脐血造血细胞的体外扩增：2.造血细胞生长因子和培养液更换的作用

脐带血造血干细胞库管理办法(试行)

脐带血造血干细胞库管理办法（试行）第一章总则第一条为合理利用我国脐带血造血干细胞资源，促进脐带血造血干细胞移植高新技术的发展，确保脐带血造血干细胞应用的安全性和有效性，特制定本管理办法。第二条脐带血造血干细胞库是指以人体造血干细胞移植为目的，具有采集、处理、保存和提供造血干细胞的能力，并具有相当研究实力的特殊血站。任何单位和个人不得以营利为目的进行脐带血采供活动。第三条本办法所指脐带血为与孕妇和新生儿血容量和血循环无关的，由新生儿脐带扎断后的远端所采集的胎盘血。第四条对脐带血造血干细胞库实行全国统一规划，统一布局，统一标准，统一规范和统一管理制度。第二章设置审批第五条国务院卫生行政部门根据我国人口分布、卫生资源、临床造血干细胞移植需要等实际情况，制订我国脐带血造血干细胞库设置的总体布局和发展规划。第六条脐带血造血干细胞库的设置必须经国务院卫生行政部门批准。第七条国务院卫生行政部门成立由有关方面专家组成的脐带血造血干细胞库专家委员会（以下简称专家委

员会），负责对脐带血造血干细胞库设置的申请、验收和考评提出论证意见。专家委员会负责制订脐带血造血干细胞库建设、操作、运行等技术标准。第八条脐带血造血干细胞库设置的申请者除符合国家规划和布局要求，具备设置一般血站基本条件之外，还需具备下列条件：（一）具有基本的血液学研究基础和造血干细胞研究能力；（二）具有符合储存不低于1 万份脐带血的高清洁度的空间和冷冻设备的设计规划；（三）具有血细胞生物学、HLA 配型、相关病原体检测、遗传学和冷冻生物学、专供脐带血处理等符合GMP、 GLP 标准的实验室、资料保存室；（四）具有流式细胞仪、程控冷冻仪、PCR 仪和细胞冷冻及相关检测及计算机网络管理等仪器设备；（五）具有独立开展实验血液学、免疫学、造血细胞培养、检测、HLA 配型、病原体检测、冷冻生物学、管理、质量控制和监测、仪器操作、资料保管和共享等方面的技术、管理和服务人员；（六）具有安全可靠的脐带血来源保证；（七）具备多渠道筹集建设资金运转经费的能力。第九条设置脐带血造血干细胞库应向所在地省级卫生行政部门提交设置可行性研究报告，内容包括：

