WB注意事项及常见问题

WB注意事项及常见问题

注意事项

样本收集

组织样本

原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管（根据实验的需要告知他们取多少组织），并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于-80℃保存。具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；

细胞样品

原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是膜蛋白时，具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；

总蛋白提取

组织样品

具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；

细胞样品

具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；

蛋白样本保存

裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片沉淀一般-20℃保存以防万一，提取好的蛋白样品分装2份，一份加入上样缓冲液变性后-20℃保存，一份直接-20℃保存；

蛋白变性

提取好的总蛋白取一部分（不是全部）加入上样缓冲液进行加热变性（100℃，5min），变性好的蛋白应该-20℃保存，冻融后不再需要加热变性；

SDS-PAGE

浓缩胶的胶浓度一般为5%，用于压沉样品；

分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小，详情见Western Blotting 全攻略.pdf第4页；分离胶和浓缩胶的高度比为8:3；

电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；

电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；

清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝；

转膜

注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向；

注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，以免造成短路；

转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题；

转印结束后，应及时冲洗转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；

转印结束后，应及时用水泡洗海绵垫和滤纸，以免盐离子沉积，导致转膜时短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不及时晾干，容易导致海绵垫和滤纸内部的结构破坏；

封闭

1. 进行封闭时，应加入足量的封闭液（以完全覆盖膜为底限），并保证整个封闭过程中，膜与封闭液充分接触，避免长时间离开封闭液，特别进行4℃静止封闭过夜时，一定要加入足

量的封闭液和保证平坦放置；上述注意事项主要为了避免膜变干，导致背景升高；

一抗杂交

一抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整；

杂交条件：如果是室温孵育，至少保证孵育1-2小时，并放置脱色摇床上进行摇晃，如果是4℃孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇晃；

应使用专用的一抗稀释液进行稀释，使用后进行回收并4℃保存，如果回收的稀释抗体用沉淀或长菌，应丢弃；

一抗杂交后洗膜

一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl 的浓度提高到500 nM (标准的为150nM);

一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次；

二抗杂交

1. 二抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整；

2. 杂交条件：一般室温孵育，孵育1小时即可（时间延长会产生非特异杂交，从而导致背景过高），并放置脱色摇床上进行摇晃（一定要避免膜变干，否则背景其高）；

3. 应使用封闭液进行稀释，使用后进行不回收；

二抗杂交后洗膜

1. 一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl 的浓度提高到500 nM (标准的为150nM);

2. 一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次；

拍照

1. 注意选择曝光时间，同时兼顾工作效率，因选择连续拍照模式，这样总有一个何时曝光时间；

报告单整理

原始图片；

对比度和亮度调整的图片；

图片说明：上样顺序；

灰度值：原始值，数据标准化（同一个样品的目标蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值），相对表达量（实验样品的数据标准化比值除以参照样品（问客户）的数据标准化比值），参照样品的相对表达量一定为1；

实验方法：准确的一抗，二抗，稀释比例；

常见问题

没信号

膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效？；重新进行实验，重新稀释抗体；

膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：实验样品降解？实验样品无该蛋白的表达？转膜效率过低？；重新进行实验，复核查找上述原因，以寻找对策；

背景过高

目的条带以外的区域有信号，如果是片状，甚至整块膜，一般是封闭不好，膜变干，一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交导致；如果是条纹状，一般是由于膜上有压痕导致，如果是点

状，一般是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充分浸泡；

杂带

目的带以外的信号条带为杂带，一般由于一抗的特异性不好所导致，如果目的带比杂带信号强，可通过减低一抗的稀释比例，并缩短杂交时间解决；如果目的带比杂带信号弱，在不减低一抗的稀释比例的前提下，缩短杂交时间；并提高TBST缓冲液的NaCl的浓度提高到500 nM；

杂带如果与目的带的位置相距较远，可以不优化实验，直接裁剪即可，杂带如果与目的带的位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳时间，已经采取上述解决方法；

目的带弱

一抗效价低：提高一抗稀释比例，提高杂交时间，减少洗膜次数，提高曝光时间，提高上样量；

转膜效率低：检测转膜试剂和耗材，优化转膜条件；

复合问题