黄曲霉毒素的毒性及其检测方法

【摘要】黄曲霉毒素性质较稳定，其产生菌黄曲霉菌在自然条件下较易生长繁殖，并产生具有毒性的黄曲霉毒素，随着人们对食品安全重视程度的日益提高,消费者对绿色食品的要求越来越迫切,本文就黄曲霉毒素的产生条件、危害及检测方法等内容做一综述。

【关键词】黄曲霉毒素;生长条件;毒性及其危害;检测方法

黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)是一类具有强致癌性和强免疫抑制性的毒性物质,广泛存于发霉花生、花生油、玉米及其制品、乳与乳制品、动物饲料中,它不仅直接对人体及动物造成毒害,还可以通过食物链从动物转移到人体,严重危胁着人类的健康。正确认识黄曲霉毒素以及黄曲霉毒素对食品污染的危害性,对于有效防治粮食及食品中黄曲霉毒素的污染,保障人们的身体健康乃至生命安全有着非常重要的意义。

1黄曲霉毒素的性质及生长条件

1.1黄曲霉毒素的性质

黄曲霉毒素不溶于水，可溶于氯仿、甲醇和乙醇等有机溶剂中，黄曲霉毒素在紫外区域具有强烈的荧光特性，黄曲霉毒素在中性和酸性条件下比较稳定，在pH为1~3时稍有分解，在碱性条件下分解且荧光消失，但有可逆性。结晶的黄曲霉毒素B1有较高的热稳定性，分解温度为268℃左右，故烹调中的一般加热不能破坏黄曲霉毒素。在有氧条件下，紫外线照射可以去毒。

1.2黄曲霉毒素的生长条件

产生黄曲霉毒素的最基本条件是产毒真菌的存在"经过大量实验证明，能产生AF的真菌主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌，而黄曲霉菌是一种广泛分布于世界各地区的比较常见的腐生菌，适宜的条件是它产生毒素的温床"影响曲霉菌生长繁殖及产毒的因素有很多，与食品关系密切的主要有水分、温度、食品基质、通风条件等。

2黄曲霉毒素的毒性及其危害

2.1黄曲霉毒素的毒性

黄曲霉毒素是黄曲霉菌在粮食和油料等食品中生长繁殖时产生的，其中以花生、玉米、小麦和大米最容易受到黄曲霉毒素的污染，人们食用被黄曲霉毒素污染的粮食和食品，牲畜使用被污染的饲料后均可引起中毒。黄曲霉毒素是一种剧毒和强致癌物质。

黄曲霉毒素的LD50(半数动物致死量)为0.249mg/kg，其毒性是氰化钾的10倍，是

砒霜的68倍。黄曲霉毒素主要通过食物摄入后经消化道吸收，大部分分布在肝

脏，在肾脏、血液、肌肉和脂肪中也有少量分布，体内代谢过程主要为羟基化、去甲基化和环氧化等作用，主要代谢产物也具有毒性或致癌、致突变作用。

2.2黄曲霉毒素的危害

黄曲霉毒素是一类强致癌物质,能使人体或动物的免疫功能丧失,中毒症状表现为呕吐、厌食、发热、黄疸、腹水等肝炎症状,能诱导畸形、癌症的发生。人摄入大剂量的黄曲霉毒素后可出现肝实质细胞坏死、胆管上皮细胞增生、肝脂肪浸润及肝出血等急性病变，前期症状为发烧、呕吐、厌食、黄疸，继而出现腹水，下肢浮肿并很快死亡。

由黄曲霉毒素引起的中毒事件，国内外都有过报道，其中以1974年印度发生的中毒事件最为严重:印度西部两个邦中200多个村庄皆以玉米为主食，由于当年雨水过多，造成玉米严重霉变，村民食用霉变玉米后导致397人中毒，106人死亡，尸检及病理实验证明，这次中毒事件的原因是黄曲霉毒素中毒。而慢性毒性表现为生长障碍，肝脏出现亚急性或慢性损伤，体重减轻，诱发肝癌等。

3黄曲霉毒素的检测方法

3.1薄层分析法（TLC）

TLC法是过去检测黄曲霉素最常用的方法，至今仍为中外检测机构所用，是我国的一种国标方法。其原理是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将黄曲霉素从样品中提取出来,经柱层析净化后，再在薄板上展开以分离，利用黄曲霉素的荧光特性，根据荧光斑点的强弱与标准比较确定其含量，对于一些组分复杂的样品需双向展开，方可获得较高的灵敏度。

TLC法的优点是：属于常规检测方法，是经典的方法，设备简单，检测费用低廉，一般实验室均可完成;缺点有;操作繁琐、费时，提取和净化效果不甚理想，灵敏度较差，对操作人员身体健康存在较大程度的威胁。

3.2液相色谱法（H PLC）

H PLC法是近年来发展起来的一种方法，原理是经高效液相色谱仪（用ODS C18柱）加柱后衍生系统分分离，用荧光检测器测定。与其配套的柱后衍生系统有我国国标规定的碘衍生化法，也有国外的溴衍生化法，还有较为先进的电化学衍生化法和光化学衍生化法。目前，该方法多用到免疫亲和小柱来净化、分离，净化效果优异，是生物学与化学结合的典范产物。

该法的优点是：可准确分离黄曲霉素各种毒素,检测快速而且定性定量准确，检测限是目前所知黄曲霉素检测方法中最低的，可以做为仲裁法使用;缺点是：仪器设备价格高昂，传统前处理方法相对繁琐，若用到免疫亲和小柱则会使样品检测费用增高，对工作人员的身体健康仍有一定程度的威胁。