常用细胞系所用培养液参考

常用细胞系所用培养液参考，其它详细参见ATCC细胞库(https://www.360docs.net/doc/355987989.html,) 细胞系名称细胞类型物种来源组织培养液与血清 293成纤维细胞人胚胎肾 MEM, 10% 马血清 3T6成纤维细胞小鼠胚胎 DMEM, 10% FBS A549上皮样人肺癌 F-12K, 10% FBS A9成纤维细胞小鼠结缔组织 DMEM, 10% FBS AtT-20上皮样小鼠垂体肿瘤 F-10, 15%马血清+ 2.5% FBS BALB/3T3成纤维细胞小鼠胚胎 DMEM, 10% FBS BHK-21成纤维细胞仓鼠肾 DMEM, 10% FBS or MEM, 10% FBS and NEAA BHL-100上皮样人乳腺 McCoy'5A, 10% FBS BT成纤维细胞牛鼻甲细胞 MEM, 10% FBS and NEAA Caco-2上皮样人结肠腺瘤 MEM, 20% FBS and NEAA Chang上皮样人肝 BME, 10% 牛血清 CHO-K1上皮样仓鼠卵巢 F-12, 10% FBS Clone 9上皮样大鼠肝 F-12K, 10% FBS Clone M-3上皮样小鼠黑色素瘤 F-10, 15%马血清+ 2.5% FBS COS-1成纤维细胞猴肾 DMEM, 10% FBS COS-3成纤维细胞猴肾 DMEM, 10% FBS COS-7成纤维细胞猴肾 DMEM, 10% FBS CRFK上皮样猫肾 MEM, 10% FBS and NEAA CV-1成纤维细胞猴肾 MEM, 10% FBS D-17上皮样犬骨肉瘤 MEM, 10% FBS and NEAA Daudi淋巴样人淋巴瘤患者外周血 RPMI-1640, 10% FBS GH1上皮样大鼠垂体瘤 F-10, 15%马血清+2.5% FBS GH3上皮样大鼠垂体瘤 F-10, 15%马血清+ 2.5% FBS H9淋巴样人 T-细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% FBS HaK上皮样人肾 BME, 10% 牛血清 HCT-15上皮样人结肠腺癌 RPMI-1640, 10% FBS HeLa上皮样人宫颈癌 MEM, 10% FBS and NEAA (in suspension, S-MEM) HEp-2上皮样人喉癌 MEM, 10% FBS HL-60淋巴样人早幼粒细胞白血病 RPMI-1640, 20% FBS HT-1080上皮样人纤维肉瘤 MEM, 10% HI FBS and NEAA HT-29上皮样人结肠腺癌 McCoy's 5A, 10% FBS HUVEC上皮样人脐带 F-12K, 10% FBS 肝素100 ug ml I-10上皮样小鼠睾丸肿瘤 F-10, 15%马血清+2.5% FBS IM-9淋巴样人骨髓瘤患者骨髓 RPMI-1640, 10% FBS JEG-2上皮样人绒毛膜癌 MEM, 10% FBS Jensen成纤维细胞大鼠肉瘤 McCoy's 5A, 5% FBS Jurkat淋巴样人淋巴瘤 RPMI-1640, 10% FBS

培养基的种类

培养基; 1、麸皮培养基:（黄曲霉） 100g麸皮，900g水，煮沸20分钟，用四层纱布过滤，得到的清液中加入1g酵母粉，加水定容至1L, 121℃灭菌30 min. 2、( 马铃薯琼脂 )培养基（禾谷镰刀菌）马铃薯 2 0 0克琼脂1 5~一2 0 克自来水 2 0 0 0毫升将去皮切片的 2 0 0克马铃薯,放入1 0 0 0毫升水中煮沸, 3 0分钟,以纱布滤取汁液,补足水量,再加琼脂,热溶,经 1 21 ℃ ,2 0 ~ 3 0分钟高压灭菌 3 、察氏培养基 (曲霉）硝酸钠3g 磷酸氢二钾1g 硫酸镁(MgSO4?7H2O) 0.5g 氯化钾0.5g 硫酸亚铁0.01g 蔗糖30g 琼脂20g 蒸馏水1000mL 制法：加热溶解，分装后121℃灭菌20min。用途：青霉、曲霉鉴定及保存菌种用。 4、瓦克斯曼培养基（Waksmen培养基）：选用商品培养基或按如下方法配制。：蛋白胨 5.0g KH2PO4 1.0g MgSO4?7H2O 0.5g 琼脂 20.0g 蒸馏水 1000ml 加热溶解后，用0.5mol/L H2SO4调节pH到3.8～4.0，加入10g葡萄糖，121℃蒸汽灭菌10分钟。 5、在察氏琼脂培养基上菌落生长较快，10d—14d直径3cm—4cm或4cm～7cm,最初带黄色，然后变为黄绿色，老后颜色变暗，平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色。在低倍显微镜下观察可见分生孢子头疏松放射状，继变为疏松柱状。分生孢子梗多从基质生出，长度一般小于1mm。有些菌丝产生带褐色的菌核。制片镜检观察可见分生孢子梗极粗糙，直径10um～20um。顶囊烧瓶形或近球形，直径10um～65um，一般多为25um—45um。全部顶囊着生小梗，小梗单层、双层或单、双层同时生在一个顶囊上；梗基（6um—10um）*（4um～5.5um)，小梗（6.5um—10um）*（3um—5um）。分生孢子球形、近球形或稍作洋梨形，3um—6um，粗糙。

