间充质干细胞

间充质干细胞通过大动脉内皮细胞时表现稳定的粘合性，表面分布不均、分散性及跨迁移的特征即；趋化因子与切力效应

作者：Giselle Chamberlain, Helen Smith, G. Ed Rainger, Jim Middleton 摘要

间充质干细胞具有抗炎症，抑制免疫力的性质，或许在如动脉硬化这样的疾病治疗中发挥作用。间充质干细胞能够进入炎症细胞，然而为了在临床上运用，人们需要阐明他们迁移机制。本研究探究了鼠类间充质干细胞与其迁移到小鼠动脉内皮细胞的相互关系，以及趋化因子，剪切压力的效应。通过生理流动条件实验研究鼠类间充质干细胞与MAEC 的相互作用，鼠类间充质干细胞在连续流动条件下没有表现出相互作用。然而，当流动停止十分钟，再开始，鼠类间充质干细胞慢慢的附着在内皮细胞表面，延展成良好的微绒毛过程（丝足）。然后他们以不同方向散布在伸展的丝足。CXCL9显著提高了鼠类间充质干细胞的附着、表面非均匀分散及扩散的比例，剪切压力明显刺激了后两者。间充质干细胞通过鼠类动脉内皮细胞过程中，CXCL9, CXCL16, CCL20 和CCL25 明显增强了跨内皮迁移。小鼠间充质干细胞的跨迁移抑制受体CXCR3，CXCR6, CCR6 和CCR9. 本研究促进了对间充质干细胞内皮跨迁移，趋化因子、剪切压力的效应的了解，这与如动脉硬化的炎症息息相关。

介绍

间充质干细胞分化成许多不同的细胞谱系的能力，如同他们抗炎及免疫方面的特征，都没有伦理上的争议；培养相对容易使得间充质干细胞在许多炎症与损伤的治疗中成为一种理想的干细胞来源[1]。间充质干细胞能够在动脉硬化的抗炎治疗中发挥作用，有报道用培养的间充质干细胞治疗心肌梗塞[2–4]；同样，在像中风，脊椎损伤[5,6]、脑脊髓炎[7]、辐射损伤[8]、皮肤损伤[9]和移植物抗宿主疾病情况[10]，间充质干细胞发挥潜在作用。虽然在治疗像非愈合骨折这样的特点疾病下[11]，间充质干细胞定向移动发挥作用，但是它也与间充质干细胞周身侵泡配合问题有关，如钙化与组织损伤[12]。周身移动带动多向移动，而且可能比定向传递更少发生侵略性的过程。为了通过周身递送直接治疗动脉硬化，间充质干细胞需要横穿动脉内皮进入组织发挥抗炎效应，然而通过这样途径间充质干细胞迁移、移植并不非常有效[13]，还需要了解间充质干细胞从血液到组织是怎样迁移的，以至于这样的补充过程能够减少炎症的发生与增强组织修复。

我们已经非常了解多层附着的白血球及这些细胞是如何从循环中迁移到炎症组织中的[14,15]。白血球在细胞内皮表面进行一系列相互作用，如结合，旋转，激活，捕捉，传递，蠕动，接着进行跨内皮迁移。然而，我们不知道间充质干细胞是否与内皮细胞发生相似的作用，也不知道哪些因子调控跨内皮迁移。除此之外，间充质干细胞与内皮细胞相互作用在循环中产生生理作用即流体剪切压力需要得以解决，因为这队白血球非常重要[16].

趋化因子受体与配体是重要的组分涉及在白血球细胞移动到炎症位点，最近我们阐明了在标准Boyden-type 小室中，用去掉内皮细胞后，鼠类间充质干细胞上不同趋化因子受体的功能表达。我们和其他人报道了[17–22]在人类间充质干细胞中趋化因子受体表达，其中与一些鼠类相同（如CXCR3,CXCR6 和CCR9因子）。我们了解有许多白血球附着分子参与细胞横穿内皮组织的迁移过程，有报道其中一些在间充质干细胞上表达

[23,24]。对间充质干细胞附着内皮组织产生重要功能的附着分子对群有CD44, VCAM-1及其相反配基VLA-4和其他b1结合蛋白[25–28]。然而，人们很少了解间充质干细胞内皮反向迁移的机制与趋化因子在驱动这种机制上的作用。最近有两个研究实验探究了在体外静态条件，通过内皮细胞与间充质干细胞的共培养下跨内皮迁移过程[27,29]。他们都发现当内皮细胞被炎症细胞因子刺激，间充质干细胞表现了形态学的变化及与内皮单层细胞结合。他们也发现间充质干细通过原生质突起进入内皮细胞，分泌MMP-2（基质金属蛋白酶）,它是一种促进造血干细胞运输的基底膜上退化膜酶[30]。