3.3酶联免疫法（ELI SA）

ELISA法是利用免疫、酶及生化计数，开辟黄曲霉素分析的新领域，也是近年来研究开发出来的一种较为新颖的方法，也是我国的一种国标方法。ELISA 是国际上20世纪70年代出现的一种新的免疫测定技术，其原理是抗体和抗原之间的特异性的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的灵敏度。

该方法的优点是：检测速度快捷，对人体危害小;缺点是:重复性差,试剂寿

命短,需低温保存,假阳性概率较高，需要配置专门的酶标仪,对一些含盐量高\脂肪含量高的样品需要进行额外的适当的处理。

3.4荧光光度法（IAC/SFB）

IAC/SFB法也同样是我国国标方法的一种。原理是利用黄曲霉素各种毒素的荧光特性，用荧光光度计测定样品中黄曲霉素的含量.大致过程是：试样先经甲醇/水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉素特殊抗体的免疫亲和柱净化（生物免疫学原理，此抗体对黄曲霉素具有专一识别功能),黄曲霉素键合在免疫亲和小柱的抗体上，用蒸馏水将柱上的杂质除去后，以甲醇将目标化合物洗脱下来，加显色剂于专用的荧光光度计中测定样品中的黄曲霉素含量。

该方法的优点是：对检测人员身体健康无危害，检测样品速度迅速，灵敏度高，适宜于大量样品检测，且定量准确;缺点是：检测费用较高，需配备专门的设备，尚不能对单一的毒素进行检测。

4结语

黄曲霉毒素是一种强致癌的天然毒素,直接威胁着人类的健康和生命,随着食品安全性知识的普及和消费者安全意识的加强,各国先后对食品中黄曲霉毒素的允许量提出了严格要求。为了保障人类的健康,必须对黄曲霉毒素污染的预防、控制和去除方法进行深入的研究,这就给农业技术工作者、检测工作者、科学工作者提出了更高的要求。

9.流感病毒的快速检测方法

流感病毒的快速检测方法一、RT-PCR快速诊断方法（一）生物安全要求（二）病毒核酸提取（三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化（五）流感病毒RT-PCR检测引物二、免疫荧光方法检测流感病毒（一）原理（二）标本处理（三）间接免疫荧光法（四）结果判断三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测（一）基本原理（二）实验试剂（三）实验步骤四、快速诊断试剂盒流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。一、RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。（一）生物安全要求生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。

细胞毒性检测方法总结!

细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法： MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。特点： 1）简单、快速。2）板式检测，可进行高通量。三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测

有毒气体检测报警仪技术条件及检验方法.

c．其它有关材料。 6．2 试验条件 6．2．1 环境温度：15℃-35℃ 6．2．2 环境湿度：≤85%RH 6．2．3 供电电源 a．直流电源：额定值±10% b．交流电源：220V+10% 220V-15% 6．2．4 周围环境应无干扰检测的因素 6．3 仪器外观、结构和功能检查 a．仪器外表涂层应色泽均匀，不得有明显的擦伤、露底、裂纹及起泡现象； b．紧固件、开关、旋钮等部件装配应可靠，使用方便，性能良好； c．仪器的结构应符合5.1要求； d．仪器的零点、量程、报警点三个电位器应调节方便，设置可靠； e．仪器通电检查其功能应符合5.2要求。 6．4 试验前的准备 6．4．1 试验前仪器稳定时间按仪器生产厂家规定的稳定时间。 6．4．2 试验前调零经过6.4.1条规定的稳定时间后，在零气条件下调节仪器的零点使指示值为零。 6．4．3 试验前仪器标定经6.4.2条调零后，在通入标定气条件下调节仪器，使其指示值与标定气浓度值相对应。 6．5 试验要求 6．5．1 试验前按6.4条做好试验准备。 6．5．2 标准气选用该仪器检测气体与空气（或氮气）的混合气，按GB5274、GB5275配制，其浓度的不确定度在±3%以内。 6．5．3 试验时通气方法要严格模拟该仪器的使用情况 a．泵吸式仪器，标准气流量要恒定在额定值，不应因入口压力变化而使标准气流量波动。 b．扩散式仪器，标准气接触检测器的压力要求恒定在常压（大气压）或一个微小的压力（其值不得超过100Pa），通气流量要恒定。 6．6 试验项目及方法 6．6．1 示值误差试验 a．示值误差指示值与标准气浓度值之差，用相对量表示，按下式计算： b．试验方法

细胞毒性实验方案

细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45μm滤膜灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO 2 -SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO 2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、 SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO 2-SS-HA/DOX、SiO 2 、HA、DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤：细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。细胞的传代：将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口