细胞培养常用培养基

细胞培养常用培养基高博，苏州大学医学部药学院药理学系 1、RPMI-1640 Medium RPMI-1640 广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。其它像K-562 、HL-60 、Jurkat 、Daudi 、IM-9 等成淋巴细胞、T 细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15 上皮细胞等均可参考使用。 2、Minimum Essential Medium （MEM ）也称最低必需培养基，它仅含有12 种必需氨基酸、谷氨酰胺和8 种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha 一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM 来培养。 3、DMEM- 高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA 转染的转化细胞的培养。 4、DMEM- 低糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。 5、DMEM/F12 DMEM/F12 培养基适于克隆密度的培养。F12 培养基成分复杂，含有多种微量

元素，和DMEM 以 1 ：1 结合，称为DMEM/F12 培养基（DME/F12 medium ），作为开发无血清配方的基础，以利用F12 含有较丰富的成分和DMEM 含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12 （1：1）中加入 15 mM HEPES 缓冲液 6、McCoy ' s 5A McCoy ' s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen 大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29 、BHL-100 等上皮细胞。 7、Iscove ' s Modified Dulbecco Medium （IMDM） Guilber 和Iscove 将Dulbecco ' Medium 改良为Iscove 'Mediums ，用于培养红细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES 。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM 还能够促进小鼠 B 淋巴细胞，LPS 刺激的 B 细胞，骨髓造血细胞，T 细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM 为营养非常丰富的培养液，因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。 8、M-199 Medium 1950 年，Morgan 成功研制出具有确定化学成分的细胞培养液，即M-199 ，主要用于鸡胚成纤维细胞培养。此培养液必须辅以血清才能支持长期培养。 M-199 可用于培养多种种属来源的细胞，并能培养转染的细胞。 9、Leibovitz Medium （L-15 ） L-15 培养液适用于快速增殖瘤细胞的培养，用于在CO2 缺乏的情况下培养

几种常见培养基作用

1.中国蓝平板：含有牛肉粉、蛋白胨、乳糖、琼脂、氯化钠、中国蓝、玫瑰红等成份。是一种弱选择性（亦有学者称为无抑制性）选择培养基。成份中的中国蓝为指示剂，玫瑰红为弱抑制剂，仅能抑制革兰阳性菌生长，而对大肠杆菌没有抑制作用，发酵性革兰阴性杆菌因分解乳糖能力不同，在此平板上的菌落颜色不同，便于鉴别菌种。根据菌落形态，可做出相应的处理或报告。例如：大肠埃希菌菌落呈蓝色；痢疾志贺菌呈淡红色；鼠伤寒沙门菌呈淡红色。 2.巧克力平板：普通营养琼脂成份添加进氯化血红素，万古霉素，辅酶A。用途：除可以分离奈瑟菌，嗜血杆菌外，由于加入了万古霉素，可抑制绝大多数的革兰阳性菌的生长，在分离培养上具有重要意义，不能用血平板来替代。巧克力平板含有嗜血杆菌生长需要的营养因子X因子和V因子。其原理为：绵羊血中的V因子通常处于被抑制状态，加热到80～90℃12Min即可破坏红细胞膜上的不耐热抑制物，可使V因子释放，故嗜血杆菌在加热的血琼脂培养基即巧克力琼脂培养基上生长较佳。 3. TCBS：含酵母膏粉蛋白胨氯化钠柠檬酸钠硫代硫酸钠胆酸钠牛胆粉蔗糖柠檬酸铁溴麝香草酚兰麝香草酚兰琼脂；其中：氯化钠可刺激弧菌的生长；蔗糖是可发酵的糖类；胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠和柠檬酸钠及较高的pH（8.6）可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群；霍乱弧菌对酸性环境比较敏感，因此该pH值可增强其生长；硫代硫酸钠与柠檬酸铁反应作为检测硫化氢产生的指示剂；溴麝香草酚兰和麝香草酚兰是pH指示剂。利用指示剂来区分是否发酵蔗糖：副溶血性弧菌不发酵蔗糖，菌落呈蓝绿色。霍乱弧菌发酵蔗糖产酸，菌落呈黄色。TCBS常用于致病性弧菌的选择性分离，是GB2008、SN标准指定培养基。 4.MAC平板：即麦康凯琼脂培养基，用于大肠杆菌和大肠菌群的分离培养(05药典)，主要成分：蛋白胨脙胨猪胆盐(或牛、羊胆盐) 氯化钠琼脂乳糖1%结晶紫水溶液0.5%中性红水溶液。麦康凯平板的原理：利用胆盐来抑制革兰阳性细菌的生长，而对伤寒等沙门菌有促进生长的作用．利用乳糖发酵，中性红的颜色可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌区别开．沙门菌及志贺菌呈无色菌落，大肠埃希菌呈桃红色菌落． SS培养基 2.原理培养基中牛肉膏、蛋白胨等为营养物;煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等抑制非病原菌生长,而胆盐能促进某些病原菌生长。因大肠埃希菌等能迅速分解乳糖产酸并与胆盐结合成胆酸,故形成中心混浊的粉红色菌落;病原菌不能分解乳糖。菌落呈透明无色,枸橼酸铁能指示硫化氢的产生,使菌落中心呈黑色。硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺菌及沙门菌的有害作用并中和煌绿和中性红染料的毒性作用,且能使大肠埃希菌的红色菌落颜色鲜明。 3.用途用于分离肠道致病菌。 SS琼脂培养基是分离沙门菌及志贺菌属的强选择性培养基,它对大肠埃希菌有较强的抑制作用,而对肠道病原菌则无明显抑制作用。因此,可以增加粪便等标本的接种量,从而提高病原菌的检出率,是目前公认比较满意的培养基。附注:大肠埃希菌属细菌在此培养基虽不易生长,但亦不被杀灭,故挑选病原菌菌落时,应仅挑取菌落的中心部分,否则易将其四周的杂菌一并挑入,影响结果。

