高效液相色谱仪常见故障及剖析

关键词:高效液相色谱仪;故障;维护

高效液相色谱是以经典的液相色谱为基础,它是以高压下的液体为流动相的色谱过程。它所用的固定向粒度小(5-10um),有传质快、柱效高等特点。高效液相色谱法(HPLC)是60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来,在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等方面应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC 来分析测定。高效液相色谱仪是由输液系统(包括贮液器、高压泵等)、分离系统(包括进样器、色谱柱等)、检测系统(包括检测等)、收集系统(包括馏分收集器、自动收集装置等)等组成。这些系统就象人的脉络一样相互依赖,每个环节的故障都会影响到分析测试结果的可靠性、真实性。因此,对液相色谱进行故障排查及作好日常维护保养是延长色谱使用寿命的关键。下面就输液泵、检测器的常见故障及其使用与维护进行分析。

1 输液泵的常见故障及使用与维护

输液泵/高压泵是保证HPLC系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件。目前多用往复式恒流柱塞泵。主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单项阀组成,用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。常见泵的故障主要有以下几种,并提供解决的办法。

1.1 单向阀故障

由于球与阀座密封不严,导致液体倒流,造成压力不稳,甚至球与阀座粘在一起阻死。为避免单项阀中的宝石球和阀座被污染,流动相应使用HPLC级的溶剂,并且配好的流动相一定要用0.45um滤膜过滤和脱气。如果泵被微粒污染,可分别用25ml水 25ml甲醇 25ml异丙醇 25ml二氯甲烷依次冲洗,最后再用所用的溶液冲洗整个系统。注意:冲洗时应打开泄液阀。如果气泡进入阀中,它会紧贴在阀体的一侧,使宝石球难返回到阀座,引起液体倒流,导致泵的压力和流速明显改变。此时应立即打开泻液阀,大流量(2ml/min)冲洗泵,直至排除液为直线型。如果泵进气泡也可在泵头上排气泡,具体做法为:用扳手固定住进气泡的泵头,拧开输出管道的压帽,手动泵进液,这时可见到气泡从孔中挤压出来,直至无气泡排出将压帽拧紧。如果采取上述方法仍不能使压力稳定,应考虑是密封垫圈坏了?或单向阀磨损、球不光滑等,需更换部件。

1.2 泵垫圈故障

泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统.液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液,样品PH值一般调到中性,才可进样。如果强酸强碱会损坏密封垫和柱塞杆。密封圈与运动着的柱塞杆紧密接触,可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来,它是液相色谱中最易磨损的部件。有条件的实验室可三个月更换一次垫圈,以防止泵系统污染。如果用缓冲盐作流动相则更会加速垫圈的磨损,应及时冲洗。垫圈损坏一般表现为:泵压力不稳、泵头漏液。为避免上述故障的发生,我们在分析中应注意以下几点:①使用超纯水、纯度级别较高的试剂和色谱级溶

剂配制流动相;②配好的流动相一定要抽滤脱气,即便仪器有在线脱气装置,也最好在上机前进行抽滤;③泵在启动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气;④用缓冲盐洗脱时,分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统,最后用有机溶剂充满系统。

2 检测器的常见故障及对策

液相色谱仪常用的检测器主要有紫外、荧光和电化学检测器三种。这些检测器的作用就是收集流经色谱分离柱的各组分在检测器中的信号,根据组份分光吸收值/荧光强度/电极表面电流的变化计算出组分的浓度。

检测器常见故障及对策主要有:

2.1 基线噪音较大及对策

对于紫外检测器,氘灯光源打开后要预热30分钟以上,基线才能稳定。氘灯用的过久,接近寿命期时(氘灯的寿命约为1000小时),会使基线噪音明显增加,应及时更换氘灯。除光源外,流路中的气泡也会产生噪音。那么,怎样判断基线噪音增大是由于光源灯的老化还是来自流路中的气泡呢?首先,可将泵关闭继续走基线,如果噪音立即停止,基线呈一条直线,说明基线噪音来自流动相中的气泡,应设法排气。其次,如果停泵后仍有噪音出现,应考虑是灯的问题。电化学检测器中的工作电极对气泡十分敏感,仪器的平衡时间较长,流路中如果有气泡存在,不仅基线会出现尖峰,还会影响检测。因此,做电化学检测时,流动相的配制要很严格。水要超纯、除还原物外配好后一定要过滤脱气,还应现用现配。

如果泵系统不是YK材料,即电化学分析专用仪器,而是普通的高效液相色谱不锈钢泵,在分析前应对系统中的输液泵、进样器和管道用6moUL 硝酸溶液钝化(注意断开分离柱)或在流动相中加入EDTA离子隐蔽剂可缩短基线平衡时间。如果有较大的气泡进到检测器中,光靠泵冲有时太慢,可暂时将泵停止,关上电化学检测器,拆下工作电极,用超纯水冲洗电极表面,但对液相色谱技术不太熟练的技术员要小心操作,不宜反复这样拆卸。

2.2 检测器污染及对策

管道污染阻塞是检测器常见故障。当流动相用了缓冲盐更换流动相不当时,常会使检测器管路中产生沉淀,可先用5倍柱体积的非缓冲液反向流动相冲洗系统,再用10倍柱体积的强溶剂(如乙腈)流过,然后用50倍的柱体积的异丙醇冲洗,最后换上反向流动相平衡。

检测器管路堵塞,一般表现为柱压升高。此时,可断开柱子,直接接检测器。如泵压仍较高,可断定压力升高是由于检测器管道堵塞造成。检测器进口是常发生阻塞的地方,正向冲洗效果常不明显。我们的经验是将检测器进出口对调,用6moUL硝酸溶液反冲检测器,这样能很快将阻塞冲开,但要注意用低流速冲洗,观察压力变化。

2.3 池阻塞和污染及对策

检测池阻塞和污染多见紫外检测器。通常,池阻塞的故障比较少见,而池污染常发生。当池受污染时,一般表现为基线噪音增大,仪器灵敏度

下降。此时,应对池进行清洗。清洗程序如下:①回抽10ml异丙醇去掉流动相残留;②回抽10ml蒸馏水;③回抽10mL6mol/L硝酸,通过池去掉沉积物,此步应十分小心,备有防止应急措施;④回抽20ml蒸馏水;⑤至少用100mlHPLC级的水正向通过池。为了减少危险和麻烦,清洗更充分,可采用下列步骤:①拆开柱,在检测器出口处接一根细径的聚乙烯管,约50cm长;②推高试剂瓶,使水平线高于池约40cm,聚乙烯管另一端没入清洗液中,在检测器进口处用洗耳球吸液,然后利用重力使清洗液自然流经池;③冲洗溶液顺序为50ml无水乙醇→50ml蒸馏水→250ml 3mol/L 硫酸→100ml蒸馏水。用此法冲洗不需要拆开池,无损于管路,但流速较慢。对于电化学检测器,要注意维护工作电极表面的清洁度。当检测器检测了大量较脏的样品(如血浆、尿液)或用的过久,应用化学法或物理抛光法对电极表面进行清洁,这样可提高一定的检测灵敏度。但要特别注意:最后一定要用纯水冲洗干净,不要带来其他污染。

高效液相色谱仪是现代科学研究中广泛使用的分析仪器,只有正确的使用与维护,才能更好的驾驭它,让HPLC技术在生物医学等领域发挥更大的作用。