现代仪器分析论文

高效液相色谱仪及其在不同中药制剂质量标准中的应用

中药化学与分析宗阳20141576

摘要本文主要介绍高效液相色谱仪的主要构成、目前比较好的几种仪器的品牌的对比和高效液相色谱在中药质量标准中的应用以及高效液相色谱仪器的使用和维护。

关键词：高效液相(HPLC)；中药质量标准；中药制剂；维护与保养。

前言

随着中医药事业的不断发展与创新，很多中药制剂都面临着质量和不合格的危机以及能否走出国门的疑问。我们的传统中医药手段很难解决中药制剂的质量检测，通过学习西方的先进技术我们引进了高效液相技术，由此我们不但可以与国际先进医疗手段和制药标准接轨而且还可以有效的降低中药制剂产生的毒副作用。将高效液相色谱应用到中药质量标准当中是非常必要的，这将对中药的发展起到很大的作用。

1.基本原理以及仪器构成和类型

1.1基本原理

高效液相色谱仪它是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术而发展起来的。在高效液相色谱中，流动相与组分之间有一定的亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关，一般情况下，高效液相色谱仪的分析可在室温下进行，由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相黏度高，因此必须采用高入口压，以此来维持一定的流动相线速。高效液相色谱仪对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的物质特别有利，它在医药、生化等方面具有非常重要的作用。[1]

1.2仪器组成

图1

高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处

理系统等五大部分组成（图1）。分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。[2]当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。

1.3仪器类型

目前常见的HPLC仪器生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司、SHIMADZU 公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。[3]

2.高效液相色谱在不同中药制剂质量标准中的应用

2.1中药制剂

中药制剂是任何药物供临床使用之前都必须制成适合于医疗或预防应用的形式，称为剂型，例如片剂、注射剂、气雾剂、丸剂、散剂、膏剂等。剂型是集体名词，一般是指制剂的类别，剂型中的任何一个具体品种，例如片剂中的元胡止痛片、注射剂中的止喘灵注射液、丸剂中的香砂六君子丸等叫做制剂。[4]

2.2中药质量标准

中药的质量标准主要包括：鉴别、检查、含量测定，其中在含量测定这块主要用到了高效液相色谱的方法。

含量测定包括：专属性考察、线性关系、稳定性、精密度、回收率和样品回收率。这几个测定项目中都是根据样品或者标准品进入高效液相后得出峰面积或者保留时间等一些分析化学中相关的含量测定的数据来计算样品与标准品的含量区别，由此可以得出是否符合药典的标准。[5]

2.3不同中药制剂中使用高效液相的文献研究

2.3.1颗粒剂

抗敏颗粒剂是由黄芩、当归、桂枝等药组成。具有补气固表、清热、养血之功效，临床用于治疗变态反应性疾病获得了较好的疗效。对当归、桂枝进行了定性鉴别，并以高效液相色谱法测定黄芩中黄芩苷的含量，结果显示，方法可靠，重复性强，可作为质量控制的定量指标。[6]

2.3.2散剂

凹凸棒石散剂采用采用HPLC法测定制剂吸附前后士的宁溶液浓度,由其变化值求出其吸附力,凹凸棒石约吸附4.40mg.g-1士的宁,每袋凹凸棒石散剂中凹凸棒石含量3.0±0.3g。实验结果表明,该方法简便、准确,是凹凸棒石散剂质量标准可控可行的方法。[7]

2.3.3胶囊剂

立柴桂安神胶囊采用HPLC法对处方中主要成分阿魏酸进行含量测定。结果: 在TLC 色谱中，待检测药材斑点清晰，与其他成分分离度好; 阿魏酸在0. 03μg ～ 0. 5μg 范围呈良好的线性关系，r = 0. 998，平均回收率100. 27% ，RSD 为0. 89% 。结论:所建立的方法可靠准确地进行定性、定量检测，可用于该制剂

的质量控制。[8]