卫生部办公厅关于印发《脐带血造血干细胞治疗技术管理规范(试行)

卫生部办公厅关于印发《脐带血造血干细胞治疗技术管理规范(试行)》的通知【法规类别】采供血机构和血液管理【发文字号】卫办医政发[2009]189号【失效依据】国家卫生计生委办公厅关于印发造血干细胞移植技术管理规范(2017年版)等15个“限制临床应用”医疗技术管理规范和质量控制指标的通知【发布部门】卫生部(已撤销) 【发布日期】2009.11.13 【实施日期】2009.11.13 【时效性】失效【效力级别】部门规范性文件卫生部办公厅关于印发《脐带血造血干细胞治疗技术管理规范（试行）》的通知（卫办医政发〔2009〕189号）各省、自治区、直辖市卫生厅局，新疆生产建设兵团卫生局：为贯彻落实《医疗技术临床应用管理办法》，做好脐带血造血干细胞治疗技术审核和临床应用管理，保障医疗质量和医疗安全，我部组织制定了《脐带血造血干细胞治疗技术管理规范（试行）》。现印发给你们，请遵照执行。二〇〇九年十一月十三日

脐带血造血干细胞治疗技术管理规范（试行）为规范脐带血造血干细胞治疗技术的临床应用，保证医疗质量和医疗安全，制定本规范。本规范为技术审核机构对医疗机构申请临床应用脐带血造血干细胞治疗技术进行技术审核的依据，是医疗机构及其医师开展脐带血造血干细胞治疗技术的最低要求。本治疗技术管理规范适用于脐带血造血干细胞移植技术。一、医疗机构基本要求（一）开展脐带血造血干细胞治疗技术的医疗机构应当与其功能、任务相适应，有合法脐带血造血干细胞来源。（二）三级综合医院、血液病医院或儿童医院，具有卫生行政部门核准登记的血液内科或儿科专业诊疗科目。 1.三级综合医院血液内科开展成人脐带血造血干细胞治疗技术的，还应当具备以下条件：（1）近3年内独立开展脐带血造血干细胞和（或）同种异基因造血干细胞移植15例以上。（2）有4张床位以上的百级层流病房，配备病人呼叫系统、心电监护仪、电动吸引器、供氧设施。（3）开展儿童脐带血造血干细胞治疗技术的，还应至少有1名具有副主任医师以上专业技术职务任职资格的儿科医师。 2.三级综合医院儿科开展儿童脐带血造血干细胞治疗技术的，还应当具备以下条件：