第25章病毒感染的检查方法

第25章病毒感染的检查方法与防治原则第一节病毒的诊断随着对病毒感染从生物学及分子生物学水平的研究进展，病毒的诊断技术已由传统方法扩展至新的快速诊断技术。病毒感染的快速诊断有利于对病毒感染者的治疗；例如对有些病毒（如疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒）感染已有较特异的抗病毒药物治疗。早期诊断及早期治疗对控制病毒感染十分重要。此外，从群体感染角度分析，确诊病毒感染的病原在监测病毒的流行病学（如新型流感病毒、肺出血型汉坦病毒的发现等）方面也有重要的现实意义。标本的采集与送检用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集病人急性期标本。根据不同病毒感染采取不同部位的标本（如鼻咽分泌物、脑脊液、粪便或血液）。由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送标本中注意冷藏。如欲检测抗体，早期单份血清可用于检测IgM抗体，而欲检测早期与恢复期的抗体效价的变化，则需采集早期与恢复期双份血清。血清抗体检测标本应保存于－20℃。病毒的分离、培养与鉴定目前最常用的方法是细胞培养。在注明欲检测的病毒后，病毒分离培养的实验室将选择适当的原代培养细胞（敏感性高）及传代细胞系（便于在实验室保存）作病毒分离培养。接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。如我国台湾省确定由肠道病毒71型引起多数患儿发生脑膜炎并致死的研究报道，就是由分离培养及鉴定病毒所确诊。如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的机率。再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。在流感病毒的分离培养中，最敏感而特异的方法是鸡胚接种，并用血凝和血

药典三部(2015版)-通则-1141异常毒性检查法

1141 异常毒性检查法异常毒性有别于药物本身所具有的毒性特征，是指由生产过程中引入或其他原因所致的毒性。本法系给予动物一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察动物出现的异常反应或死亡情况，检查供试品中是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。供试品溶液的制备按品种项下规定的浓度制成供试品溶液。临用前，供试品溶液应平衡至室温。试验用动物应健康合格，在试验前及试验的观察期内，均应按正常饲养条件饲养。做过本实验的动物不得重复使用。非生物制品试验除另有规定外，取小鼠5只，体重18～22g，每只小鼠分别静脉给予供试品溶液0.5ml。应在4～5秒内匀速注射完毕。规定缓慢注射的品种可延长至30秒。除另有规定外，全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡；如有死亡时，应另取体重19～21g的小鼠10只复试，全部小鼠在48小时内不得有死亡。生物制品试验除另有规定外，异常毒性试验应包括小鼠试验和豚鼠试验，试验中应设同批动物空白对照，观察期内，动物全部健存，且无异常反应，到期时每只动物体重应增加，则判定试验成立。按照规定的给药途径缓慢注入动物体内。 ⑴小鼠试验法除另有规定外，取小鼠5只，注射前每只小鼠称体重，应为18～22g。每只小鼠腹腔注射供试品溶液0.5ml，观察7天。观察期内，小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，判定供试品符合规定。如不符合上述要求，应另取体重19～21g的小鼠10只复试1次，判定标准同前。 ⑵豚鼠试验法除另有规定外，取豚鼠2只，注射前每只小鼠称体重，应为250～350g。每只豚鼠腹腔注射供试品溶液5.0ml，观察7天。观察期内，豚鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只豚鼠体重应增加，判定供试品符合规定。如不符合上述要求，可用4只豚鼠复试1次，判定标准同前。

细胞毒性药物配制方法及使用时注意事项

抗肿瘤药物的用药顺序及溶媒选择原则（1）药物相互作用原则有的化疗药物之间会发生相互作用，从而改变药物的体内过程，可能影响疗效或毒性。如顺铂影响紫杉醇的清除率，先用紫杉醇再用顺铂。（2）刺激性原则使用非顺序依赖性化疗药物时，应先用对组织刺激性较强的药物，后用刺激性小的药物。由于治疗开始时静脉尚未损伤，结构稳定性好，药业渗出机会少，药物对静脉引起的不良反应较小如长春瑞滨和顺铂合用时，长春瑞滨刺激性强，宜先给药。（3）细胞动力学原则生长较慢的实体瘤处于增殖期的细胞较少，G0期细胞较多，先用周期非特异性药物杀灭一部分肿瘤细胞，使肿瘤细胞进入增殖期再用周期特异性药物。顺铂和依托泊苷合用时，先用顺铂后用VP-16。生长快的肿瘤先用周期特异性药物大量杀灭处于增殖周期的细胞，减少肿瘤负荷，随后用周期非特异性药物杀灭残存的肿瘤细胞。用药顺序 1、联用顺铂化疗化疗方案联用药物用药顺序原因 GP 吉西他滨先用GEM 顺铂会影响吉西他滨的体内过程，加重骨髓抑制。TP 紫杉醇先用PTX 顺铂对细胞色素P450酶有调节作用，可使PTX清除率大约降低33%,产生更为严重的骨髓抑制 FP 5-FU 先用DDP 小剂量DDP能够增加细胞内蛋氨酸, 使细胞内活性叶酸生成增加, 从而增加5-FU的抗肿瘤作用。 PP 培美曲塞先用Alimta，30min后用顺铂说明书 2、联合长春新碱化疗化疗方案联用药物用药顺序原因 CHOP 环磷酰胺先用VCR，6-8小时后在给CTX VCR具有同步化作用，使细胞停滞在M期，约6~8h后细胞同步进入G1期，再用CTX可增效 VCM 甲氨蝶呤先用VCR VCR阻止甲氨蝶呤从细胞内渗出而提高细胞内浓度 VDLP 门冬酰胺酶先用VCR 合用加重神经系统血液系统毒性，先于门冬12~24小时给药 3、甲氨蝶呤化疗方案联用药物用药顺序原因 CMF 5-FU 用MTX4～6h后用5-FU 序贯抑制 MTX----二氢叶酸还原酶抑制剂 5-FU-----胸腺嘧啶合成酶抑制剂

