牛血清白蛋白的分离提纯工艺
课程设计说明书
课程名称：生物分离工程
设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺
院系：环境与化学工程学院
学生姓名：孙盼盼
学号：41004020111
专业班级：10级生物工程01班
指导教师：王晓军
2013年6月20日
目录
1.设计任务书 (1)
2.设计背景 (1)
2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1)
2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1)
3.设计原理 (2)
4.设计工艺流程及设计方案说明 (2)
4.1对原材料的粗分级分离 (3)
4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3)
4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3)
4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3)
4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3)
5.操作过程 (4)
5.1蛋白质分离的准备阶段 (4)
5.2细分级分离设备的设计 (4)
5.3蛋白质的纯度鉴定 (8)
6.参考文献 (8)
7.课程设计心得 (9)
1.设计任务书
现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。
2.设计背景
2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介
蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。
蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！
2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义
牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫
键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66200Da，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。
3.设计原理
采用等电点沉淀、凝胶过滤、亲和层析等方法对蛋白质进行分离提纯，对相关分离提纯所需条件可通过与电脑相连的方式进行精确控制，并在此基础设计相关仪器分离提纯蛋白质，在分离提纯过程中运用到的蛋白质一些性质：分子大小、溶解度、等电点、吸附特性等。
根据生物分离原则：先纯化，再脱盐，最后成品加工。初步纯化采用盐析沉淀法，高度纯化采用二维电泳。
盐析沉淀原理：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4.设计工艺流程及设计方案说明
4.1对原材料的粗分级分离
当蛋白质提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般该步分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。
4.2对粗分离成分进行细分级分离
这一步也就是样品的进一步纯化。样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法，还可以选用电泳、等电聚焦作为最后的纯化步骤。
等电聚焦电泳就是使电泳的介质中形成一定范围的pH梯度，电泳时待分离的两性分子可以在这种pH梯度中迁移，直到聚集于与其等电点相同的区域。该技术特别适用于分子量相近而等电点不同的蛋白质分离和分析。
我们在设计完成自己创新的蛋白质电荷分离仪时就是依据等电聚焦的相关原理完成的，因此等电聚焦电泳分离蛋白质就是我们设计分离蛋白质的基本依据。
4.3 蛋白的结晶与重结晶
结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤，结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某些蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。
4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定
蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法，如电泳、沉淀、HPLC和溶解度分析等。纯的蛋白质和还有杂质的蛋白质在电泳等测量时会表现出不同的动向故而能够进行纯度的鉴定。
4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程
工艺流程：动植物组织或细胞，细菌细胞裂解破碎→得到蛋白质提取液→通过盐析、等电点沉淀等方法除去其中的杂质→的到体积较小，杂蛋白较少的蛋白提取液→经过层析、电泳、等电聚焦等方法进一步分离纯化蛋白→结晶→重结晶→纯度的鉴定→纯度过低时重复以上几步操作→得到单一牛血清白蛋白
5.操作过程
5.1蛋白质分离的准备阶段
方法:盐析
其原理由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水变成了盐离子的水化水，那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可以利用的水分子，因此留下暴露出来疏水基团的蛋白质，随硫酸铵的进一步加入，蛋白质疏水基团进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集沉淀。
在上步溶有蛋白质的缓冲液内加入中性盐硫酸铵，随着硫酸铵的加入，当离子浓度足够高时，缓冲液中的蛋白质会沉淀下来，这样就得到了蛋白质的粗提物，这步主要利用了盐析原理。
通过以上两个步骤完成蛋白质的初级分离，为下一步细分级分离做好准备。
5.2细分级分离设备的设计
基于蛋白质分离的准备阶段，对所要的目的蛋白进行分离
创新设计仪器名称：蛋白质电荷分离仪
所设计仪器原理：蛋白质在非等电点溶液中带电，在外加电场作用下会向相反电极移动；蛋白质在等电点时溶解度最低且不带电荷，在外加电场下不会移动。精确控制分离缓冲液的pH，利用电泳作用分离带点蛋白质和不带电蛋白质。