现在研究的目标致力于研究鼠类间充质干细胞附着于鼠类大动脉内皮细胞的趋化因子效应与剪切力效应。第一次发现与内皮细胞接触时间充质干细胞扩散蠕动，并在趋化因子刺激与剪切力作用下，得以增强。趋化因子也促进鼠类间充质干细胞横穿大动脉内皮细胞的跨内皮迁移，这将下调被迁移的趋化因子受体细胞。我们先前提到了小鼠间充质干细胞表达存在于人间充质干细胞一些相同的趋化因子受体。[17],因此进一步研究选择性趋化因子受体的作用，这些小鼠间充质干细胞可成为在动脉硬化与心肌梗塞体内模型中一种有用的模型。

方法:

分离与扩培养小鼠间充质干细胞

小鼠间充质干细胞从6-10周大小的小鼠获得，按照相关文献方法分离[17,31] ,这种符合伦理学方法来自英国欧斯威特的RJAH医院。简单来说，骨髓来自长骨中，细胞来自细胞分离培养基(RPMI-1640 (英国龙沙公司) ，培养基中含有9%FBS，9%血清（两者皆来自英国杰生公司）并在37℃，5% CO2.。在24小时后没有附着的细胞被去除，四周后，细胞在含有9%FBS，9%马血清的完全扩大培养基(CEM) (Iscove Modified Dulbecco Medium(Lonza)以每平方厘米一百细胞涂布来扩增间充质干细胞。这些细胞对CD105具有95%的活性，而对CD45和CD34完全失效[17].当在成骨或脂质培养基生长时，分别对碱性磷酸酶与胞内脂质产生活性[17]。

小鼠内皮细胞的培养

小鼠动脉内皮细胞株来自日本鹤见牙医大学Hiroko Inoue博士的馈赠。此细胞株以缺失p53的小鼠动脉上获得的[32]。细胞株拥有内皮细胞的表型，微贝尔-帕拉德小体，内皮组织标记和粘合分子。此外，TNFa促进淋巴细胞附着在小鼠动脉内皮组织上，以此提供了在体外研究炎症与白细胞迁移的模型。在199培养基(英国sigama公司) 37℃，5% CO2培养生长细胞，培养基中含有5%FBS，1U/ml肝素纳和5ng/ml小鼠VEGF （派普泰克公司）。培养基每3-4天更换一次。

从LGC公司的Promochem (ATCC)(英国物理研究所) 购买了脑内皮细胞株，并起先从BALB/c系小鼠脑部内皮瘤分离得到[33,34]。通过观察凝血因子的表达与摄取的荧光标记的低密度脂肪确定该细胞的内皮性质。内皮细胞表达的其他分子也通过像CAM-1 and VCAM-1这样的细胞稳定表达，或者受到肿瘤坏死因子或脂多糖刺激而减少。比如E-选择蛋白与P-选择蛋白生长在添加有抗体与10%FBS的DMEM 培养基上(Lonza)

流动估测

小鼠动脉内皮细胞接种在Ibidi 载玻片(Wolf laboratories,Pocklington, UK)，生长聚

集，在37℃，用100 ng/ml 的小鼠TNF因子刺激16个小时。然后用基质清洗；用100 ng/ml 小鼠CXCL9(MIG) 处理30分钟(Peprotech)（此步骤选作）。在37℃注射器泵以一定的速率吸取载玻片液体以进行流量分析，同时通过相对的显微镜观察可以见到载玻片中细胞[35]。

在没有血清的培养基上小鼠间充质干细胞以(1*106/ml) ，0.1Pa，4分钟灌注微管中，然后用基质以同样的流速清洗15分钟。记录影像过程分析间充质干细胞的行为。小鼠间充质干细胞也以4*106/ml添加到微管中，然后无血清的培养基以0.1pa进行2小时的灌注。自始至终每15秒拍摄照片来检查间充质干细胞与内皮组织的相互作用。