细胞培养基种类

细胞培养基的选择及常用数据库日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：次细胞实验技术经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。以前经常听到有人问，这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单，也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，那很简单，问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等，它还

细胞培养基种类及用途

基础细胞培养基通常指基础合成培养基，主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。据不同细胞和研究目的，选用合适培养基,?还可补加新成分。?如杂交瘤中常用DMEM加丙酮酸钠、2-巯基乙醇（相当于胎牛血清可透析组分的作用）。合成培养基使用时加5-30%血清。 1． 199细胞培养基及其改良品种 1950年Morgan等设计，除BSS外，含有53种成分，为全面培养基，广用于各类细胞培养，广泛用于病毒学、疫苗生产。 2． BME细胞培养基基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle），1955年Eagle设计，BSS＋12种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMEM等。 3． MEM细胞培养基低限量Eagle培养基（Minimal Essential Medium），1959年修改，删去赖氨酸、生物素，氨基酸浓度增加，适合多种细胞单层生长，有可高压灭菌品种，是一种最基本、试用范围最广的培养基，但因其营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。 4． DMEM细胞培养基及其改良品种 DMEM由Dulbecco改良的Eagle培养基，各成份量加倍，分低糖(1000mg/L)、高糖(4500mg/L)。生长快，附着稍差肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。 5． IMEM细胞培养基 IMEM由Iscove's改良的Eagle培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。 6． RPMI-1640细胞培养基 Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，针对淋巴细胞培养设计，BSS＋21种氨基酸＋维生素11种等，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养 7．Fischer’s细胞培养基用于白血病微粒细胞培养。 8． HamF10、F12细胞培养基 1963年、1969年Ham设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，特适于羊水细胞培养。 9． DMEM/F12细胞培养基 DMEM和F12细胞培养基按照1:1比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。 10． McCoy5A培养基 1959年MeCoy为肉瘤细胞设计，

培养基的类型及应用

培养基的类型及应用培养基种类繁多,根据其成份、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。 1．按成份不同划分 (1)天然培养基(complexmedium) 这类培养基主要以化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成,牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常用的LB(Luria-Bertani)培养基也是一种复合培养基,其组成见表4-10。常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏(表4-11)、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡罗卜汁、椰子汁等,嗜粪微生物(coprophilousmicroorganisms)可以利用粪水作为营养物质。复合培养基成本较低,除在实验室经常使用外,也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。 (2)合成培养基(syntheticmedium) 合成培养基是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基(chemicallydefinedmedium),高氏1号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强,但与天然培养基相比其成本较高,微生物在其中生长速度较慢,一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。 2．根据物理状态划分根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少,可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。 (1)固体培养基(solidmedium) 在液体培养基中加入一定量凝固剂即为固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件:1.不被所培养的微生物分解利用;2.在微生物生长的温度范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌时,由于高温容易引起培养基液化,通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题;3.凝固剂凝固点温度不能太低,否则将不利于微生物的生长;4.凝固剂对所培养的微生物无毒害作用;5.凝固剂在灭菌过程中不会被破坏;6.透明度好,粘着力强;7.配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂(agar)、明胶(gelatin)和硅胶(silicagel)。表4-12列出琼脂和明胶的一些主要特征。对绝大多数微生物而言,琼脂是最理想的凝固剂,琼脂是由藻类(海产石花菜)中提取的一种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物,是最早用来作为凝固剂的物质,但由于其凝固点太低,而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶,目前已较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠(Na2SiO3)及硅酸钾(K2SiO3)被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体,它不含有机物,适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外,一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基。例如,由马铃薯块、胡罗卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类。如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉子壳培养基。在实验室中,固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面,单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖,可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。