主要过程包括以下两方面要点：a、精确地控制反应容器内液体的pH，b、自由电泳分离带电蛋白质。
所用器材：滴定管、铁架台、夹子、带孔玻璃板、下部带有出口圆形玻璃器皿、磁力搅拌器、pH计、电脑、电极、电源、透析纸袋等。
蛋白质电荷分离仪的主要构成：固定装置、反应装置、搅拌装置、控制装置、电泳装置。
仪器介绍：
a.固定装置
主要组成：铁架台、夹子、玻璃板等
主要用途：用于固定滴定管，方便调节pH的液体（酸、碱、水）的滴加，再者固定与电极相连的电线，使装置处于相对比较稳定的状态。此装置位于分离仪器的最上部。
b.反应装置
主要组成：下部带有出口圆形玻璃器皿、透析纸袋等
主要用途：用于盛装反应液，pH计测定反应液的pH，电泳过程等主要反应过程都在这里面进行。此装置位于分离仪器的中部。
c.搅拌装置
名称：磁力搅拌器
原理: 利用磁性物质同性相斥的特性，通过不断变换基座的两端的极性来推动磁性搅拌仔转动。适用于粘稠度不是很大的液体，或者固液混合物利用了磁场和漩涡的原理，将液体放入容器中后；将搅拌子同时放入液体；当底座产生磁场后带动搅拌子成圆周循环运动，从而达到搅拌液体的目的。
用途：当滴定管液体滴入反应容器时会造成反应液各处pH不均匀，磁力搅拌器将液体搅匀，便于下面pH计的准确测定。
d.电泳装置
组成：电极、电源、电线等
分类：自由电泳、区带电泳
原理：生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E。
用途：达到特定蛋白质等电点时，蛋白质溶解度最低且不带电荷，在外加电场作用下不会向两极移动；其它蛋白质在特定蛋白质的等电点时不是它们自己的等电点，因此带点，在外加电场下会移动。用pH计精确控制分离缓冲液的pH，达到特定蛋白质的等电点，让后自由电泳，将特定蛋白质与其它蛋白质分离开来。
e.控制装置
名称：pH计
组成：一个参比电极；一个玻璃电极，其电位取决于周围溶液的pH；一个电流计，该电流计能在电阻极大的电路中测量出微小的电位差。
分类：1.按测量精度可分 0.2级、0.1级、0.01级或更高精度。
2.按仪器体积分有笔式（迷你型）、便携式、台式还有在线连续监控测量的在线式。
3.根据使用的要求笔式（迷你型）与便携式PH酸碱度计一般是检测人员带到现场检测使用。
原理：用电位法测定溶液的pH值是最基本的方法。电位测量 pH的原理来源于能斯特公式。如把一支对氢离子可逆的电极和一支参比电极放人溶液中，就组成了原电池。由于原电池中参比电极的电位在一定条件下是不变的，那么原电池的电动势的数值就随着被测溶液中氢离子的活度而变。因此，可以通过测量原电池的电动势，计算溶液中的pH值。
操作过程：在带有出口圆形玻璃器皿底部铺上一层透析纸袋，将带孔玻璃板盖在下部带有出口圆形玻璃器皿上，（不易用方形玻璃器皿，因为搅拌时候易造成液体飞溅，容器内已经注有一定pH的缓冲液)，滴定管和电极电线穿过玻璃板孔向容器内滴加液滴（视情况滴加酸、碱、纯水，液滴的量要精确控制，以免pH受到较大波动），在滴加液滴的同时打开磁力搅拌器缓慢搅拌，使溶液各处pH均匀，在此期间经校正的pH计严格监视溶液pH的变化，随液滴的滴加pH达到被分离蛋白质的等电点（之所以没有提前加入被分离蛋白质样品是避免pH波动对被分离蛋白质活性的影响），停止滴加液滴，加入被分离蛋白质样品，再次测溶液pH并且调整溶液pH至被分离蛋白质的等电点。以上操作主要是为了找到被分离蛋白质的等电点，并没有进行电泳操作，上述操作完成后，停止pH计的测量，打开电泳操作进行电泳，由于
被分离蛋白质在等电点pH处不带电，故而不移动，其它带点蛋白质会在电场作用下向相反电极移动（控制电压可以改变带电蛋白质的移动速度），从而分离出目标蛋白质，然后通过下部带有出口圆形玻璃器皿的出口取出被分离液，将透析纸袋取出，获取目标蛋白质，将其储存起来，关闭出口，再换一张透析纸袋，将出口的分离液再次倒进反应装置里，再次打开磁力搅拌器缓慢搅拌，调整pH至刚分离的蛋白质的等电点，然后重复上述操作，进一步分离目标蛋白质，提高被分离蛋白质的产量。
经过上述操作已经分离出所需目标蛋白质，分离完后。
再次调整pH（高于刚分离蛋白质的等电点），让后再加入上述被分离蛋白质的样品，重复上述操作，可用于分离比已经分离出蛋白质等电点高的所需蛋白质，逐次可分离出多种蛋白质。
完成蛋白质的分离之后，清洗仪器（尤其是pH计电极的清洗，必须严格清理），风干被清洗的器皿，以待下次再用。
5.3蛋白质的纯度鉴定
方法：电泳，由于纯的蛋白质所带电荷、相对分子量等都相同，所以纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带，因此据此可以判断出蛋白质的纯度。
N-末端分析也可用于鉴定纯度，因为均一蛋白质的N-末端残基只可能是一种氨基酸。另外也有沉降、HPLC、溶解度分析等方法，但无论任何单一一种方法都只能作为蛋白质均一性的必要条件而非充分条件。
6.参考文献
【1】孙彦．生物分离工程（第二版）．北京：化学工业出版社，2005.2
【2】陈国豪.生物工程设备.北京：化学工业出版社，2009.5
【3】刘叶青.生物分离工程实验.北京：高等教育出版社，2007.8 【4】汪家政，范明．蛋白质技术手册. 北京：科学出版社，2001
【5】谭天伟．生物分离技术．北京：化学工业出版社，2007
7.课程设计心得
经过几周的努力设计，生物分离工程课程设计已经顺利结束了。通过这次课程设计使我了解到了好多知识。生物分离工程是我们重要的一门专业课，学习了各种分离技术之后，这次课程设计将理论与实践联系了起来，为以后的学习和工作打下了良好的基础。
我懂得了，许多知识仍需努力学习，太多的技术仍需刻苦钻研。在设计过程中，有许多问题还不甚明了，虽然最后分离出了目标蛋白，计算出了浓度，但是至于牛血清蛋白的纯度，仍不知如何让下手，让我意识到了自己知识的贫瘠。
总之，通过这次课程设计，我受益匪浅。由于自己知识面和设计水平有限，在设计中虽然解决了一些问题，但是肯定存在不妥或错误之处，希望老师予以批评指正。
牛血清白蛋白的提取与鉴定演示教学