2.3.4合剂

小儿镇咳合剂采用HPLC法对处方中主要成分氯化铵含量测定。平均回收率=1.002％，RSD=0.27％，平均含量,4.02％，该质量标准操作可行，可用于控制小儿镇咳合剂质量。[9]

2.3.5酒剂

通过对芦荟酒剂的物理性状、含醇全、总固体釜、有毒物质限量、部分药材的薄层鉴别以及有效成分的含量测定制定了芦荟酒剂的质量标准,实验结果表明,芦荟酒安全无毒,其有效成分芦荟大黄素的含量每毫升不得少于0.0270mg,并对所测方法的德定性、精密度、重现性、回收率进行考察,认为其标准用于酒剂的质量控制是可行的。[10]

2.3.6喷雾剂

建立鼻炎灵喷雾剂的质量标准。方法采用高效液相色谱法测定麻黄中盐酸麻黄碱的含量,采用薄层色谱法对麻黄、防风进行定性鉴别。结果盐酸麻黄碱含量在7.1~28.2μg·ml-1,呈良好的线性关系,平均回收率为99.19%，RSD为2.34%;以薄层色谱法对麻黄、防风进行专属定性分析。结论建立的方法可准确地进行定性、定量检测,重复性好,可作为鼻炎灵喷雾剂的质量控制。[11]

2.3.7注射剂

建立检测丹红注射液中有效部位含量的方法，并考察丹红注射液质量标准及其稳定性。方法丹红注射液中黄酮定量应用紫外可见分光光度法，以芦丁为标准品定量，检测波长506 nm；采用pH 计法和沉淀法对注射液进行pH，鞣质、蛋白质、草酸盐、抗氧化试验和稳定性试验。结果芦丁在0.021~0.103 mg/mL范围内，浓度与吸光度成良好线性关系，r = 0.9999，平均回收率100.46%，RSD 为1.20%。6 批注射液中总黄酮的含量分别9.68、9.85、9.58、11.80、10.42、11.67 mg/mL，pH 5.62～5.83，鞣质、蛋白质、草酸盐含量都符合药典规定。结论本实验方法操作简单，结果准确，可为丹红注射液的质量控制提供参考。[12]

3.高效液相色谱仪的管理与使用维护

化学实验中心在液相色谱仪的管理上，要求所有用户在使用仪器前必须仔细阅读操作流程，按具体要求进行操作。本科生一律在指导教师的陪同下方可使用，不得单独操作。

3.1 流动相

1) 所用流动相必须经0. 45 μm 微孔滤膜真空抽滤2 ～ 3 次，然后用超声仪超声45 ～ 60 min 后，方可作为流动相使用［13］。

2) 甲醇、乙腈等有机溶剂必须为色谱纯，当用酸或者碱来调节流动相pH 值时，范围一定不能超过2 ～ 7. 5。水则必须为去离子水，使用期限不得超过2 d，逾期则要重新配制。

3) 流动相瓶口不准用密封带封死，以保证内外压力相等。不要随便更换流动相接口，A 瓶( 棕色) 固定为水，B 瓶( 白色) 固定为甲醇或乙腈; 流动相的流速不要超过3.0mL /min。

4) 流动相禁止使用氯仿、三氯( 代) 苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等; 慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、丙酮、甲基环己胺等，以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。

5) 当有缓冲盐做流动相时，缓冲溶液与有机溶剂互相转换前一定要用5 甲醇清

洗泵，防止盐在有机相中结晶损坏泵中各组件。缓冲溶液的浓度不能高于0. 5 mol /L，尽量不超过该色谱柱的pH范围。Cl-1的浓度要小于0. 1 mol /L( 防止腐蚀流路) 。高浓度的缓冲盐会缩短密封垫和活塞的使用寿命，长时间使用0. 1 mol 或更高浓度的缓冲液时，必须用10 异丙醇溶液从泵的背面冲洗掉所有可能存在的结晶，从而保护柱塞杆和密封垫。用后的异丙醇经0. 45 μm( 或0. 22 μm) 滤膜过滤后可反复使用2 ～ 3 次［14-15］。

