沙门菌检测技术

沙门菌为常见的肠道病原菌之一，在自然界分布广泛，种类繁多，所致疾病统称沙门菌感染，其中由伤寒、副伤寒沙门菌引起的急性全身系统性传染病是我国《传染病防治法》中规定报告的乙类传染病，而由非伤寒沙门菌引起的食物中毒则占我国内陆地区细菌性食物中毒的首位。

及时准确地检验沙门菌，为诊断和控制由该菌引起的疾病提供依据。沙门菌检验程序主要包括：标本采集、标本的处理与接种、菌株分离与鉴定和PCR检测几个步骤。

标本采集

标本采集前，应准备好所需的培养基和器材，主要有：血液需氧培养瓶、血琼脂平板、XLD（木糖赖氨酸脱氧胆盐）琼脂平板、BS（亚硫酸铋）琼脂平板、SC（亚硒酸盐胱氨酸）增菌液、酒精灯、采样瓶、剪刀、镊子等。

沙门菌检验标本主要分为：食品样品、可疑食物中毒标本，沙门菌患者标本。

可疑食物中毒标本主要有：可疑食品、相关环境标本、疑似病人标本。

可疑食品的采集：在采集可疑食物中毒标本时，应重点采集剩余食物以及食品加工有关的炊事用具，操作人员的手、肛试等相关环境标本。采样时，用棉试子涂抹物品表面后，置于少量增菌培养基内，也可根据情况在接种现场接种分离平板。

沙门菌感染患者标本的采集：沙门菌感染患者应采集新鲜粪便标本或肛试子直接接种分离平板和增菌液。对伤寒、副伤寒患者，在病程的第1~2周，可采集静脉血液4~8ml，接种血液需氧培养瓶中。

每个标本需做好标识和记录，采集的食品样品4℃保存，已接种标本的增菌液和培养基，室温下保存，2小时内送达实验室。

标本的处理与接种

沙门菌标本的处理与接种常用培养基有：TTB（四硫磺酸钠）增菌液、SC(亚硒酸盐胱氨酸)增菌液、XLD琼脂平板、BS琼脂平板和麦康凯（MaC）琼脂平板。

可疑中毒食品标本的处理：对采集的标本通常按1:10的比例分别接种于100mlTTB和100ml增菌液中，每瓶增菌液加入标本约10g，同时还可将可疑中毒食品标本直接接种于分离平板。将接种后的TTB增菌液置42℃培养箱中培养18~24小时，将SC增菌液和分离平板置37℃培养箱中培养18~24小时，待观察。取培养后增菌液转种XLD琼脂平板和BS琼脂平板，将接种后的平板置37℃培养箱中培养24~48小时，待观察。

血液（骨髓）标本的处理：将已接种标本的血液培养瓶直接放置37℃培养箱中培养7天，在培养期间分别于培养的第1天、第2天和第7天取培养液一环接种血琼脂平板，将平板置37℃培养箱中培养18~24小时，待观察。培养至第7天时，如培养物仍无菌生长，则可判为阴性。

肛试子及其他环境标本的处理：将现场采集已接种标本的分离平板和增菌液直接放置37℃培养箱中培养18~24小时，待观察。取出18~24小时培养的增菌液转种XLD琼脂平板和麦康凯琼脂平板。将接种完毕的平板置37℃培养箱中培养18~24小时，待观察。

菌株分离与鉴定

主要实验试剂有：氧化酶（试剂）、三糖铁（TSI）、动力—靛基质—尿素半固体（MIU）和赖氨酸铁琼脂斜面、API20E、沙门菌诊断血清。

沙门菌菌株的鉴定主要试验有：菌体形态观察，菌落形态观察，氧化酶实验，初步生化鉴定（系统生化鉴定），血清学分型。

菌落形态观察：在XLD平板上沙门菌菌落呈粉红色、光滑、湿润、边缘整齐、产H2S 的菌株，可形成中心黑色或全部黑色的菌落。在BS琼脂平板上，沙门菌菌落呈黑色有金属光泽、棕色或灰色，培养基周围可呈现黑色或棕色，有些菌株可形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。在麦康凯琼脂平板上，沙门菌菌落为无色、透明或半透明、光滑湿润、边缘整齐、

圆形。从分离平板上挑取3-5个可以菌落，分别接种XLD平板和营养琼脂平板，将接种完毕的平板置37℃培养箱中，18~24小时纯化培养。

菌体形态观察：挑取纯培养物进行革兰染色，在显微镜下观察菌体形态。沙门菌为革兰阴性杆菌，长1-3um，宽0.5~1um，无芽胞，两端钝圆。

氧化酶试验：用一次性接种环（或牙签）挑取菌落于滤纸上，滴加氧化酶试剂一滴，在10s内菌落不变色为阴性，呈现紫色者为阳性。本试验菌落不变色，氧化酶试验为阴性：初步生化鉴定：将菌落形态和氧化酶试验符合沙门菌特征的纯培养物分别接种于三糖铁琼脂斜面（TSI）、MIU培养基、赖氨酸铁琼脂斜面，将已接种的生化培养基置37℃培养箱中，培养18~24小时，待观察。