卫生部关于印发《脐带血造血干细胞库设置管理规范(试行)》的通知

卫生部关于印发《脐带血造血干细胞库设置管理规范(试行)》的通知发文机关：卫生部(已撤销) 发布日期： 2001.01.09 生效日期： 2001.02.01 时效性：现行有效文号：卫医发(2001)10号各省、自治区、直辖市卫生厅局：为贯彻实施《脐带血造血干细胞库管理办法（试行）》，保证脐带血临床使用的安全、有效，我部制定了《脐带血造血干细胞库设计管理规范（试行）》。现印发给你们，请遵照执行。附件：《脐带血造血干细胞库设置管理规范（试行）》二○○一年一月九日附件：脐带血造血干细胞库设置管理规范（试行）脐带血造血干细胞库的设置管理必须符合本规范的规定。一、机构设置（一）脐带血造血干细胞库（以下简称脐带血库）实行主任负责制。（二）部门设置脐带血库设置业务科室至少应涵盖以下功能：脐带血采运、处理、细胞培养、组织配型、微生物、深低温冻存及融化、脐带血档案资料及独立的质量管理部分。二、人员要求

（一）脐带血库主任应具有医学高级职称。脐带血库可设副主任，应具有临床医学或生物学中、高级职称。（二）各部门负责人员要求 1．负责脐带血采运的人员应具有医学中专以上学历，2年以上医护工作经验，经专业培训并考核合格者。 2．负责细胞培养、组织配型、微生物、深低温冻存及融化、质量保证的人员应具有医学或相关学科本科以上学历，4年以上专业工作经历，并具有丰富的相关专业技术经验和较高的业务指导水平。 3．负责档案资料的人员应具相关专业中专以上学历，具有计算机基础知识和一定的医学知识，熟悉脐带血库的生产全过程。 4．负责其它业务工作的人员应具有相关专业大学以上学历，熟悉相关业务，具有2年以上相关专业工作经验。（三）各部门工作人员任职条件 1．脐带血采集人员为经过严格专业培训的护士或助产士职称以上卫生专业技术人员并经考核合格者。 2．脐带血处理技术人员为医学、生物学专业大专以上学历，经培训并考核合格者。 3．脐带血冻存技术人员为大专以上学历、经培训并考核合格者。 4．脐带血库实验室技术人员为相关专业大专以上学历，经培训并考核合格者。三、建筑和设施（一）脐带血库建筑选址应保证周围无污染源。（二）脐带血库建筑设施应符合国家有关规定，总体结构与装修要符合抗震、消防、安全、合理、坚固的要求。（三）脐带血库要布局合理，建筑面积应达到至少能够储存一万份脐带血的空间；并具有脐带血处理洁净室、深低温冻存室、组织配型室、细菌检测室、病毒检测室、造血干/祖细胞检测室、流式细胞仪室、档案资料室、收/发血室、消毒室等专业房。（四）业务工作区域应与行政区域分开。

细胞培养板的选择和使用

细胞培养板的选择和使用（四）点击次数：1678 作者：clearair00 发表于：2008-07-23 10:32转载请注明来自丁香园来源：丁香园（一）培养板的清洗和消毒培养板一般为一次性使用，尤其在接触了有毒、有害等物质后更应该处理后丢弃。但如果要反复使用则一定要进行正确的清洗和消毒，以保证细胞培养的效果。问：只有紫外照射可以保证无菌吗?可不可以从清洗方面做点工作? 答：看你什么用途了，一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。我们一般是先泡酸过夜，清洗干净，三蒸水清洗，再用无水酒精浸泡清洗，再在工作台里用无菌水过一遍，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，打开在超净工作台里近紫外（距离紫外灯<２０ｃｍ）照射半个小时以上，效果很好，没有污染过。其实不管老板有钱没钱，我们做实验室尤其是预实验或是摸条件时，我们一般都能省就省了，留点钱还不如买点好试剂呢：）我们一般是先清洗干净，泡酸过夜，三蒸水清洗，在盖上盖子在烘箱里烤干，待烤干后，有两种选择：1、在超净台里近紫外灯（距离紫外灯<3０ｃｍ）照射半个小时以上，六孔板一般半个小时，24孔板一个小时，96孔板时间更长，效果很好，没有污染过；2、到放射科照Co60，照完了尽快用。我们这里肿瘤细胞耐性很好，所以重复利用没什么问题，如果原代培养比较娇贵的细胞最好用新板