如有侵权请联系网站删除 牛血清白蛋白的提取与鉴定 一、实验目的 1. 掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法 2.掌握盐析法、透析法及电泳法 二、实验原理 牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸铵盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。 三、操作步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（2000r/min）10min，将上清液倾入试管中。 （二）透析（1 ）取干净的比色板，在各孔内滴加一滴纳氏试剂 （2）透析袋未放入水中时，立即取水中液体检查有无NH4+ (3)取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。 (4)每隔2分钟检查一次，更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化并记录，直至袋内盐分透析完毕。 (5)将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。 （三）电泳（1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。标准液点一次，待测液点三次。 （2）电泳将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时膜条无光泽面向下，点样端臵于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将膜条取出。 （3）染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。（4）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。 四、仪器和试剂 仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色板、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、天平 试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2饱和硫酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液 五、预测结果位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。 六、参考文献[1]陆红玲.生物化学与分子生物学实验教程.西安:第四军医大学出版社,2010 精品资料
蛋白质分离纯化的步骤
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析(ELISA)
牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中类牛血清白蛋白残留检测的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛的牛血清白蛋白残留检测水平。用纯化的牛的牛血清白蛋白残留检测抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入类牛血清白蛋白残留检测，再与HRP标记的类牛血清白蛋白残留检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的类牛血清白蛋白残留检测呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛的牛血清白蛋白残留检测浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存 说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存 标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
牛血清白蛋白的提取与鉴定
第八次实验： 牛血清白蛋白的 提取与鉴定 一、实验名称牛血清白蛋白的提取与鉴定 二、实验目的1、掌握盐析法提取牛血清白蛋白 2、掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法 鉴定牛血清白蛋白 3、了解用溴甲酚绿鉴定血清蛋白 三、实验原理1，蛋白质是水化作用较强的高分子物质， 向其加入碱土金属的中性盐类可是蛋白质胶粒脱水并失去 电荷，从溶液中沉淀出来。球蛋白在半饱和的硫酸铵溶液 中可析出，而清蛋白则需在饱和的硫酸铵溶液中可析出。 可将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐， 即可提取白蛋白。2，利用电泳过程中带电粒子的移动速度
与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠 度等有关，可对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。3，血清中 的白蛋白与溴甲酚绿在ph=4.2的条件下结合生成绿色化合 物，溶液由黄色变为绿色，而球蛋白基本不与之反应，缩 短反应时间可去除干扰，其颜色的深浅与白蛋白浓度成正 比，可用于鉴定牛血清白蛋白。 四、实验步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS磷酸盐缓冲生理盐水稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（4000r/min）10min，将上清液倾入试管中。 （二）透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。（三）BCG法鉴定 白蛋白+溴甲酚绿ph=4.2 绿色复合物 或（三）电泳鉴定
蛋白质的分离纯化和表征
蛋白质的分离纯化和表征 第一节蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节蛋白质分子的大小与形状
一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。 按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。 由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量
基本原理： （一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。 （二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