病毒性传染病快速检测方法的原理及发展趋势答案

病毒性传染病快速检测方法的原理及发展趋势人副流感病毒的病原学特征及流行病学规律 1、HPIV的治疗中（）只能在早期使用 B、利巴韦林、干扰素和蛋白酶抑制剂 2、下列有关于HPIV的说法中，错误的是（） E、HPIV已成为能够导致最沉重疾病负担及影响经济的病毒之一 3、HPIV的实验室检测手段有（） A、LLC-MK2（恒河猴肾细胞） 4、有关HPIV的病原学特征说法错误的的是（） B、病毒粒子呈多形性、无包膜，直径约125～250nm 5、下列关于几个亚型的HPIV的季节流行特征的说法中，错误的是（） C、HPIV2的几乎每年均可检出，发病高峰期为春夏季

人呼吸道合胞病毒的病原学特征及流行病学规律 1、下列选项中（）属于HRSV的实验室检测 B、Hep-2细胞单层 2、（）是目前临床上唯一用于治疗HRSV感染的药物 A、利巴韦林 3、下列关于HRSV的临床表现中错误的是（） B、大多数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎 4、HRSV的致病机包括（） E、以上都是 5、HRSV的病原学特征不包括（） B、HRSV病毒粒子呈球形和棒状两种形态，病毒颗粒约120~300 nm 人禽流感病毒及实验室检验技术

1、血凝（HA）试验原理是HA能与人或其它动物多种红细胞表面（）受体结合引起红细胞凝集 B、N－乙酰神经氨酸酶 2、中国流感/人禽流感监测信息系统至少有（）个国家级网络实验室 A、60 3、人禽流感病毒检测接种鸡胚，样本需要在温度33-35℃、湿度40-60%条件下孵育（） A、2-3天 4、以下哪项不属于人禽流感病毒核酸检测方法（） D、鸡胚接种 5、微量血抑（HI）试验应制备相应亚型的（）个血凝单位的抗原 B、8

狂犬病病毒实验室检测方法

狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。 1、狂犬病病毒形态特征 RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白

HG23006-92有毒气体检测报警仪技术条件及检验方法

有毒气体检测报警仪技术条件及检验方法来自: 安全管理网（https://www.360docs.net/doc/f02953648.html,）详细出处：https://www.360docs.net/doc/f02953648.html,/Standard/Trade/Chemical/200810/4840.shtml 1 主题内容与适用范围本标准规定了有毒气体检测报警仪分类、技术要求、检验方法等。本标准适用于有毒气体检测报警仪的质量评价、检验和选型。 2 引用标准 GB2421 电工电子产品基本环境试验规程总则 GB3836.1 爆炸性环境用防爆电气设备通用要求 GB3836.2 爆炸性环境用防爆电气设备隔爆型电气设备“d” GB3836.4 爆炸性环境用防爆电气设备本质安全型电路和电气设备“i” GB5274 气体分析校准用混合气体的制备称量法 GB5275 气体分析校准用混合气体的制备渗透法 GB12358 作业环境气体检测报警仪通用技术要求 3 术语 3．1 有毒气体检测报警仪（以下简称仪器）用于监测空气中对人体有毒有害气体的仪器（包括检测仪、报警仪、检测报警仪）。 3．2 零气不含被测气体或其它干扰气体的清洁空气或氮气。 3．3 标准混合气（简称标准气）被测气体和零气的混合气，其浓度和不确定度均为已知。 3．4 标定用标准混合气（简称标定气）用仪器全量程（50—70）%浓度的标准气做为标定气。 4 仪器分类表1 仪器分类表 5 技术要求 5．1 结构要求 5．1．1 防爆型的仪器必须符合GB3836.1、GB3836.2和GB3836.4的规定要求并取得防爆检验合格证。 5．1．2 仪器要坚固耐用，便于操作、维修、标定和校验。 5．1．3 仪器与有害气体以及其它腐蚀性物质接触的部分应使用耐腐蚀性材料或经过耐腐蚀处理的材料制作。 5．2 功能要求 5．2．1 仪器是否处于工作状态，应有明确显示。 5．2．2 报警信号应有明显的报警作用。 5．2．3 设置多点监测报警的仪器，应保证即使某一点正在报警而其它点出现报警条件时，也应该进行报警，并且能够分别指示报警场所。 5．2．4 仪器有较高的抗干扰能力。 5．2．5 连续式仪器应有故障报警功能。 5．3 性能要求

