需按所要求的pH 值查出pK a 值等于此pH 值的各种缓冲剂并从中进行挑选即可。

1960年，N.E.Good 和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性：

① pK a 值在6～8之间； ② 在水中的溶解度高；③ 不易穿透生物膜；④ 盐效应小；⑤ 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小；⑥ 不与金属离子生成复合物或沉淀； ⑦ 该缓冲剂化学稳定；⑧ 紫外和可见光波长范围内光吸收小；⑨ 易制得高纯度的盐。 按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。

7.2 生物化学常用缓冲液 ⑴ 磷酸盐缓冲液

磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pK a 值，所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽： NaH 2PO 4： pK a1＝2.12， pK a2＝7.21 Na 2HPO 4： pK a1＝7.21， pK a2＝12.32

配酸性缓冲液：用NaH2PO4，pH＝1～4，

配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8，

配碱性缓冲液：用Na2HPO4，pH＝10～12。

用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。

磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH范围宽；③pH受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。

其缺点为：①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。

⑵Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液

Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。

Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如：

Tris-HCl缓冲液：pH＝7.5～8.5

Tris-磷酸盐缓冲液：pH＝5.0～9.0

配制常用的缓冲液的方法有两种：①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris 碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加4N HCl，用pH 计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。

Tris-HCl缓冲液的优点是：①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。

其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；②温度效应大，温度变化对缓冲液pH 值的影响很大，即：

△pK a／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl 缓冲液不能用于0℃～4℃。③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。

⑶有机酸缓冲液

这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。

甲酸～甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸～乙酸钠和柠檬酸～柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pK a值：pK a1＝3.10，

pK a2＝4.75，pK a3＝6.40。琥珀酸有二个pK a值：pK a1＝4.18，pK a2＝5.60。

有机酸缓冲液的缺点是：①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用；②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn++、Mg++等）结合而使缓冲液受到干扰；

③这类缓冲液易与Ca++离子结合，所以样品中有Ca++离子时，不能用这类缓冲液。

⑷硼酸盐缓冲液

常用的有效pH范围是：pH＝8.5～10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。

⑸氨基酸缓冲液

此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有：甘氨酸—HCl缓冲液：pH=2.0～5.0，

甘氨酸—NaOH缓冲液：pH=8.0～11.0，

甘氨酸—Tris缓冲液：pH=8.0～11.0，（此缓冲液用于广泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液），

组氨酸缓冲液：pH=5.5～6.5，

甘氨酰胺（glycine amide）缓冲液：pH=7.8～8.8，

甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）缓冲液：pH=8.0～9.0。

此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰

某些生物化学反应过程，如代谢过程等。②试剂的价格较高。

⑹两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又称Good’s缓冲液

1960年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些缓冲体系应具有前面所述的九条要求和特性。他们合成的一系列Good’s缓冲液可查阅有关的资料。

Good’s缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。其缺点是：①价格昂贵，②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。