牛血清白蛋白的提取与鉴定 自主设计实验
自主实验设计 牛血清中白蛋白的提取与鉴定 小组成员： 【目的】 1.通过牛血清白蛋白的提取与鉴定，掌握盐析、离心、电泳、及呈 色反应的原理及应用。 2.通过实验掌握实验的基本操作、原理及为以后的学习打下坚实的 基础。 【原理】 本实验用盐析、离心、透析、电泳及呈色反应来分离、纯化及鉴定牛血清白蛋白。首先用盐析初步分离，在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白沉淀下来，经离心后上清液中含白蛋白。第二步用玻璃纸利用透析原理通过不断改变膜内外的浓度差让膜内的盐离子不断溢出达到纯化的目的，得到较纯的白蛋白。第三步利用电泳将蛋白彻底分离。最后，将其与标准膜一起染色，漂洗，进行对比即可达到鉴定的目的。
【操作】 1盐析 取小牛血清0.5ml+PBS液0.5ml+饱和硫酸铵2.3ml，充分混合均匀，静置20min，2500r/min 离心10min。 2、透析 取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），放入有自来水的小烧杯中透析，要不断震动，每隔2min换一次水，换15次。放入试管待用。 3、准备与电泳 1）取两条2.5cm x 8.0cm 的膜条，将膜条无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中冲锋浸透。 2）将充分浸透的两条膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以醋纤膜的光泽面距一端1.5cm处作为点样线，并用铅笔在上面编好号①②。 3）用两个点样器分别在标准液和测定液中櫵一下，点样器下端粘上薄层标准液和样液，然后将点样器竖直，进行点样。 4）电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时点样面向下（无光泽面），点样端置于阴极，膜条与滤纸贴紧，待平衡5min后，即可通电。调节电泳仪，使两极间距的电压为15v/cm，电流0.4~0.6Ma/cm 膜条，通电50分钟关闭电源。 5)通电完毕后，用镊子取出膜条，直接浸于盛有氨基黑10B的染色
蛋白质纯化的方法选择
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
蛋白质的分离纯化方法(参考资料)
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
牛血清白蛋白
BSA牛血清白蛋白 牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。 CAS号：9048-46-8 英文名称：Bovine albumin 英文同义词：nhsa;BSA-C;AC-BSA;ALBUMIN, PIG;albumenpowder;SERUM ALBUMIN;ACETYLA TED BSA;BSA ACETYLATED;Bovine albumin;BSA, METHYLA TED 中文名称：牛血清白蛋白 中文同义词：蛋白粉；牛白蛋白；卵蛋白粉；血清蛋白；血清白蛋白；牛血蛋白质；复合氨基酸；牛血清蛋白；牛血清白蛋白；血清白蛋白（牛） CBNumber: CB5107573 分子式：N/A 英文别名：Bovine serum albumin 化学性质 储存条件: 2-8°C 溶解度: PBS: >40 毫克/毫升 form : lyophilized powder Merck : 13,8542 稳定性：Stable. Incompatible with strong oxidizing agents and strong acids. Refrigerate. EPA化学物质信息：Albumins, blood serum(9048-46-8) 用途 1、用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用作医药保健食品、调味品 3、维持渗透压、pH缓冲、载体作用 4、在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率
蛋白质分离与纯化教学设计课题
蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点
【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。
双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用
牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基。分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。其在血液中的主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，可起到生理和机械保护作用和载体作用。目前，石家庄鼎晨科技有限公司致力于研究牛血清白蛋白的溶液标准物质。此外，纽邦生物科技有限公司也专业提供牛血清白蛋白。 双水相萃取技术主要技术特征是条件温和，两相间界面张力小，生物相容性高，萃取后目标产物的后处理简便，一般不存在有机溶剂残留问题，易于放大工艺，可获得较高收率和纯度，已经在生物化学、细胞生物学以及生物化工等领域得到了广泛的应用。 国内双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用十分广泛。邓凡政等建立了由亲水性离 子液体四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑和KH 2PO 4 形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA) 的新方法，结果表明,磷酸二氢钾盐浓度为80g/L,离子液体浓度在160~240 mL/L,BSA的浓度为30~50 mg/L,溶液酸度在pH 4~8范围,离子液体双水相体系对BSA有较高的萃取率；林潇利用双水相技术萃取牛血清白蛋白回收率为96.90%。结果表明，此方法回收率、重现性好，且适用于牛血清白蛋白和牛血红蛋白混合样品的检测，为蛋白质分离提取提供了一种新思路；田明玉考察了多种单羟基的短链醇/无机盐双水相体系对牛血清白蛋白的萃取能力。