原代细胞培养和死活细胞鉴别血球计数实验SOP
原代细胞的培养与鉴定标准操作流程（SOP）
一、【实验目的】
1.了解原代细胞培养的基本方法及操作过程（此处以动物小鼠为例）。
2.学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。
3.了解细胞损伤的过程及死活细胞的鉴定方法。
二、【实验原理】
(一) 细胞原代培养
原代细胞培养是指直接从动物或者人体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
(二) 细胞死活鉴定
在显微镜下活细胞细胞膜完整、立体感强，胞质透明度好，颗粒状物质少；死细胞膜破裂，无立体感，细胞通透性差，有颗粒状物质、空泡。
培养好的细胞培养液颜色呈土黄色，透明度好，不浑浊，发亮，有浑浊可能是污染初期或细胞太多。
染色排除法是生物研究中判断细胞活性的一种常用方法，简便，易于操作实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。原理：因为活细胞的细胞膜具有选择透过性，细胞不需要的物质通常不能进入细胞，染色剂中如台盼蓝就不能进入细胞，因此用该染色剂处理细胞后，细胞不会被染色，由于死细胞的细胞膜是全透性的，因此台盼蓝能进入死细胞，从而可以使死细胞染色。依此染色便可以判断细胞的活性。
活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。常见的
细胞燃料有：中性红、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯等。台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞，从而与解体的DNA结合，使其着色，因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。通过显微镜很容易就能识别出死亡被染色的细胞，并可用细胞计数板进行计数。伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。伊红在很多生物技术中都有应用。伊红有自发荧光特性。悬液中细胞的精确计数，往往采用血细胞计数器。
荧光排除法生活力强的细胞能发出强烈的黄绿色荧光；生活力的细胞发出荧光也较弱；死亡细胞无荧光。
三、【实验器材】
解剖剪，解剖镊，棉球，培养皿，酒精灯，75%酒精，移液枪，无菌操作台，培养箱，正置光学显微镜，倒置光学显微镜，吸管，解剖盘，滴管，离心管，离心机，注射器，塑料培养皿，载玻片，盖玻片，血细胞计数板等。
四、【实验材料】
小鼠1只，细胞培养液（含生长因子），Trypen Blue染液，PBS缓冲液等五、【实验步骤】
(一) 细胞的原代培养
1. 取材：
取小鼠一只，采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出转入超净工作台内的解剖盘中，无菌操作打开腹腔，取出其脾脏，除去其周围的脂肪组织，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，转入无菌培养皿中待用。
2. 分离脾细胞：
用滴管向培养皿中注入30滴PBS缓冲液，再用’L’型针头注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾脏，注射时沿长轴注射。然后再用针头在脾脏上扎眼，并用’L’型针头轻轻刮出脾细胞。在均匀吹匀脾脏细胞。
吸取上述分离的单个脾细胞悬液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min 离心5min。
3. 培养脾细胞：
取塑料培养皿一套，用移液枪吸取培养液2mL加入塑料皿中，并将皿标记待
用。取离心后的Eppendorf管，弃去上清液，用移液枪（200ul）吸取塑料皿中的培养液400ul加入弃去上清的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料皿中，混匀后放入37°C，5%CO2的培养箱中培养。
(二) 细胞死活鉴定及计数
1. 试剂配制：用生理盐水配成4%Tyrpen Blue染液，备用。使用液是0.4%Tyrpen Blue浓度。
2. 染色计数：
取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，将染液：细胞按1:9加入。混合。2min 后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况。
3. 计数：
在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板
的中间方格四角和中间5个小方格的细胞数量。包括
细胞总数与死细胞数量。压线者计上不计下，计左不
计右。
4. 计算细胞活力：
根据公式：
活细胞率（%）={（细胞总数—死细胞数）\细胞总数}*100%
六、【实验结果】
Tyrpen Blue染液，活细胞不会被染色而呈无色，死细胞会被其染色而呈蓝色。
分别计算结果：
数目
死细胞（个/ml）
活细胞（个/ml）
活细胞率（%）
死细胞率（%）
细胞活力（%）
七、【注意事项】
1、严格进行动物消毒，需用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
3、吸取液体前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液体时，避免碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。
八、【分析总结】
染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活力骤降。
原代细胞的培养与建系
原代细胞的培养与建系(一) 细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术，才可能更快捷地学习和掌握其他方法，本章重点叙述常用的基本技术。 第一节原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下： 一、取材的基本要求 （1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 （2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。 （3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。 （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。 二、各类组织的取材技术
原代细胞培养与分离
原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘
米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，
巨噬细胞的原代培养
1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。 2试验材料 昆明种小鼠10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡1只 PRMI1640培养基 新生小牛血清 HEPES D-Hanks液 青霉素 链霉素 3试验仪器 无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。 二氧化碳培养箱 生物显微镜 高速冷冻离心机 低温冰箱 4实验步骤 4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法: 将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。 鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。 培养液的无菌处理： (1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。 (2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4℃冰箱中备用。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
原代细胞培养实验(药理)
一.细胞培养的基本原理 细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。如心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%;而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95%以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程;用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象;还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。此外，还能节约研究费用。如在某些研究中，用100只动物做实验所获得结论与用100张盖玻片或几十个培养瓶而获得结论具有相同的统计学意义，而细胞培养较之大批量的动物饲养花费要小。 但细胞培养方法也存在不足之处：培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。 二.细胞培养的基本设备与用品 (1)细胞培养的基本设备 细胞培养的基本设备有：CO2培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸馏器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。 (2)常用的实验用品 1.玻璃器皿 细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶[有12.5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积(平方厘米)表示];培养皿(直径有3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格);离心管(5毫升，10毫升);注射器(1毫升，5毫升等);用生理盐水瓶代替的贮存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它还有尖吸管和移液管，载玻片(厚度0.8～1.2毫米)，盖玻片(厚度0.12毫米)，贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸馏水瓶，冷冻管(1.5毫升，2毫升)等。