常用缓冲溶液的配制方法

1．甘氨酸–盐酸缓冲液（0.05mol/L）

甘氨酸分子量= 75.07，0.2 mol/L甘氨酸溶液含15.01克/升。

2．邻苯二甲酸–盐酸缓冲液（0.05 mol/L）

邻苯二甲酸氢钾分子量= 204.23，0.2 mol/L邻苯二甲酸氢溶液含40.85克/升

24

Na2HPO4·2H2O分子量= 178.05，0.2 mol/L溶液含35.01克/升。

C4H2O7·H2O分子量= 210.14，0.1 mol/L溶液为21.01克/升。

液或浓盐酸调节，冰箱保存。

柠檬酸C6H8O7·H2O：分子量210.14，0.1 mol/L溶液为21.01克/升。

柠檬酸钠Na3 C6H5O7·2H2O：分子量294.12，0.1 mol/L溶液为29.41克/毫升。

6．乙酸–乙酸钠缓冲液（0.2 mol/L）

Na2Ac·3H2O分子量= 136.09，0.2 mol/L溶液为27.22克/升。7．磷酸盐缓冲液

Na2HPO4·2H2O分子量= 178.05，0.2 mol/L溶液为85.61克/升。

Na2HPO4·12H2O分子量= 358.22，0.2 mol/L溶液为71.64克/升。

NaH2PO4·2H2O分子量= 156.03，0.2mol/L溶液为31.21克/升。（2）磷酸氢二钠–磷酸二氢钾缓冲液（1/15 mol/L）

Na2HPO4·2H2O分子量= 178.05，1/15M溶液为11.876克/升。

KH2PO4分子量= 136.09，1/15M溶液为9.078克/升。

8．磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液（0.05M）

9．巴比妥钠-盐酸缓冲液（18℃）

巴比妥钠盐分子量=206.18;0.04M溶液为8.25克/升

10．Tris–盐酸缓冲液（0.05M，25℃）

50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与X毫升0.1N盐酸混匀后，加水稀释至100

三羟甲基氨基甲烷（Tris ）HOCH2 CH2OH C

HOCH2 NH2

分子量=121.14;

0. 1M 溶液为12.114克/升。Tris 溶液可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。

硼砂Na 2B 4O 7·H 2O,分子量=381.43;0.05M 溶液（=0.2M 硼酸根）含19.07克/升。 硼酸H 2BO 3,分子量=61.84,0.2M 溶液为12.37克/升。 硼砂易失去结晶水，必须在带塞的瓶中保存。

11

．硼酸-硼砂缓冲液（0.2M 硼酸根）

硼砂Na 2B 4O 7·10H 2O,分子量=381.43;0.05M 溶液（=0.2M 硼酸根）含19.07克/升。 硼酸H 2BO 3，分子量=61.84, 0.2M 溶液为12.37克/升。 硼砂 易失去结晶水，必须在带塞的瓶中保存。

12．甘氨酸–氢氧化钠缓冲液（0.05M ）

甘氨酸分子量=75.07;0.2M 溶液含15.01克/升。

13．硼砂-氢氧化钠缓冲液（0.05M 硼酸根）

硼砂Na 2B 4O 7·10H 2O,分子量=381.43;0.05M 溶液为19.07克/升。

14．碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（0.1M ）

2+、Mg 2+存在时不得使用

2

22N 2HCO 3分子量=84.0;0.1M 溶液为8.40克/升。 16.伯瑞坦-罗比森缓冲溶液 Britton-Robinson 缓冲溶液

别名：B-R 缓冲溶液，B-R 缓冲液

英文名：Britton-Robinson Buffer Solution （伯瑞坦-罗比森缓冲溶液） 在100ml 三酸混合液（磷酸、乙酸、硼酸，浓度均为0.04mol/L ）中，加入表中指定体积的0.2mol/LNaOH ，即得表中相应PH 值的缓冲溶液。

pbs缓冲液

含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS－T)配制方法为：

称取磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，吐温－20 ，加水。

PBS:Phosphate Buffered Saline

PBS 1L配方pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4)，氯化钠(N aCl)，氯化钾(KCl)，加水。

PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，具体试剂一般也有不同的比例配方，在针对性上就有了更好的效果。

按上面的配方配成的PBS缓冲液的PH还必需测定过吗？

首先4楼的提问非常好，这个也是我个人在实验当中出现过的问题。

根据经验来看，新鲜配置的PBS搅匀后其PH值约在7.2-7.4之间，可是在温

度的影响下，尤其在夏天，其电离常数发生了改变，在经过昼夜的时间

后，PH值会明显改变（我亲自测过偏酸）。所以做实验的同学可要注意

了，PH值可能会影响实验结果，甚至可能导致阴性。所以务必记得这个时

候和天气，要加强实验条件控制问题。每次使用前最好用试纸测一下过夜

了的PBS，如果发生偏酸或偏碱，注意重新换新液（PBS不贵的）

PBS缓冲液

称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4?12H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g，溶于900ml 双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。

PBST缓冲液

取300μl Tween-20 加入PBS 100ml中，混匀后即刻使用。现用现配。

哦，不用，你先配浓缩的，然后灭菌，然后用灭过菌的水稀释，就可以了。

出来以后没什么影响，灭菌只是为了不让久置的缓冲液发霉，如果很快就用的话，没关系的，对实验结果不会有任何影响。

阴性就是没有抗原抗体酶底物之一个系统形成，缺少其中一部分，导致没有出现可见的反应，或结果不正确。后面那个问题看你做什么了