医用无菌敷料细胞毒性的检验方法

０引言细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测。四唑盐（MTT）比色法是细胞毒性检测常用方法之一，利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测。体外细胞毒性试验方法经常用于对医疗器械进行生物学评价，其结果常常用于判断该器械产品的基本生物安全性。医用敷料，是包伤的基本常用器械产品，是用以覆盖疮、伤口或其他损害的医用材料。随着对创面愈合过程的病理生理的深入研究，人们对创面愈合过程的理解也越来越深刻，从而导致了医用创面敷料的不断改进与发展。现在人们对医用敷料的需求也在不断增加，所以相对对各种医用敷料的生物学安全要求也在不断提高。随着产品种类的增多，各种功能的增加，通过适当的体外试验方法来加强其生物安全性的控制与保障显得格外重要。１材料与方法 1.1材料（1）仪器设备 311CO2恒温培养箱，Thermo公司；XDS-1B倒置显微镜，COIC公司；BS2000S电子天平，Sartorins （北京）有限公司；MULTISKAN GO酶标仪，Thermo 公司；全自动立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司。（2）试剂试药医用无菌敷料细胞毒性的检验方法ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＭｅｄｉｃａｌＳｔｅｒｉｌｅＤｒｅｓｓｉｎｇＣｅｌｌＴｏｘｉｃｉｔｙＴｅｓｔＭｅｔｈｏｄｓ罗丹洪燕 Luo Dan Hong Yan （江西省食品药品检验所，江西南昌330029）（Jiangxi Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang330029）摘要：目的：比较医用无菌敷料不同浸提方法所获得的供试液对其细胞毒性的影响。方法：采用四唑盐（MTT）比色法进行细胞毒性试验。结果：面积浸提法得供试液细胞毒性为3级，质量浸提法得供试液细胞毒性为2级。结论：采用质量浸提法得供试液比面积浸提法得供试液的细胞毒性小。关键词：医用无菌敷料；四唑盐（MTT）比色法；细胞毒性中图分类号：R-331文献标识码：A文章编号：1671-4792（2012）12-0241-03 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Objective：Compared medical sterile dressing different leaching method was obtained by liquid on the cell toxicity effect.Method：Using tetrazolium salt(MTT)colorimetric method in cell toxicity test.Result：Area extraction to the liquid cell toxicity for level3,quality extraction to the liquid cell toxicity to level2.Conclu-sion：Using the mass extraction to the liquid ratio area extraction to the liquid cell toxicity small. Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Medical Sterile Dressing；Tetrazolium Salt(MTT)Colorimetric Method；Cytotoxicity 医用无菌敷料细胞毒性的检验方法２４１

药典三部(2015版)-通则-异常毒性检查法

精品文档 . 1141 异常毒性检查法异常毒性有别于药物本身所具有的毒性特征，是指由生产过程中引入或其他原因所致的毒性。本法系给予动物一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察动物出现的异常反应或死亡情况，检查供试品中是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。供试品溶液的制备按品种项下规定的浓度制成供试品溶液。临用前，供试品溶液应平衡至室温。试验用动物应健康合格，在试验前及试验的观察期内，均应按正常饲养条件饲养。做过本实验的动物不得重复使用。非生物制品试验除另有规定外，取小鼠5只，体重18～22g，每只小鼠分别静脉给予供试品溶液0.5ml。应在4～5秒内匀速注射完毕。规定缓慢注射的品种可延长至30秒。除另有规定外，全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡；如有死亡时，应另取体重19～21g的小鼠10只复试，全部小鼠在48小时内不得有死亡。生物制品试验除另有规定外，异常毒性试验应包括小鼠试验和豚鼠试验，试验中应设同批动物空白对照，观察期内，动物全部健存，且无异常反应，到期时每只动物体重应增加，则判定试验成立。按照规定的给药途径缓慢注入动物体内。 ⑴小鼠试验法除另有规定外，取小鼠5只，注射前每只小鼠称体重，应为18～22g。每只小鼠腹腔注射供试品溶液0.5ml，观察7天。观察期内，小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，判定供试品符合规定。如不符合上述要求，应另取体重19～21g的小鼠10只复试1次，判定标准同前。 ⑵豚鼠试验法除另有规定外，取豚鼠2只，注射前每只小鼠称体重，应为250～350g。每只豚鼠腹腔注射供试品溶液5.0ml，观察7天。观察期内，豚鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只豚鼠体重应增加，判定供试品符合规定。如不符合上述要求，可用4只豚鼠复试1次，判定标准同前。

病毒感染的检查方法与防治原则

第12章病毒感染的检查方法与防治原则学习要点一、病毒感染的检查方法 1.检材的采集与送检病毒分离标本的采集原则是：①早期取材；②注意无菌操作；③正确处理含菌标本；④低温保存与尽快送检。 2.病毒的分离培养与鉴定（1）动物接种（2）鸡胚接种（3）组织培养：原代细胞；二倍体细胞；传代细胞系（4）病毒增殖的指标：①细胞的变化；②红细胞吸附；③干扰现象；④培养基pH改变。 3.病毒感染的血清学诊断 (1)中和试验； (2)补体结合试验； (3)血凝抑制试验 4.病毒感染的快速诊断 (1)形态学检查法：光学显微镜检查法；电镜和免疫电镜检查 (2)免疫学检查法：检查病毒抗原；检查病毒特异性IgM (3)检测病毒核酸：核酸杂交技术；PCR技术二、病毒感染的防治原则 1.病毒感染的预防 (1)人工自动免疫用于人工自动免疫的生物制品有：①灭活疫苗；②减毒活疫苗；③基因工程疫苗；还有亚单位疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗等。 (2)人工被动免疫人工被动免疫常用的制剂有：动物免疫血清、人血清丙种球蛋白、转移因子等。 2.抗病毒治疗 (1)抑制病毒穿入与脱壳金刚烷胺

(2)抑制病毒生物合成核苷类化合物（疱疹净、阿昔洛韦、阿糖腺苷、病毒唑、叠氮脱氧胸苷、拉米呋啶等）；病毒蛋白酶的抑制物（沙喹纳伟、英迪纳伟等）；IFN及其诱生剂等。 (3)免疫制剂特异性免疫球蛋白、治疗性疫苗等。 (4)抗病毒中草药复习题一、名词解释 1.二倍体细胞 2.细胞病变效应 3.红细胞吸附试验 4.血凝抑制试验 5.减毒活疫苗 6.灭活疫苗二、选择题 A1型题 1.从患者体内分离病毒，采集标本时的错误．．做法是： A.在发病早期采集 B.选取正确部位取材 C.标本冷藏 D.标本尽快送实验室 E.疾病恢复期取材 2.细胞病变效应不．包括： A.细胞圆缩、脱落 B.细胞融合 C.形成包涵体 D.干扰现象 E.细胞裂解 3.病毒凝集红细胞(血凝试验)的机制是： A.红细胞表面抗原和血凝素抗体结合 B.红细胞表面受体与病毒表面血凝素结合 C.红细胞表面病毒抗原与相应抗体结合 D.病毒与结合在红细胞表面的抗体结合 E.红细胞上的血凝素与病毒结合 4.预防病毒病最有效的方法是使用： A.抗毒素 B.抗病毒化学疗剂 C.中草药 D.疫苗 E.抗菌药物 5.以下描述正确的是 A.人工被动免疫接种的物质为抗原 B.人工被动免疫不能用于治疗