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
实验报告-细胞原代培养实验
细胞生物学实验报告 实验三细胞原代培养 1引言 1.1 实验目的 1. 理解细胞原代培养原理。 2. 了解细胞原代培养的应用。 3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。 4. 巩固无菌操作技术。 1.2 实验原理 细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 2实验仪器、试剂及操作步骤 2.1 实验仪器 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒 （头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等 2.2 实验试剂 DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等 2.3 实验材料 动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚 2.4 实验步骤 A.鸡胚成纤维细胞的原代培养 1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。 2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。 3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。 4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。 5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋 壳。 6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。 7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。 8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。 9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。 10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组 织块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块。 11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将接种组织块的培养瓶面朝上在
小鼠成纤维细胞原代培养.docx
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶
《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
实验四乳鼠肺细胞原代培养
实验四乳鼠肺细胞原代培养 一、实验目的 1.了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。 2.学习细胞消化、细胞计数方法。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。 三、实验用品 1.设备 培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、恒温水浴箱、离心机等。 CO 2 2.器材 眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃漏斗、量筒、移液管、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养皿等。 上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，15磅灭菌30min。此外，还需显微镜、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球等。 3.试剂 （1）D-Hanks平衡盐溶液：即无钙、镁离子的Hanks液。 （2）细胞消化液：％胰蛋白酶液（胰蛋白干粉，加D-Hanks平衡盐溶液100mL，溶解后过滤除菌，调pH值） 溶液。 （3）％NaHCO 3 （4）RPMI1640培养液。 以上溶液均经适当包装，除菌后备用。此外，还需胎牛血清和1000U/mL的青、链霉素液（双抗）。在RPMI1640培养液中加入10%胎牛血清，1%双抗，即成细胞培养液。 4.仪器药品 以3-5人为一个小组，每组需备：乳鼠一只；眼科剪、眼科镊各两把；90mm玻璃培养皿3个，用以清洗组织块；50mL离心管1个；5mL、10mL移液管各5支；35mm培养皿1个。 四、材料 出生后2-3天的乳鼠。 五、实验步骤 1.清洗与消毒 操作者首先进行手的清洗与消毒。 2.处死动物 新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟，置平皿中。 3.取肺 左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。用眼科聂取出肺，置于盛有Hanks液（含有200U/ml青链霉素）的玻璃平皿中，冲洗去血。 4.剪肺 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的Hanks液冲洗1遍。用弯头眼科剪，将肾剪成1mm3大小的组织块，大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤2-3次，直到液体澄清为止。 5.消化及分散组织块 将上步清洗过的Hank液吸掉，按组织块体积的5-6倍量加入消化液。转入50mL离心管，置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20-40min左右。每隔10min摇动一次，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养 [实验材料] 9～10日龄鸡胚,Hank"s液50mL,0.5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(内含犊牛血清1mL,双抗0.2mL,pH7.2),O.25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL,手术剪,镊子,灭菌的培养皿,50mL三角瓶,滴管若干,链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用),高压灭菌塞子若干,培养盘,蛋座,95％酒精,水浴锅。 [实验内容及操作程序] 1.配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素,使其含量为青霉素100IU/mL,链霉素100μg/mL,用7％NaHC03调整pH至7.2～7.4,将胰蛋白酶调整 pH7.6(玫瑰红色)。置37℃水浴锅中预热备用。 2、取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上,用碘酊消毒气室,以镊子击破卵壳并弃之,撕破卵膜揭之,继撕破绒尿膜、羊膜,取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏,用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液,移人灭菌三角瓶中,用灭菌剪刀剪碎鸡胚,使成为约1mm3大小的碎块,加5mL H液轻摇,静止1～2min,使其组织块下沉。吸去上层悬液,依同法再洗2次,至上悬液不混浊为止,吸干H液留组织。 3.消化自水浴锅内取出预热的胰酶,按组织块量约3～5倍加入三角瓶中,1个鸡胚约需5mL胰酶,三角瓶上加塞,以免CO2挥发及污染。37℃水浴约20min左右,每隔5min轻轻摇动1次,由于胰酶作用,使细胞与细胞之间的氨基与羧基游离,待液体变混而稍稠,此就是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时,则需中止
消化,如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长,如果消化不够,则细胞不 易分散。 4.洗涤取出三角瓶后静置1min,让组织块下沉后,吸去胰酶液,用10mL Hank"s 液反复轻洗3次,以洗去胰酶,吸干上清液,留组织块。 5.吹打加2mL含血清的0.5％水解乳蛋白营养液或:MEM培养液,以粗口吸管反复吹吸数次,使细胞分散,此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min,使未冲散的组织块下沉后,小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中,此液细胞数约50万～70万/mL。如需大量细胞,可继续加营养液冲打,一个鸡胚约可做 100mL细胞悬液。 6.细胞计数取上述细胞悬液0.5mL加入0.1％结晶紫一柠檬酸(0、1mol/L)溶液2mL,置室温或37℃温箱中5～10min,充分振动混合后,用毛细管吸取滴人血细胞计数板内,在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法,计算四角大格内完整细胞的总数。如3～5个聚集在一起,则按1个计算,然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。 细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数 例如:4大格的细胞总数为284个,而稀释倍数为5(0.5mL染色液),则每毫升细胞悬液的细胞数为284/4×10 000×5=3.5×104个。 7.稀释按照每毫升50万～70万个细胞密度的标准,将细胞悬液用营养液稀释之。(计数时,可见到大部分细胞完整分散,3～5个细胞成堆,且细胞碎片很少,说明消化适度;如分散细胞少,则消化不够;如细胞碎片多,则消化过度。)