子，也不是很贵。我们的经验是:清洗后用消毒液浸泡，泡酸过夜，自来水反复冲洗，双蒸水冲洗三遍，无尘环境晾干，用之前紫外灯照射半小时以上，效果很好。我们现在的穷同仁一直在应用。永久了也会变黄，因此如果做mtt或比色时是不能用的，在不熟悉细胞培养的时候可以先学学细胞记数，熟练了用新的，不过肿瘤细胞可以在旧板子上长得很好哟，原代的细胞比较难养，塑料的较好。紫外的穿透能力很弱，板子紫外照射时是否将盖子翻过来一起照射那？还有，细胞瓶紫外效果如何？板子泡酸后和瓶子一样的清洗方法清洗后，60度烤干，然后放在工作台里（打开盖子）用紫外线照射半小时以上，最好一小时或两小时，盖子同时反过来照。瓶子照射没有效果，要用其他方法同意楼上大家的意见。96孔和24孔板子在做完了后要先泡清洗计，在用棉花搽洗每个孔，这样有些贴壁细胞才不会有细胞碎片的残留，在做mtt是很重要，要不很不准的。后面就是冲洗，泡酸，3蒸水洗，紫外照射30－60分钟，不要时间太长，这样板子容易变色！但是如果是做MTT还是建议用新板子！旧板子做，结果不准！泡酸时不要用刚配好的浓酸，因为那样会把培养板表面促进细胞贴附的一层膜腐蚀掉，细胞就无法贴壁了。用酸泡完后用自来水清洗，再用蒸馏水清洗3－5次，然后泡在75％的酒精里（酒精用纯的无水乙醇），用前在紫外线下照射1h。基本可保证95％以上无菌，用这些板做做预实验是没问题的。 1.钴60照射适合大量的板同时灭菌，最好攒一箱，再送去灭菌。 2.紫外消毒适合少量的培养皿或培养板，比如培养板，将盖打开，翻过来，连同板一起在紫外下照射2小时即可，事先不用酒精泡。 (二)方法讨论

细胞培养基的基本知识

培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。一、基础培养基绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取 1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM 含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。

细胞培养基中的添加剂及其作用

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养;RPMI-1640做悬浮细胞和人白血病细胞单层培养是一个好的开始，它也广泛应用于哺乳动物细胞和杂交瘤细胞的培养，如人骨髓瘤细胞、鼠杂交瘤细胞、人白细胞以及B细胞和T细胞;各种目的无血清培养最好首选AIM V(12005)培养基(SFM)。选择细胞的培养基也可以到ATCC上查询，ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数细胞的详细资料。打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接，输入细胞名称就可以搜索ATCC的细胞数据库。数据库中有每一种细胞的详细描述，包括细胞的来源，培养和冻存条件，以及相关文献等资料。同一种培养基也会因其添加物的不同而应用于不同的细胞培养和不同的实验需求，下面就详细介绍下培养基中各种添加剂的功能。 1. L-谷氨酰胺(L-Glutamine)在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗? 是细胞生长的必须氨基酸，为培养的细胞提供重要的能量来源。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，降解率随保存温度而变。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 2. GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定? GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 3. 培养基中丙酮酸钠的作用是什么? 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 4. Hank′s 平衡盐溶液(HBS)和Earle′s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别? HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagle′s (2.2g/L)中比在Hanks′ (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagle′s液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks′液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagle′s液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks′液就可以了。 5. 培养液pH对细胞生长的影响? 由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系