跨内皮趋化性试验

具有8mm孔径滤膜器涂有来自Sigma公司的人类质粒的纤练蛋白(4 ug/ml in PBS) ，转移至24槽平板用sigmacote处理，以避免附着迁移的细胞。将近4*105小鼠动脉内皮细胞将接种在每一个半透膜过滤网上，以100%聚集两天，再用无血清基质上的小鼠TNFa 因子在37℃培养4小时来激活该细胞。留下三个没有刺激的样作为对照。用含有8 mm Calcein-AM (Molecular Probes, Invitrogen)的pBS在37℃培养30分钟可获得小鼠间充质干细胞。同时，含有（或无）小鼠CXCL9 (MIG), CCL20 (MIP3a), CCL25 (TECK) 和CXCL16 (Peprotech)培养基以不同的比例添加到具有24孔的平板上的滤膜器，每种条件做三次重复。

600,000 小鼠间充质干细胞添加到每一个滤膜器的上层37℃在无血清培养基悬浮，平板放置在37℃，5% CO2 和90% 湿度过夜16小时培养。已经迁移至底层的小鼠间充质干细胞的数目用FLX800微板荧光阅读器(Bio-tek Instruments Ltd, Potton, UK)（本设备已建立荧光与细胞数比例的标准曲线）来计算。

所使用的每一个趋化因子数目是10 ng/ml。这是基于先前所作的实验(0–1000 ng/ml) 即在Boyden-type趋化性评估中使用同样小鼠间充质干细胞[17]。结果显示特别能刺激间充质干细胞迁移的最有效浓度是10 ng/ml 或100 ng/ml；低于10 ng/ml或高于500 ng/ml 的趋化因子不能刺激迁移[17]。因此，在目前跨内皮迁移实验中使用10ng/ml和100ng/ml 的趋化因子，发现前者浓度对刺激间充质干细胞效果明显而后者产生重要结果。

液式细胞计检查

来自跨内皮趋药实验或从含有胰蛋白酶与EDTA的烧瓶中分离得到的间充质干细胞在4℃在PBS与2%BSA的缓冲液中重悬60分钟。缓冲液中含有10%的血清来阻止非特异结合。通过台盼蓝鉴定到细胞具有超过95%的活性。用饱和合适的含有第一抗体的缓冲液的间充质干细胞在冰上放置30分钟培养，清洗。再用合适的第二抗体进行染色。放置冰上30分钟后清洗；最后用链霉亲和素与聚乙烯共轭标记染色30分钟[17]。

作为阴性对照，细胞也可用相同类型免疫球蛋白替代先前的抗体进行染色，同上文所述第二抗体与链霉亲和素相同。抗体有抗鼠CCR6,CCR9，CXCR3，CXCR6因子，小鼠IgG2a和IgG2b 阴性对照，(英国阿宾顿的安迪生物公司) ；生物素化的抗鼠免疫球蛋白和链霉亲和素与聚乙烯共轭物（来自英国牛津的BD Pharmingen公司）。在跨内皮趋化因子实验中，间充质干细胞对每个趋化因子受体活性百分比由在FITC/FL1 通路中钙黄绿素标记细胞所决定，这种控制也用于在免疫球蛋白对照后平均荧光强度。

统计

为了了解小鼠间充质干细胞在在趋化因子存在下跨内皮迁移在机制，我们使用方差分析，方差分析用一系列合适数据对比，用Dunnett测评来作为对照。在通过影像数据分析小鼠间充质干细胞附着百分比时，蠕动，扩散，非配对T测试用来与趋化因子处理对照进行比较。

结果

在剪切流条件下，小鼠间充质干细胞与活化TNFa的内皮组织间的相互关系。载玻片上接种小鼠动脉内皮细胞，用100 ng/mlTNFa刺激。

间充质干细胞以0.1 Pa流过载玻片，这是一个生理流动速率过程，如同白血球在毛细血管后微静脉中的流动或在动脉循环中低剪切环境（这种环境下易产生动脉硬化）。观察间充质干细胞与内皮组织的任何相互作用。小鼠间充质干细胞流过载玻片四分钟后，没有出现间充质干细胞与内皮组织的相互作用。在用TNFa（或没有TNFa)处理细胞后，没有观察到间充质干细胞继续迁移或附着在内皮层。我们将重复这个实验，用活化的TNFa （或没有TNFa）的小鼠动脉内皮细胞添加100 ng/mlCXCL9, CXCL16, CCL20 a和CCL25趋化因子处理30分钟（或不添加任何细胞因子）；选择这些趋化因子是因为他们是先前在小鼠间充质干细胞上所示的趋化因子的配体[17]。这一次，在用上述处理后(影片S1)，也没有见到小鼠间充质干细胞与内皮组织的作用。这个过程的流速也减慢到起速度的一半以下，例如0.15 ml/min (0.05 Pa, 0.5 dynes/cm2)，但是小鼠间充质干细胞没有继续前进或附着在内皮组织上，不管有没有趋化因子的存在。同样，在流动情况下，用小鼠脑内皮细胞，bEnd.3 细胞替代小鼠动脉内皮细胞，也没有间充质干细胞在上述细胞上的移动与附着。