实验方案

实验方案繁殖障碍类病毒病(PR、PP、PRRS)弱毒疫苗的研制 1. 病毒的克隆 1.1 细胞制备原种细胞系（MARC－145，IBRS－2）复苏、传代 1.1.1复苏（a）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即置37℃水浴中不断摇晃，待融化后，将细胞倒入25mL的克氏瓶中，加入含10％BCS的MEM生长液，37℃培养，5－6h后换液以倾去死亡细胞, 37℃培养。待长成单层后，进行传代培养。（b）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即投入37－38℃水浴中，待融化后（约1min），室温下在5min内用25℃左右的血清营养液稀释至原体积的4倍，500r/min离心10min，弃上清，加新鲜营养液悬浮细胞，并将细胞转入25mL的克氏瓶中补足营养液，37℃培养。 1.1.2传代取长满单层后的细胞（约72h），倾去原来的营养液，用Hank’s液冲洗一次，加入0.25%的胰酶(或是0.5%的胰酶和0.04%EDTA的等量混合液)，其加入量以能在细胞上形成1mm 厚的液层为宜。置室温或37℃温度中消化，当细胞层开始由瓶壁脱离时（眼观可见细胞面呈毛玻璃样，镜下观察可见细胞圆缩，间隙增大，即将脱落），将消化液倾出，加入少量营养液，轻晃冲洗细胞层后倾弃，再加入相同于原营养液量的新营养液，以大口径吸管充分吹打，直到细胞完全分散，再加同量营养液，吹打数次后即可分瓶。（为便于吹打和分散细胞，开始时可以少加一些营养液，吹打分散后再逐步追加营养液至需量。）其分种率为1：2或1：3，37℃培养。 1.2 病毒培养种毒（PRRSV[欧美株]、PRV、PPV）复壮、病毒增殖 1.2.1种毒复壮（PRRSV[欧美株]、PRV） (1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液[1％Gln，2％NaHCO3(7.5%),1%双抗的MEM]，洗2－3遍，倾弃清洗营养液； (2) 接毒冻干毒种（原装量为2mL，湿毒1mL，保护剂1mL），以无血清MEM恢复为原装量，每瓶（100mL瓶）接毒1mL； (3) 吸附37℃吸附1h，其中每20min轻轻晃一次，以使接种毒液能与细胞层更好地接触以利病毒吸附。吸附1h后，倒出接种病毒液，再加入含3％BCS的维持液，置37℃培养。 (4) 收获每日观察细胞的CPE。接毒后24h、36h、48h各观察一次CPE，或根据CPE 的形成情况，适当缩短观察间隔时间，待细胞形成80％的CPE时，冻融三次后－20℃冻存。 1.2.2 病毒增殖 (1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液，洗2－3