脐带血造血干细胞库管理规定试行

脐带血造血干细胞库管理规定试行 Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】

（二）具有符合储存不低于1万份脐带血的高清洁度的空间和冷冻设备的设计规划；（三）具有血细胞生物学、HLA配型、相关病原体检测、遗传学和冷冻生物学、专供脐带血处理等符合GMP、GLP标准的实验室、资料保存室；（四）具有流式细胞仪、程控冷冻仪、PCR仪和细胞冷冻及相关检测及计算机网络管理等仪器设备；（五）具有独立开展实验血液学、免疫学、造血细胞培养、检测、HLA 配型、病原体检测、冷冻生物学、管理、质量控制和监测、仪器操作、资料保管和共享等方面的技术、管理和服务人员；（六）具有安全可靠的脐带血来源保证；（七）具备多渠道筹集建设资金运转经费的能力。第九条设置脐带血造血干细胞库应向所在地省级卫生行政部门提交设置可行性研究报告，内容包括：（一）申请单位名称、基本状况；（二）拟设脐带血造血干细胞库的名称、规模、任务、功能、组织结构、资金来源等；（三）拟设脐带血造血干细胞库服务对象、需求状况、机构运行的预测分析；（四）拟设脐带血造血干细胞库的选址和建筑设计平面图；（五）拟设脐带血造血干细胞库将开展的业务项目、技术设备条件和技术人员配置的资料；（六）审批机关规定提交的其它材料。第十条符合申请条件者，经省级人民政府卫生行政部门初审推荐，上报国务院卫生行政部门。

细胞培养基及其配制方法

细胞培养基及其配制方法 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT

D M E M(A)细胞培养基（粉末型）成分

●所用器皿应严格消毒。 ●配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。 ●液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基，它是一种灭菌后保证无菌的溶液，必要时可制成无内毒素等的溶液，可节省科研人员的工作量。 DMEM各种成分都有什么作用一般的基础培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。（1）无机盐：对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。（2）氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)都是细胞用以合成蛋白质的必需氨基酸，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，对细胞的培养特别重要，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好单独配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培养液中。（3）维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。（4）碳水化合物：是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。体外培养动物细胞时，几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。（5）葡萄糖和谷胺酰胺：体外培养条件下，葡萄糖主要经糖酵解降解，产生过量的乳酸。减少乳酸生产最常用的方法是限制培养基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量过低可造

培养基的类型及应用

培养基的类型及应用培养基种类繁多, 根据其成份、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。 1．按成份不同划分 (1)天然培养基(complex medium) 这类培养基主要以化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成, 牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常用的 LB(Luria-Bertani) 培养基也是一种复合培养基,其组成见表4-10。常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏( 表4-11 ) 、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡罗卜汁、椰子汁等, 嗜粪微生物(coprophilous microorganisms) 可以利用粪水作为营养物质。复合培养基成本较低, 除在实验室经常使用外, 也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。 (2)合成培养基(synthetic medium) 合成培养基是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基(chemically defined medium), 高氏1 号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强, 但与天然培养基相比其成本较高, 微生物在其中生长速度较慢, 一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。 2．根据物理状态划分根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少, 可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。 (1)固体培养基(solid medium) 在液体培养基中加入一定量凝固剂即为固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件:1. 不被所培养的微生物分解利用;2. 在微生物生长的温度范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌时,由于高温容易引起培养基液化, 通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题;3. 凝固剂凝固点温度不能太低, 否则将不利于微生物的生长;4. 凝固剂对所培养的微生物无毒害作用;5. 凝固剂在灭菌过程中不会被破坏;6. 透明度好,粘着力强;7. 配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂(agar) 、明胶(gelatin) 和硅胶(silica gel) 。表4-12 列出琼脂和明胶的一些主要特征。对绝大多数微生物而言, 琼脂是最理想的凝固剂, 琼脂是由藻类(海产石花菜) 中提取的一种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物, 是最早用来作为凝固剂的物质, 但由于其凝固点太低, 而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶, 目前已较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠(Na2SiO3) 及硅酸钾(K2SiO3) 被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体,它不含有机物, 适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外, 一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基。例如, 由马铃薯块、胡罗卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类。如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉子壳培养基。在实验室中，固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面，单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖，可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。