结果表明，多种体系对牛血清白蛋白都有较好的萃取效果，在磷酸二氢钾18%（W/W）/乙醇18%（W/W）、碳酸钠13%（W/W）/乙醇18%（W/W）时，收率达到最大分别为94.0%、93.6%，此时其分配系数分别为11.52、11.24，这与传统的低分子量聚乙二醇/磷酸氢二钾体系萃取效果相似。 国外在双水相提取牛血清白蛋白中也取得了长足的发展。LouwrerA用乙醇/磷酸氢二钾体系萃取分离牛血清白蛋白,酪蛋白，核糖核酸酶等蛋白质，实验结果表明：被萃取物在该体系能得到较好的分离，而且部分稳定性较高的蛋白的生物活性得到了很好的保持；E-Kiss等人采用硫酸铵/叔丁醇双水相体系对牛血清白蛋白进行分离提取，结果表明，牛血清白蛋白能保持较高活性沉淀到两相界面处；据外文文献记载，牛血清白蛋白在聚乙二醇/葡聚糖双水相体系中分配特性的研究实验中，结果表明：pH对其影响主要为任一NaCl浓度下，pH=5.0处均出现一波峰。当pH>7并继续增大时，开始受电位差的影响。由于BSA所带的负电荷不断增大，在电位差的影响下，聚阴离子不断向上相富集使得分配系数呈向上趋势。 目前，通过市场的调研和实践，证实了双水相萃取牛血清白蛋白的可行性。石家庄鼎晨科技有限公司应用双水相萃取技术制备的牛血清白蛋白降低了其成本，扩大了生产规模，提高了纯化倍数和相的分离速度，系统经济，成本低且无毒，此技术的大规模应用为社会带来了广大的社会效益。该公司充分利用双水相萃取技术的作用条件温和，可调节因素多，易于放大和操作的优点来分离提纯牛血清白蛋白，从而达到降低成本，提高产率的目的，这些也是传统工艺所没有的特点。 双水相萃取技术是一种新型液液萃取分离技术，其技术有点很多，譬如，条件温和，工艺易于放大，杂质少，纯度高等。然而，相关研究和应用还不够深入，一些技术难题还有待解决。双水相萃取技术的发展趋势为：解决易乳化，相分离时间长，成相聚合物的成本较高，水溶性高聚物粘度较大且不宜定量控制等问题。开发新型优质的双水相体系，进一步拓宽应用领域，与其他技术结合的多元化利用。今后，随着对双水相体系研究的深入，双水相萃取将成为一种优良的分离技术。
分离纯化蛋白质的方法及原理
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
牛血清白蛋白分离提纯工艺
课程设计说明书 课程名称：生物分离工程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼 学号：41004020111 专业班级：10级生物工程01班 指导教师：王晓军 2013年6月20日
目录 1.设计任务书 (1) 2.设计背景 (1) 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1) 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1) 3.设计原理 (2) 4.设计工艺流程及设计方案说明 (2) 4.1对原材料的粗分级分离 (3) 4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3) 4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3) 4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3) 4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3) 5.操作过程 (4) 5.1蛋白质分离的准备阶段 (4) 5.2细分级分离设备的设计 (4) 5.3蛋白质的纯度鉴定 (8) 6.参考文献 (8) 7.课程设计心得 (9)
1.设计任务书 现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。 2.设计背景 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！ 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理 （一）利用分子大小 1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题： 如何加快透析过程 （1）加大浓度差，及时更换透析液 （2）利用磁力搅拌器 常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来 （二）利用溶解度差别 4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析
（三）根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是： 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是： 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法
实验二牛血清白蛋白的提取与鉴定
牛血清白蛋白的提取与鉴定 一、实验目的掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法 二、实验原理 牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38 g/100 ml），分子量68 kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸胺盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的粘稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。 二、实验步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2 ml、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH 7.2饱和硫酸铵溶液2ml，边加边摇，充分混匀，然后静止放置10分钟，再离心（4000 r/min）10 min，将上清液侵入试管中。 （二）透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100 ml烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白