下一间充质干细胞将添加到小鼠动脉内皮细胞上（单独用100ng/mlTNFa刺激16h或用存在CXCL9趋化因子，100 ng/ml TNFa 处理30分钟。在静止的情况下10分钟后留下这些细胞，然后流量以0.1 Pa (1 dyne/cm2）启动进行2小时。间充质干细胞显现为圆形，逐渐将阐明内皮细胞的背景(图一）。当流动开始，残留有76%的间充质干细胞紧密的附着在用单独TNFa处理的内皮细胞上，然而用CXCL9和TFNa处理的内皮细胞有94%的间充质干细胞附着于上，这一个结果比存在趋化因子差异显著（P=0.04）（图二）；间充质干细胞其余部分已分离或流走。在接下来超过两小时的流动中，70%的间充质干细胞附着在用TFNa处理的内皮细胞上，并蠕动；然而有94%的间充质干细胞在存在CXCL9 和TNFa的内皮细胞上附着蠕动，总结果相对于趋化因子有明显的增加(p = 0.02) (图2)。蠕动是间充质干细胞的特点，呈现持续明亮，圆形，在内皮细胞上表面横向运动，伸展成良好的微绒毛形成过程（或伪足）(图1; 视频S2 and S3).这些丝状伪足迅速移动并与间充质干细胞连接，像千足虫的爬行。定量分析显示在蔓延之前，小鼠间充质干细胞在分别用TNFa或CXCL9/TNFa 处理下，蠕动距离分别为23+6 mm 和21+2 mm （平均值+在每种情况下三个独立实验的标准差），在这个测试值之间没有显著差异。在单独存在TNFa时，37+7%的间充质干细胞蠕动方向与流动方向相反，在用CXCL9/TNF处理下，有65+9%的相反，36+9% 的同流动方向相同（数据是平均值+在每种情况下三个独立实验的标准差）。就TNF 和CXCL9/TNF两种处理和蠕动方向，这些测量值没有明显差异。

图一：流动实验视频的静态图片说明小鼠间充质干细胞在小鼠动脉内皮细胞上的蠕动。

小鼠动脉内皮细胞经TNFa处理，添加小鼠间充质干细胞，放置10分钟。然后开始流式处理，持续2小时，视视频记录。流动的方向用白色大箭头显示。A,显示的是在开始有剪切压力后，有TNFa刺激的小鼠动脉内皮细胞的一张低分辨率图，其上有处于附着阶段的明亮间充质干细胞(见视频2）。B—F位于A图右下方，显示的是间充质干细胞的具体情况。B是一开始进行剪切压力的状态，C,D,E,F分别是流动30分钟，60分钟，80分钟，120分钟的状态。用星号标注是作为参考来说明在这段时间后间充质干细胞的蠕动，在120分钟后（F)细胞停止蠕动，开始蔓延，进入隐蔽期。在间充质干细胞周围边缘可作为隐蔽期微绒毛形成（伪足）（箭头处），即在内皮细胞表面间充质干细胞蠕动期间延展。从视频2中提取数据，代表3个独立实验。白线在A图表示100mm.在B—F 图表示20mm.

图2，在小鼠动脉内皮细胞附着与蠕动的小鼠间充质干细胞百分比

有TNFa激活的小鼠动脉内皮细胞用CXCL9培养（或无CXCL9),然后添加小鼠间充质干细胞放置10分钟，接下来对小鼠动脉内皮细胞进行2小时的录像。影像如图一所示。小鼠间充质干细胞进行相同处理，除了在两小时期间停止流动（带状）。数据为三个独立实验的平均值（+标准差）（文章编号7-9），与趋化因子对照相比，p<0.05。相对在流式条件下相同处理下，p<0.001 。