典型的沙门菌在三糖铁（TSI）上，斜面呈红色，下层产酸呈黄色，多数沙门菌产生硫化氢，试管内出现黑色，有气泡。

赖氨酸脱羧酶试验阳性，培养基由紫色变成紫黑色。

在MIU培养基上尿素为阴性培养基不变色，有动力，沿穿刺线浑浊生长，加入靛基质试剂0.5ml于试管内，轻摇试管，沙门菌靛基质试验结果不定。本试验靛基质试验为阴性，试剂不变色。

系统生化鉴定：肠杆菌科细菌在生化反应上有类似之处，对初步生化试验符合沙门菌的可疑菌株需要进一步做系统的生化鉴定。生化试剂可采用自配或市售成品，也可选用生化鉴定试剂盒（API 20E）或全自动微生物鉴定系统（VITEK）。本试验以API 20E生化鉴定试剂盒进行示范，具体操作步骤如下：

菌悬液制备：挑取24小时培养的营养琼脂平板上1~2个菌落至5ml灭菌生理盐水中制成均匀的菌悬液。

接种与培养：将配制好的菌悬液按产品说明书要求填充API 20E条上的小杯，按要求加盖矿物油，置于36℃培养箱中培养18~24小时，待观察。

结果观察与判定：按照说明书要求，在读取结果前，部分试验先添加附加试剂。根据API 20E中的读数表判定和记录各项反应结果，并得到一个7位数的编码，通过在数据库或API编码表中查询该编码即可获得菌株鉴定结果。

血清学分型：对生化鉴定为沙门菌的菌株，需用玻片凝集法进行血清学分型，血清学分型试验的主要步骤为：先用A-F多价血清作玻片凝集，若血清发生凝集再分别选用O4 O9 O2 O10 O7等因子血清做玻片凝集，以判定其群别。根据判定的O抗原，进行H抗原的第一相和第二相抗原凝集和判定，下面以某品牌血清为例进行试验。

第一步，O抗原凝集，分别取一环A~F血清和生理盐水于洁净的载玻片上，挑取待检菌株新鲜培养物适量，研成乳状，倾斜摇动玻片1分钟，观察血清凝集情况。若血清产生凝集颗粒盐水无颗粒者判为阳性；两者均无凝集颗粒产生，判为阴性；盐水有颗粒者为粗糙型菌株，不能分型。本菌株结果为阳性。

第二步，取一环O4血清于洁净的载玻片上，用与上述相同的方法试验，结果若为阳性，进行H因子血清凝集试验；若结果为阴性，再分别选用O9 O2 O10 O7等因子血清进行玻片凝集试验。本菌株O4为阳性。

第三步，H抗原凝集，在沙门菌抗原表中，选择与O4相对应的H因子的第一相和第二相单因子血清作逐一凝集试验。本次实验结果被检沙门菌的抗原式为1,4,5，12：i：1,2 为鼠伤寒沙门菌。

血清凝集试验中几种特殊情况：

1.Vi抗原的判定：伤寒或丙型副伤寒沙门菌的Vi抗原能阻碍O抗原凝集，含丰富Vi 抗原的伤寒菌株，经煮沸破坏Vi抗原，再与O血清凝集。实验方法为，取适量菌苔于1ml 生理盐水中，在酒精灯火焰上煮沸后再与O血清凝集，若仍不凝集，可送上级单位鉴定。

2.位相诱导法试验：如双相菌只检出一相H抗原时，可用位相诱导的方法获得另一相抗原。位相诱导方法较多，主要有，小玻璃管法、小倒管法、简易平板法。本篇着重介绍简易平板法。将0.7%~0.8%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取已知相因子血清一环滴在半固体琼脂平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点接种待检菌株，36℃培养18~24小时后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌做凝集试验。

3.H抗原不凝集：如果两相H抗原均不出现，则应通过半固体琼脂平板、血平板等琼脂平板传代法获得某相或两相抗原

PCR检验

在沙门菌的检测工作中，常利用PCR技术来做沙门菌检测的初筛实验，以提高工作效率，降低成本。PCR初筛试验采用检测样品增菌液中是否有沙门菌属侵袭性抗原保守基因（invA 基因）的存在，以此来判定是否有沙门菌的存在。PCR反应条件，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环72℃延伸7min。

用凝胶成像系统观察结果时，如在284bp处出现扩增条带，则为阳性，凡是PCR检测呈阳性结果的标本，均应进行沙门菌病原菌的检测。

注意事项

在沙门菌检验过程中，应注意以下问题。

1.试验应在BSL-2生物安全实验室的二级生物安全柜中进行操作，并做好个人的安全防护工作。

2.在生化初筛试验中应特别注意，只有在三糖铁琼脂斜面和底层均产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株或尿素酶阳性的菌株可以排除，其他的反应进行进一步的试验确证。

3.沙门菌的鉴定和血清学分型试验必须使用纯化菌株。

4.BS琼脂平板要求的培养观察时间为48小时，此时才能形成描述的典型菌落。