6) 当泵的压力上限超过6 000 psi 时，应及时检查和更换泵头过滤白头和保护柱芯。

3.2 排气泡

1) 当拧松快速清洗阀时不宜拧得过松，一般拧松2 圈左右即可，拧得过松流动相容易从清洗阀部位流进泵头中引起报警。

2) 使用快速清洗阀时，只能一个一个通道地排气泡，不得将几个通道同时按比例排气泡，因为比例阀的快速切换易导致损坏。

3.3 自动进样器

建议用甲醇∶水= 1∶ 1 的溶液洗针，同时每天洗针前要检查一下洗针瓶中是否有洗液( 50％甲醇) 。

在进样针头为塑料时使用预切缝的隔垫是为了避免在连续进样中产生真空，进样针使用钢针头时则不必使用预切缝的隔垫。使用水作称量介质，是因为水的密度在室温 20～25℃范围内体积变化很小。称量时应使用万分之一或者十万分之一的电子天平。如果进样体积小于 50 μL，进样次数至少要大于 10 次。[16]

3.4 样品处理

测定的样品或标样在流动相中一定要易溶，否则进样后会结晶造成定量不准确或堵塞色谱柱。最好使用流动相溶解样品，样品和标准溶液在进样前必须用0.

45 μm( 或0. 22 μm) 滤膜( 有机膜或者水膜) 过滤，除去微粒杂质; 样品中一般不得含有盐类及强酸、强碱性等物质。可以使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质［17］。

3.5 色谱柱

使用自带色谱柱，则应把换下的色谱柱用堵头( 无孔) 及时密封。用完后需把实验室原来的色谱柱安装好。换柱必须在有流动相流出的情况下进行，以免空气进入色谱柱。仪器长时间不用，每个泵通道和整个流路一定要用甲醇冲洗后保存，以免结晶或造成污染[18]。

3.6 检测器

1) 检测器的紫外或可见灯在长期打开的情况下，一定要保证有溶液流经检测池。若不需要做样，可设置一个较低的流速( 如0.05 mL /min) 或关闭灯的电源。2) 检测器的灯一般要在流通池有溶液连续流动几分钟后才打开，如果流动池中有气泡，则会提示漂移过大无法通过自检和校正。

3) 检测器的氘灯或钨灯不要经常开关，每开关一次灯的寿命约损失30 h。若仪器经常使用，可几天开关灯一次。

4) 清洗检测池时可以在不接柱子的情况下，用100 ％异丙醇冲洗整个流路。如

果还不行，同法用10 ％或5％的稀硝酸冲洗，大约45 ～ 60 min，最后用水冲干净。[19]

3.7 实验结束

1) 实验完毕立即清理操作台面，打扫室内卫生，拖干净地面，关好门窗。

2) 如实做好实验登记。若机器出现异常，请勿擅自拆开机器，应及时通知仪器管理人员。使用液相色谱仪需提前预约，每次使用不准超过3d，如继续使用则应再次进行网上预约。

4.讨论

随着中药行业不断发展，高效液相色谱越来越受广大实验室的推崇和关注，中药质量标准的建立更加要借助于它的帮助。如何合理使用好一台高效液相是对于一个科研工作者的基本要求，合理的操作、细心地处理、耐心的等待这样不但实验会成功，仪器的寿命也会大大提高而且还会省去很大一部分实验经费和不必要的损失。高效液相色谱仪是现代科学研究中广泛使用的分析仪器, 但我们必须学会正确的使用和维护, 才能更好的驾驭它, 让 HPLC 技术在医学领域发挥更大的作用。[20]

本论文在阐述了高效液相的基本原理及其在中药制剂的质量标准中的应用，着重介绍了实验中使用高效液相时需要注意的实验环节，希望广大读者可以引以为鉴。

参考文献

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