流感病毒的实验室检测方法及进展

·１９０·星堕墅墅盘查！！！！生篁！！鲞釜ｉ塑！里！』曼！！丛！！至！坠：！！塑！！！！：！！：堕！：！流感病毒的实验室检测方法及进展李月越陈杭薇李兵【摘要】流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其在人群中蔓延快，且具有高发病率及致死率的特点。流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，其确诊还有赖于实验室检查。流感病毒的检测技术大致分为４个方面，即病毒分离培养、血清学诊断、现代免疫学诊断及分子生物学诊断。现分别从以上几个方面对流感病毒实验室检测方法及进展进行综述。【关键词】流感病毒；检测方法Ｌａｂ帅ｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓ狮ｄｐ哪哪艄０ｆｄ咖ｔｉＩｌｇｉＩＩｆｌｕ眦ａｖｉｎ麟Ｕｙ访ｙ獬，ＣＨＥＮ协咒ｇ－讹ｉ，ＵＢｉ恕ｇ．＆加仃批，ｚｆｏ，尺Ｐｓ加ｍ￡ｏ删Ｍ毒ｄ觑九８，＆巧ｉ挖ｇＣＤｍ凇挖ｄ＆咒８ｍ￡Ｈｏｓｐｉ￡ｎＺｏ，ＰＬＡ，＆巧锄ｇ１００７００，吼ｉ御（乃ｒｒ已ｓ户Ｄ行矗ｉ７２９口“腩ｏｒ：（ＨＥ小，Ｈ口ｎｇ一议，Ｐｉ【ＡｂｓｔＩ’ａｃｔ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｅａｎａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｔｈａｔｓｐｒｅａｄｓｅｐｉｄｅｍｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａｉｓｈｉｇｈｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙ．ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｄｅｐｅｎｄｓｏｎｎｏｔｏｎｌｙｃｌｉｎｉｃｉａｌｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｓｉｎｇｓｂｕｔａｌｓｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉａＩｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒａｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｍｍｕｍｏｌｏ—ｇｉｃａｌａｓｓａｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏＩｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｒｅｆｏｕｒｍｅｔｈｏｄｓｔｈａｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｅｄｆｏｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｅｆ０１ｌｏｗｉｎｇｔｅｘｔ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，传染性强，蔓延快，其抗原易变异，对人群尤其是儿童、老年人及机体免疫力低下的人群有较高的发病率及致死率，危害很大。流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中变异大的、危害重的主要是甲型和乙型流感病毒，尤以甲型为主，常可引起较大范围的流行［１］。流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，还需要实验室检测来证实。病毒诊断技术大致分为４个方面，即病毒分离、血清学诊断、现代免疫学诊断及分子生物学诊断瞳］。现分别进行介绍。ｌ病毒分离培养病毒分离培养是诊断流感最可靠的方法之一。因流感病毒能够在鸡胚中良好生长，所以早期多用鸡胚分离流感病毒，一般用９日龄至１１日龄的鸡胚通过羊膜腔或尿囊腔接种分离病毒，接种后２４～９６ｈ收集鸡胚尿囊液，２４ｈ内死亡的鸡胚弃掉，用鸡的红细胞检测尿囊液或细胞培养液的血凝活性来证实病毒的增殖和存在，如初次分离不到病毒，可盲传２代再进行检测；但近年来，随着分子生物学技术的发展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与原始标本有所不同，而通过马一达犬１肾细胞（ＭＤＣＫ）作者单位；１００７００北京军区总院呼吸内科通讯作者：陈杭薇．综述．分离病毒的抗原性与原始标本相似，另外由于ＭＤｃＫ细胞对“ｏ”相毒株的敏感性比鸡胚高很多，故ＭＤＣＫ细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统，现亦得到较为广泛的应用；ＭＤＣＫ分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此病毒分离现同时采用鸡胚及ＭＤＣＫ细胞两套系统口］。但无论是以上哪种方法对标本中病毒采集、运输及保存条件要求均较高，病毒样品如能在４８ｈ分离，可在４℃保存，如果样品要存放较长时间必须低温冻存（一７０℃）；且要求标本中的病毒含量高，必须达到鸡胚或ＭＤＣＫ培养法所需要的病毒含量，分离培养较为复杂、耗时且不稳定，也不能在普通实验室进行，要确诊需要较长时间，故对流感早期诊断及临床指导意义不大。Ｓｈｉｈ等Ｈ３将一种新的实验室培养技术——离心培养技术（ｓｈｅｌｌｖｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＶＣ）应用于流感病毒的培养，其与传统培养方法没有本质的区别，不同点为在标本接种后进行长时间的低速离心，使标本中含病毒的颗粒在外力作用下被压挤吸附于培养细胞，从而大大缩短了培养时间并提高了敏感性。在国内倪安平等口］亦采用ＳＶＣ技术快速诊断流感病毒，结果显示该技术能在２４ｈ内获得流感病毒培养结果，可以快速确诊流感患者。郭元吉等［６３建立了一种流感快速诊断方法，具体为：采集标本经成片ＭＤＣＫ细胞扩增，使细胞表万方数据

中华人民共和国国家标准细菌内毒素检测方法

医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。 4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。四、试验前准备 1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡 4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。 2、鲎试剂灵敏度测定（1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。（2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量

加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。五、试验方法 1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。 2、浸提介质:无热原水。 3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。 4、试验步骤:将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5Eu/ml，供作阳性对热。取10mm×75mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1ml 内毒素工作标准品稀释液，阴性对照管2支各加入0.1ml无热原水，阳性对照管2支各加入0.1ml内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，轻轻取出，观察结果。 5、结果判定 1)、将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。

细胞培养与病毒培养实验步骤

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。二、常用细胞的种类 BHK-21:仓鼠肾传代细胞 PK-15:猪肾传代细胞 IBRS-2:猪肾传代细胞 Hela :人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145:来源于Vero细胞 TK-143:人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9 :昆虫细胞三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21 (baby hamster kidney )细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 5、伪狂犬病病毒液(PRV

四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3 x 105个/ml 2）p H范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度哺乳动物细胞一般为37C 昆虫细胞28-30 C 五、常用细胞分散剂与作用原理 1 、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA :与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。六、营养液 1 、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1 ）血清的种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。用前56°C灭活30min 3）血清的作用

细胞膜毒性检测方法概括

首先，可进行细胞的毒性检测，通过台盼蓝拒染法检测细胞存活率变化，MTT或WST法检测细胞的活力。其次，细胞功能的正常有赖于膜结构的完整及膜特性的保持，所以通过以下方法检测某种物质对细胞膜的毒性 1.细胞膜通透性的变化：乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）广泛存在于生物细胞内，是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可泄漏至细胞外介质中。泄漏出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I 变成还原型辅酶I，通过测定NADH在340 nm处吸光度增加的速度可求得乳酸脱氢酶的活力，从而得到细胞膜是否损伤的结果。国外有通过试剂盒检测腺苷酸激酶的释放以及通过共聚焦激光扫描显微镜检测碘化丙啶的吸收量。检测膜胆固醇采用邻苯二甲醛比色法。测定波长为510 nm，按照试剂盒说明检测。 2.可通过透射电镜观察细胞膜结构及以PI为荧光染料检测核膜完整性，现在更有利用原子力学显微镜（AFM）观察细胞的形态结构及比较细胞表面粘弹力的变化，比较药物对细胞膜作用前后的膜表面结构变化。利用AFM的力曲线得到能表明机械性能参数的粘弹力来分析比较未作用药和作用药后的细胞，一般，作用药组细胞其弹性小于未作用药细胞。 3.细胞膜表面整合素的变化：