原代细胞培养：原代肝细胞
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。
原代细胞的取材
原代细胞的取材 一、取材的基本要求 （1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 （2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。 （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下： 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min 的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞． 二、实体组织材料的分离方法 （一）机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头 压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此 法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适 用于处理纤维成分少的软组织。 （二）消化分离法 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： （１）胰蛋白酶分散技术 胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开．胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。 ①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效．
细胞培养实验报告
动物细胞培养 一、试验目的。 1、掌握无菌操作技术。 2、掌握原代和传代细胞培养。 3、掌握细胞冷冻和复苏技术。 4、了解培养成纤维细胞的形态。 二、试验原理。 将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。 三、实验器材及药品。 器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精 培养箱、超净工作台、离心管、灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO 2 高压灭菌锅、试管架等。 药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓冲液等。 四、实验操作。 1、消毒灭菌。 将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。
2、培养基的配制。 分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。 3、原代培养。 （1）、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。 （2）、剪切与消化。将胚胎组织放于平板中，用眼科剪将组织块剪碎，剪得越碎越好。将剪碎的组织块放于离心管中，加入大约200μl的胰酶进行消化。也可将其置于37度恒温箱中进行消化。 （3）、分离细胞。消化到一定时间时，如果离心管中的溶液中出现了明显的浑浊，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，则应该加入与胰酶等量的培养液终止消化。离心管于离心机中离心，弃上清液，得到分散的细胞。 （4）、转移细胞并培养。向含有分散细胞的离心管中加入配制好的培养液，吹打 箱培养，瓶口少少混匀，将培养液用移液器移到细胞培养瓶中。置于℃恒温CO 2 拧的松一点。 4、传代培养。 （1）、倒置显微镜下观察细胞的形态。倒置显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。 （2）、收集原代培养的细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止消化。然后离心，收集到原代培养的细胞。 （3）、传代细胞的培养。向离心管内加入大约7—8ml的培养液，吹打混匀。将培养液转移到培养瓶中，置于37度恒温CO 培养箱中培养。培养1—2天后于显 2 微镜下观察细胞的形态。 5、细胞冷冻保存。 （1）、收集细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200μl的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止
细胞的原代培养
细胞原代培养 【实验目的】 1.理解细胞原代培养原理 2.熟悉细胞原代培养方法与过程 3.了解细胞原代培养的应用 4.独立进行细胞原代培养操作 【实验原理】 1、原代培养实验原理 细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。 原代培养的方法有： a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大 小。用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块 贴于培养瓶进行培养。 b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的 0.125%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用 几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上 清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 【实验仪器、材料、试剂及用品】 1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱 2.材料：孕鼠 3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u ／ ml 、链霉素100ug／ml。(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。 4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％ 酒精棉球，酒精灯、小指管。 【实验步骤】 (一)小鼠胚胎的准备:
小鼠脾脏细胞原代培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 实验背景： 一、细胞培养的基本条件： 1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 4.细胞保存条件：液氮罐 1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱： CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃，14 h)。 ③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液 蒸发。 三、细胞培养用液的配制： 1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 3.消化液： ①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 ②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 ③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是 0.25％。用滤器过滤除菌。 ④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 ⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 4.培养基： 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 ①天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污
原代心肌细胞培养方法探讨[1] 3
心肌细胞的分离及培养 器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒 溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶 动物：小鼠 准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。 培养过程： 1、两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小镊子开胸取心。 2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。 3、PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。 4、放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。 5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。 6、重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。 7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。 8、加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。 9、培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。 10、显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。 11、4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。 或从第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。