然后间充质干细胞伸展，成为模糊形状阶段，宽阔的伪足想多个方向伸展开来，通常使间充质干细胞成为星状（图三，视频3),蠕动的间充质干细胞中有29%延伸到用TNFa 处理的小鼠动脉内皮细胞，然而在用TNFa与CXCL9处理的小鼠动脉内皮细胞上有70%的蠕动间充质干细胞（图四）。相对于缺少CXCL9，间充质干细胞百分比在存在CXCL9因子下有显著的增长。(P>0.001)接着检验流式对小鼠间充质干细胞在小鼠动脉内皮细胞上的蠕动与延伸的影响。小鼠间充质干细胞添加到内皮细胞，然后在静止状态放置10分钟。流动仅开启15秒来去除非附着细胞。然后停止流动，附着细胞经过两小时的录像，记录蠕动，延伸行为。就蠕动而言，在缺少流动下，仅仅有3% 的附着间充质干细胞在有TNFa处理小鼠动脉内皮细胞上蠕动，添加CXCL9后8%间充质干细胞的蠕动（图2）。这些值比存在流动情况有明显的下降（每种情况下p<0.001)，总计分别有24倍与12倍的减少。就扩散而言，没有流动下，TNFa处理的内皮细胞上有8%的间充质干细胞扩散，这与存在流动情况下（有28%）并没有明显的不同（p=0.08）（图四）。添加有CXCL9因子，小鼠间充质干细胞在无流动下只有7%的扩散，这与存在流动下70%的数值存在明显的下降，共计有10倍的减少(p<0.001)(图四）

在趋化因子的作用下，穿过内皮层的小鼠间充质干细胞有所增加。

为了验证小鼠间充质干细胞是否穿过内皮细胞，在滤膜器的滤膜上培养小鼠动脉内皮细胞。在用小鼠TNFa处理小鼠动脉内皮细胞后，在下层培养液用10ng/ml CCL20,CCL25, CXCL9 或CXCL16（或者没有趋化因子的培养基）进行趋化因子的分析实验。保留三个孔不作处理作为对照。计算那些在滤膜器系统中每一个孔中迁移横穿内皮组织的间充质干细胞的数目，建立荧光与细胞数目相关的标准曲线，选择使用钙黄绿素标记的同一类型的小鼠间充质干细胞进行分析。每种条件重复三次，每一个孔使用三个荧光阅读仪来计算迁移的细胞数目。

小鼠间充质干细胞迁移横穿过经TNFa刺激的小鼠动脉内皮细胞进入下层培养液中的细胞数目在没有趋化因子处理的经TNFa刺激的小鼠动脉内皮细胞（每一孔平均值为91785个细胞），既没有趋化因子又没有TNFa刺激的小鼠动脉内皮细胞每一孔平均值为94868.

由于以下因子的作用有明显的提高，在CXCL16作用下，(每一孔平均值为143807 细胞), CXCL9作用下(每一孔平均值为153083细胞）,在CCL20作用下(每一孔平均值为154894 细胞)，在CCL25作用下(每一孔平均值158640 细胞)（图五，有四种趋化因子与TNFa，相比于没有趋化因子的TNFa或只有培养基，P=<0.001).

图三：流式分析实验录像中的静态图像说明接触小鼠动脉内皮细胞后小鼠间充质干细胞的扩散。TNFa刺激小鼠动脉内皮细胞后，用CXCL9培养。然而添加小鼠间充质干细胞，放置十分钟，拍摄2小时候制作成视频。A-D显示的是相同的间充质干细胞在TNFa刺激的动脉内皮细胞上存在大量CXCl9因子的情况（截取与视频3）。A 显示的是流式开始后30分钟后圆形阶段的明亮的间充质干细胞。B是六十分钟后细胞延伸出伪足（箭头所指）。C和D表示在90分钟和120分钟时细胞向多个方向延伸的不定形态阶段。从视频3中三个独立的实验中获得相关数据。在每个图中，白线代表20mm.

对迁移的小鼠间充质干细胞的分析

通过细胞计数器来分析迁移或非迁移的小鼠间充质干细胞在趋化因子受体表达的情况，趋化因子受体与在试验中所用的趋化因子是相对应的。为了研究是否是因为移植的原因基因表达有所改变。趋化因子受体CXCR3, CXCR6, CCR6 和CCR9就他们的平均荧光强度和活性细胞百分比而言，发现他们与那些留在上层培养液中细胞相比，可以下调迁移的细胞（图6和表格1）。对CXCL16反应的迁移的小鼠间充质干细胞对CXCR6有20%的活性，平均荧光强度是10，而在上层培养液中细胞对CXCR6有55%的活性，平均荧光强度为20。对CXCL9反应的迁移的小鼠间充质干细胞对CXCR3有46%的活性，在上层对CXCR3有89%活性。平均荧光强度是25比117.对CCL20反应的迁移的小鼠间充质干细胞对CCR6有53% 的活性，相比下，上层培养液上的细胞对CCR6有91%的活性，平均荧光强度是33比198.而对CCL 125反应的迁移的小鼠间充质干细胞对CCR9

具有51%的活性，相比下上层细胞曾有88%的活性。平均荧光强度是46比97.