溶液。 （三）电泳 （1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5 cm处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。 （2）电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时膜条无光泽面向下，点样端置于阴极，待平衡5 min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160V，通电60 min，关闭电源后用镊子将膜条取出。 （3）染色将膜条直接浸入盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸入漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5 min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。 （4）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。 四、实验仪器和试剂 仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色磁盘、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、分光光度计。 试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲溶液，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9% NaCl溶液）、pH7.2饱和磷酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氢氧化钠溶液。 五、预测结果 位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。 六、参考文献 【1】陆红玲. 生物化学与分子生物学实验教程。西安：第四军医大学出版社，2010. 巴比妥缓冲液（pH8.6）取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g，加水使溶解成2000ml，即得。
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（2）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集 沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净 电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等 电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋 白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度 增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度 增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是 由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些 被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化 盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶 解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在 室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。介 电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低， 因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇与蛋白质亲水集团发生相互作用并在空间上阻碍了蛋白质与水相接近。蛋白质在聚 乙二醇中的溶解度明显的依赖于聚乙二醇的分子量。 4、温度对蛋白质溶解度的影响：在一定温度范围内，约0~40℃之间，大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加，在40~50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。 （三）根据电荷不同 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类。 1、电泳：在外电场的作用下，带点颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳技术可用于氨 基酸、肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析分离和制备。 区带电泳是由于在支持物上电泳蛋白质混合物被分离为若干区带。 电泳前用缓冲液浸润薄膜或滤纸等支持物或用缓冲液直接配置成凝胶，将待分离的蛋白质样品加在它的一端或中央，支持物的两端与电极连接，通电电泳。电泳完毕，各个组分分布在不同的区域，用显色剂（蛋白质可用考马斯亮蓝 或氨基黑等染色）显色后可以显示出各个组分。 氨基酸混合物特别是寡聚核苷酸混合物一次电泳往往不能完全分开。这种情况可以将第一次电泳分开的斑点通过支 持介质间的接触印迹转移到第二个支持介质上，旋转90°，进行第二次电泳。这种方法称为双向电泳。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的两部分组成 （小的部分是浓缩胶，大的部分为分离胶），这两部分凝胶的浓度、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是 不同的，即不连续性。电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。 电泳有三种物理效应：1、样品的浓度效应；2、凝胶对被分离分子的筛选效应；3、一般电泳分离的电荷效应。