基因探针法在食品检验中的应用

吴豪奇

概要：

DNA基因探针技术是近年来发展起来的一种高新生物技术,并以其敏感性、特异性、简便、快速的优点,在食品科学领域得到了广泛的应用。这篇文章着重介绍了这一种技术的基本原理及其在食品检测中的应用概况,并对其在食品检测领域里应用存在的问题进行了分析和阐述。

技术原理：

基因探针技术即DNA探针技术，又称分子杂交技术，是利用DNA 分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。

两条不同来源的核酸

链如果具有互补的碱基序

列,就能够特异性的结合

而形成分子杂交链。若在

已知的DNA或RNA片段上

加上可识别的标记(如用

32 P同位素标记、生物素

标记),就可制成DNA探针,

用以检测未知样品中是否有与其互补的基因序列,并可进一步判定其

与已知序列的同源程度。1

DNA探针使用方法分为3类：

1.第一类称为短针法。如果DNA靶顺序链己知,

就可以用自动化学分析法将要判定的DNA多核苷

酸互补、标识。

2.第二类是应用于总的胞内DNA探针法。这种

方法要先提取然后用生物化学方法标识。它一般

不能用于区别相似的、关系密切的生物。因为它

们具有许多相似的DNA顺序(例如牛与羊)。上述

两种方法都比较简单,费用也相对比较便宜。

3.第三类方法是采用DNA

重组的克隆技术。采用这种

技术能得到具有高度专一性

的探针,而不需有关靶顺序

的预先知识,但比较复杂,其

基本过程是首先将DNA从酶

重组后的目标物中提取出来,

然后进行克隆。当它们大量

繁殖后即被收集起来标识,

再筛选出目标DNA,以决定杂交关系。这种使用探针的方法是所选择的最适合的方法,采用克隆杂交法进行微生物分析的步骤为:

1卿柳庭等.核酸探针和PCR技术在食品检验中的应用[J].动物医学进展,2000,21(2)

1)让细菌在有琼脂的培养基上形成克隆体;

2)无菌膜复制在皿上,从克隆体中获取细胞,形成替代皿;

3)设法将膜上的细胞DNA双螺旋链打开,释放出单一DNA链,然后DNA链被固定;

4)与DNA探针互相配对具有靶顺序的微生物马上可被鉴别、计数。

技术应用：

近年来DNA探针杂交技术在食品微生物检测中的应用研究十分活跃。例如，在食品微生物检测中，大肠杆菌具有葡糖苷酸酶的特性，利用大肠杆菌中编码该酶的基因序列作为目标DNA，并制成DNA探针，用以检测食品中的总大肠杆菌。

DNA探针用于食品中微生物检测的关键是DNA探针的构建。为保证检测结果的高度特异性,必须根据具体的检测目标,构建不同的DNA 探针。构建用于检测食品中微生物的DNA探针的原则是,以待检微生物中特异性保守基因序列为目标DNA,以该序列的互补DNA作为杂交探针,对一般微生物而言,可以用决定该微生物特有的生理、生化特征的基因序列构建特异性的DNA探针。

国外Moseley等利用生物素标记的克隆沙门氏菌DNA片段作为基因探针,检测临床样品、食品及饲料样品中的沙门氏菌,敏感性为80个细菌/克。Hill等人曾用[a-32 P]标记的DNA探针检测污染食品中的产热敏性肠毒素(LT)的大肠杆菌,其敏感性达100个细菌/克。国内周志江等用生物素标记的编码大肠杆菌耐热毒素(ST)的DNA片段

作为探针,检测污染食品中产ST的大肠杆菌。陈倩等对自食品中以血清学初筛分离出的78株ESIEC菌株,以rp-z探针检测其HPI毒力岛基因,结果检出了7株,可鉴定为ESIEC大肠杆菌。

技术优缺点：

与传统微生物检测方法相比，基因探针技术既有其优点，又有不可忽视的缺点。

1.优点：①能克服传统食品微生物检验方法的不足，避免了传统检测方式的种种弊端；②特异性强；③灵敏度高，提升了检测的精准度；④操作简便、省时，简化了检测的操作流程，优化了检测结果。

2.缺点：①检测成本高；②速度相对较慢；③效率相对较低；④放射性同位素标记的DNA探针具有半衰期短,对人体有危害,作为常规诊断、特别是在食品检测实验室中不太适用；⑤生物素标记的DNA 探针虽然对人畜无害,但生物素标记的DNA探针在紫外线照射下易分解,同时食品中的内源性生物素化蛋白质和其他糖蛋白类物质常引起背景加深和非特异性反应；⑥菌落杂交的敏感性也受其他因素的影响。

DNA探针技术虽为一种快速、敏感、特异的检测新技术,但在实际应用仍然存在一定的问题。但是随着生物技术的进一步发展和完善,相信在不久的将来DNA探针技术在食品微生物检测中不失为一种有效的检测技术。