图四，接触小鼠动脉内皮细胞扩散的小鼠间充质干细胞的百分比

小鼠动脉内皮细胞经TNFa刺激，用CXCL9处理（或不加CXCL9）。加入小鼠间充质干，放置十分钟，接着对小鼠动脉内皮细胞录像2小时，视频记录如图3（白条).小鼠间充质干细胞进行相同的处理，不同的是在2小时期间停止流动（条状）。数据来源三个间充质干细胞独立实验的平均值（+标准差）（文章号7-9）,与没有趋化因子的对照，p<0.05.与流动情况下相同处理相比，P<0.001。

讨论

目前研究显示在于小鼠动脉内皮细胞相互作用下，小鼠间充质干细胞显示出附着蠕动，延伸的行为，通过CXCL9因子都可以得到增强。间充质干细胞处理内皮细胞，按照处在没有剪切压力数分钟后开始流式处理，可以发生这样的相互作用。然而在持续剪切压力流动条件即在两种不同的内壁压力(0.1 and 0.05 Pa (1 and 0.5dynes/cm2))下，我们没有观察到在小鼠动脉内皮细胞或在经TNFa或（且）趋化因子刺激的bEnd.3 内皮细胞上有俘获或继续移动的小鼠间充质干细胞或。与白血球形成对比，例如中性白血球在相同的体外流式实验中出现旋转行为[35]。没有旋转的间充质干细胞和可能与与选择素L,P，E的相对应配基的糖蛋白基1以及可结合位于白细胞表面的配体的糖类这些物质没有表达相关，说明间充质干细胞不能与选择素P,E进行结合没有作用[13,25,36,37]。这样的配对配基在所有的白血球中均表达，通过与内皮细胞上的选择素作用介导白血球连级附着的旋转过程[14]。其他人也发现在间充质干细胞在体外流式情况下对激活或非激活的人脐静脉内皮细胞也没有旋转的现象。有研究表明在人脐静脉内皮细胞有滚动的间充质干细胞，然而旋转速度很高，在0.1–1.0 dynes/cm2 剪切压力速度为100-500mm/s[13,25]。白血球在剪切压力达到4 dynes/cm2 时通常以5mm/s旋转[28]。

图5，在趋化因子作用下，小鼠间充质干细胞跨内皮层的迁移

图表显示的用荧光标记间充质干细胞细胞数目，这些细胞是那些生长在滤膜器上通过小鼠动脉内皮细胞层迁移到下层中的细胞。小鼠动脉内皮细胞用TNFa处理，存在CXCL16, CXCL9, CCL20和CCL25 (每一种趋化因子为10 ng/ml).也可没有TNFa和趋化因子的处理。数据表示在三个独立实验中平均值+标准差，每个实验重复三次。与存在TNFa,没有趋化因子的对照相比，*p<0.0001。

有两个潜在的机制来解释间充质干细胞在溢出过程是怎样在脉管系统中减少的[13]。首先，他们大的体态减少了他们的速度，因为与更狭窄的毛细血管的物理作用，导致了他们被捕获和被动的滞留。当静脉注射间充质干细胞，甚至在没有组织损伤与炎症这样的正常情况，他们被器官捕获，例如肺，这也是因为他们很大[39]。其次，与白血球相似，间充质干细胞有活跃的限度，在活化的脉管系统上继续移动，进而导致了被捕获，稳定的附着了。我们的结果与第一种机制相符合，暗示在捕捉与稳定的附着之前，拥有像白血球一样的旋转，并不是一个必要地先决条件。只要间充质干细胞减慢下来或静止一段时间，间充质干细胞就有能力使趋化因子出现与有稳定的附着力，接着是蠕动和伸展。

在治疗动脉硬化中当血流停止一段时间，有几个临床情况。比如在冠心病搭桥术和血管形成术手术期间动脉中气囊导管出现膨胀，上述的问题就会发生。在用干细胞治疗动脉硬化中，值得注意的是血流停止后再流动这样的周期对干细胞的补充并没有害处。另外，即使在动脉硬化疾病中在动脉血管中小血管里的间充质干细胞减少了，也对干细胞的补充是绰绰有余的。