整合素是一类广泛存在于细胞表面的糖蛋白，由α和β两个亚基以非共价键连接的异二聚体，目前发现由19种α亚基和8种β亚基以不同方式组合形成24种整合素亚型。用流式细胞仪检测细胞表面整合素(integrinpl)的表达(平均荧光强度） 4.Western blot检测细胞骨架蛋白F-actin和Tubulin-β 细胞骨架是由蛋白质纤维构成的胞内网络，相当于细胞的骨骼，支持着整个细胞，它紧贴在细胞膜下，赋予细胞一定的形状,对细胞及细胞器的运动也起着至关重要的作用。应用流式细胞仪检测细胞内F-actin和tubulin-β蛋白表达的情况（通过平均荧光强度来体现）。一般，药物作用后，使细胞内的钙离子浓度升高，引起一定的信号转导，破坏actin网络，使F-actin解聚，影响到细胞骨架结构对细胞形态的支持作用，造成细胞收缩，形态异常，细胞连接松散，易脱落，细胞生长稀疏，故在倒置荧光下观察药物作用后，细胞数目明显减少。 5.细胞膜Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP酶活性的测定按照试剂盒的方法进行，测定Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP 酶活性。 6.细胞膜膜电位的变化：DIBAC4(3)为膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料,利用它可以快速检测膜电位的动态变化，且不损伤细胞。当DIBAC4(3)进入细胞内增多，荧光增强，表明细胞膜电位负值减小，出现去极化变化；反之，荧光减弱，表明细胞膜电位负值增大，出现超级化变化细胞的去极化与细胞损伤密切相关，造成大量Na+内流,K+外流，细胞内呈高钠低钾状态，细胞膜皱缩。

病毒鉴定的方法有哪些

病毒鉴定的方法有哪些？从培养的细胞中分离病毒，然后采用免疫荧光和分子生物学技术进行病毒核酸检测已被成功地用于病毒的鉴定。目前最常用的病毒定量检测方法有以下三大类：用于病毒感染力检测的技术，如病毒空斑形成试验，半数组织培养感染剂量TCID50测定和免疫荧光等；病毒核酸和病毒蛋白检测技术，如实时定量多聚酶链反应（qPCR），免疫印迹，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定（ELISA）和血凝试验等；还有就是那些直接对病毒颗粒进行计数的方法，如流式细胞分析或透射电镜技术。病毒检测方法的局限性病毒鉴定方法 1.培养细胞的显微学观察材料和仪器细胞生长培养基：含10% FBS(胎牛血清), 4-6 mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等维持培养基：上述新鲜的细胞培养基，但血清FBS浓度减少至为2% 宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamber slides） PBS磷酸缓冲液 Bouin's固定液吉姆萨（Giemsa）缓冲液吉姆萨（Giemsa）染色液丙酮，丙酮：二甲苯（2:1），丙酮：二甲苯（1:2），二甲苯中性树胶移液枪头(10 到100 微升) 移液管生物安全柜（超净台）二氧化碳培养箱倒置显微镜

实验方案接种宿主细胞至Chamber Slides：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔Chamber Slides，接种30,000细胞/孔），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamber slides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。制备不同稀释度的病毒液：标记6支无菌离心管，第1管加入990 μl细胞生长培养基，剩下5管加入900μl细胞生长培养基。按以下方法进行梯度稀释：在第1管中加入10 μl 病毒原液（稀释度1:100）充分混匀，然后从第1管吸100 μl至第2管中混匀，依次类推，进行10倍梯度稀释。管1至管6的稀释度分别为10-3 到10-7。感染细胞：吸去培养孔中的培养液，每孔加入0.5 mL维持培养液（2%FBS-DMEM），再加入100 μl不同稀释度（10-2 至10-7稀释）的病毒液至其中一孔，留一孔不加作为空白对照。将细胞置二氧化碳培养箱37oC 或34oC 培养1-4周，追踪观察致细胞病变效应（CPE）发生情况。吉姆萨染色：一旦观察到细胞病变效应，轻轻地用PBS将细胞洗3次，每次5min，然后加入Bouin's固定液固定10 min。用吉姆萨缓冲液洗3次，然和加入Giemsa染液染色1 h，再用吉姆萨缓冲液清洗后依次用丙酮处理15s，2:1的丙酮-二甲苯处理30s，1:2的丙酮-二甲苯处理30s，最后用二甲苯处理10 min紧接着用中性树胶封片。显微镜下观察CPE，包涵体，细胞融合及病毒空泡形成情况。病毒感染细胞后形成的CPE图片范例可以在很多图谱，网站和博客上找到，例如ASM Microbe Library 2.免疫荧光(IF)检测方法材料和仪器细胞生长培养基：含10%FBS(胎牛血清), 4-6mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamber slides） PBS磷酸缓冲液一抗 FITC标记的二抗细胞核染料DAPI 5-4 %多聚甲醛（PFA，pH7.4），或者甲醇移液枪头(10 到100 微升) 离心管生物安全柜（超净台）二氧化碳培养箱荧光显微镜实验方案接种宿主细胞至Chamber Slides：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔Chamber Slides，接种30,000细胞/孔），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamber slides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。病毒感染：每孔细胞加0.1 mL病毒储存液，留一孔不加作为阴性对照。将细胞放回CO2 培养箱，37°C 或34°C 培养48h。