图6 迁移的小鼠间充质干细胞显示趋化因子受体低水平表达。柱状图显示在跨内皮趋化因子实验后在transwell小室的上层与下层上趋化因子受体在间充质干细胞上的表达。每一图柱图表示活性的间充质干细胞的百分比与平均荧光强度。线性图表表示免疫球蛋白的对照。柱形图表示趋化因子受体抗体的结果。数据代表一个典型实验的结果。

.表格1 穿越内皮细胞层后在transwell小室中趋化因子受体在小鼠间充质干细胞上抑制作用。

从图6获得数据结果，a表示平均荧光强度。

在目前研究中停止血流几分钟后再启动流动导致在内皮细胞表面的间充质干细胞抵抗剪切的滞留。这实际上会导致所有的间充质干细胞(94%)在趋化因子的存在下持续附着。整合蛋白如VLA-4可能参与稳定附着过程，因为间充质干细胞使之表达，这个过程也介导V-CAM附着在内皮细胞表面。[25,26,28]，不过这可能取决于间充质干细胞的组织来源[36]。CXCL9增强间充质干细胞对小鼠动脉内皮细胞的稳定附着这一发现表明这种趋化因子出现在间充质干细胞中导致整合蛋白活化的刺激和增加了这种附着分子与其内皮配体的亲和性。在这一方面整合蛋白的活化对趋化因子发挥了根本的作用，增强了白血球细胞对内皮组织的坚实附着性[14]。

在白血球细胞的例子中，他们在捕捉那一刻并没有非得迁移，而是横行移动或蠕动到跨内皮的适宜位置[40]。体外的淋巴球延伸出丝状伪足，在内皮细胞表面经历千足虫一样的蠕动，这一过程可通过外来的趋化因子增强[41]。在现在的研究中间充质干细胞也延伸出良好的丝状伪足或微绒毛，经历千足虫般的蠕动，此外，外加的CXCL9增加了蠕动的间充质干细胞的百分比。他们能够逆流或顺流于流动方向，这一现象也在中性白细胞中有所报道[42],其蠕动的距离与白血球细胞在体外蠕动的距离相似，大约是20mm[40]。在间充质细胞蠕动后，是扩散。形态由圆球状变成平整型的，通常是放射状。在这一方面扩散也是迁移的白血球的特征[14,43].与其他参数相比，外来的CXCL9能够特异的增加扩散的间充质干细胞的数目。扩散的特点是伪足向多个方向延展。这样的结构类似于原生质体，原生质体也是人类间充质干细胞在静止情况下雨培养的内皮细胞相互作用上有说明。

在目前研究中流式实验中用TNFa预处理的内皮细胞可以上调他们附着分子与趋化因子的表达。与不添加CXCL9相比，添加外来的CXCL9增加了间充质干细胞在内皮细胞上的附着，蠕动和扩散，显示这个趋化因子的明显的效果。然而，这并不能排除内皮产生的趋化因子也有效果，用像肝素这样的物质来替代上述趋化因子可以更好地了解CXCL9的作用。有趣的是，Transwell迁移试验中，相同的内皮细胞只用TNF处理在附着与跨迁移上好像没起什么作用，因为在有或没有TNF，迁移的间充质干细胞数目都是一样的。

因流动产生的剪切力增加了白血球在内皮细胞上的俘获[44,45]。这表明在上述过程通过激活整合蛋白由剪切力介导产生，而整合蛋白的激活与趋化因子的作用又相关。间充质干细胞对剪切的作用特别敏感，当在蠕动和扩散阶段流式停止时，那些蠕动与扩散的间充质干细胞的数目明显减少。，蠕动的间充质干细胞的百分比从在没有流式情况下3%增长到有流式的71%，在既有流式又有趋化因子的条件下，增长到94%。这显示除趋化因子外，流式是一个主要的影响因素。同样，由于剪切力的作用，扩散也明显增加了，扩散的间充质干细胞的百分比从7%增加到70%（存在趋化因子）。因此，当间充质干细胞在循环中起作用，流式的影响需要考虑到治疗策略的设计中。

在疾病模型中有许多体内研究，人们发现进入循环的间充质干细胞可以移植到受影响的组织中，尽管效率很低[1,13]。例如这一过程发生在心肌梗塞以后，这时间充质干细胞补充到心脏中能够可以带来临床的疗效[1,46]。然而，很少研究去研究间充质干细胞的这种迁移。Steingen等人[27]报道间充质干细胞可以通过VCAM/VLA-4穿过没有活化的内皮单层膜，不同于观察白血球时经历完全的溢出，间充质干细胞倾向于整合到内皮细胞膜上，可能成为嵌入性细胞。目前研究显示间充质干细胞可以完全穿过内皮细胞层，进入transwell小室底层。这一过程可以通过趋化因子CXCL9, CXCL16, CCL20 和CCL25得到增强。这些趋化因子之所以被选择是因为他们是CXCR3, CXCR6, CCR6 和CCR9 受体的配体，这些受体在本研究中在小鼠间充质干细胞上特异表达[17]。这些趋化因子在效果上显示出特异性，因为当缺少趋化因子是（空白对照时），跨移的间充质干细胞明显减少。另外，与对照相比，单独使用TNF并不能增强间充质干细胞的迁移，进一步表明了这些趋化因子反应的特异性。在我们先前的研究中[17]，即在使用Boyden趋化性法实验，相同类型的小鼠间充质干细胞在缺少内皮细胞中趋化因子CXCL9, CXCL16, CCL20 和CCL25 ( 10 and 100 ng/ml)条件下引起了迁移反应，而CXCL12没有此现象。

这更一步显示趋化因子对间充质干细胞的迁移反应与的特异性。

在Boyden小室的小鼠间充质干细胞趋化因子反应比较敏感，从峰值从10ng/ml到100ng/mg.低于或高于这个浓度，就不会发生趋化反应[17]。在CCL25中，当使用其他类型细胞时，如人类细胞株细胞要求更高地浓度来刺激趋化反应（例如1500ng/ml)[47]。在目前跨内皮迁移研究中，10ng/ml的趋化因子将对小鼠间充质干细胞迁移产生显著影响。这进一步说明小鼠间充质干细胞对由趋化因子刺激的迁移具有相对的敏感性，尽管相比趋化性的滤膜，内皮细胞的效应也能增加迁移机会。

此外，间充质干细胞穿过内皮细胞时的附着，跨移之后，基因表达有所改变，趋化因子受体被抑制。诱导的配体受抑制通过内化作用与内吞作用很好说明了白血球趋化因子受体的特点[48].在间充质干细胞的抑制说明这些细胞一旦迁移至内皮细胞及组织中，趋化因子受体的表达会减少或诱发不同光谱的趋化因子受体在组织环境中产生。如淋巴细胞所显示的[49]，在组织中影响更多的定位。

总之，来自本研究的模型如间充质干细胞所预期的那样有积极与消极两方面[13].当间充质干细胞穿过毛细血管时，干细胞速度的消极减慢或停滞，这会产生趋化因子，整合蛋白活化，捕获，稳定的附着，蠕动及扩散。间充质干细胞在在固定的趋化因子引导下迁移至血管外组织。因为报道CXCR3和CXCR6在动脉硬化中对T细胞和单核细胞很重要[50,51],间充质干细胞还能用这些受体进入病变部位。此外，控制间充质干细胞上这些受体的表达可以增加补充系统，可在动脉硬化中有治疗性的好处。

后记：

视频1中的小鼠间充质干细胞是在用TNFa刺激小鼠动脉内皮细胞，在连续流动4分钟后，添加外来的CXCL16的状态。小鼠间充质干细胞与内皮细胞层没有相互作用，因为间充质干细胞看起来模糊不清的条纹，这个视频代表三个独立实验。扩大200倍。

视频S2间充质干细胞与TNFa刺激的小鼠动脉内皮细胞相互作用。间充质干细胞与内皮细胞在没有流动情况下培养十分钟。然后启动流式反应，持续2小时。该视频显示附着的明亮阶段的间充质干细胞在流式时经历了蠕动，延展成无数的微绒毛（可以在内皮细胞表面上迅速改变）。一些间充质干细胞扩散进入模糊期。视频来自三个独立实验。白线为200mm.

视频3是间充质干细胞与小鼠动脉内皮细胞（TNFa处理）与外来的CXCL16的相互作用。间充质干细胞在非流式情况下与内皮细胞共培养10分钟。然后启动流式反应，持续2小时。视频显示附着的明亮阶段的间充质干细胞在流式时经历了蠕动，在扩散后进入模糊期。视频来自三个独立实验。白线为200mm.