第十三章 基因工程与基因体外表达

第十三章基因工程与基因体外表达

第一节基因克隆

一．限制性核酸内切酶

二．基因克隆中具有不同功能的工具酶

第二节基因克隆中特定的DNA载体

一．常用克隆载体（质粒和病毒）

二．表达载体将外源基因带入宿主并进行表达

第三节基因克隆的过程

一．获取目的基因

二．选择和准备载体

三．DNA片段的连接

四．重组DNA导入宿主细胞进行扩增

五．筛选与鉴定

第四节真核细胞基因转染

一．真核细胞转染的方法与原理

二．转染细胞利用抗性标记进行筛选

第五节利用重组DNA技术对基因进行改造

一．对特定基因的定点诱变

二．利用基因定点诱变技术改变基因工程蛋白的特性

第六节克隆基因在适当的宿主细胞表达

一．大肠杆菌表达系统

二．哺乳动物细胞外源基因的表达

三．其他宿主细胞中也表达制备真核蛋白

第七节电子克隆

本章重点:

掌握：DNA克隆概念，限制性内切酶的定义及其特点，基因载体的种类。重组DNA技术的基本过程，目的基因获取的方法，外源基因与载体的连接方式，重组DNA分子导入受体菌的方式，重组体筛选的方法。

熟悉：基因组DNA文库和cDNA文库的概念，目的基因表达体系的种类及其特点

了解：自然界基因转移的方式：接合作用、转化及转导作用、转座；重组有两种类型，即位点特异性的重组和同源重组

本章难点

两种类型基因重组的机理；限制性内切酶的作用特点，基因载体的种类；重组DNA技术的基本环节中，目的基因的获取方法，外源基因与载体连接的方法，重组DNA导入受体菌的

方法，重组体的筛选方法，以及原核和真核表达体系的优缺点比较

核心词：DNA重组基因克隆载体宿主细胞

基本概念：

DNA重组（DNA recombination）：不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。

基因克隆（gene cloning）：主要是进行制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制，扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝的过程。

基因工程（genetic engineering）：基因克隆后，利用克隆基因表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程。

重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术。基因工程与蛋白质工程，酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴学科领域——生物技术。

第一节基因克隆

一．限制性核酸内切酶

在基因克隆中用于切割DNA。能识别双链DNA分子内部的特异位点并且裂解磷酸二酯键。

至今发现的有三种类型：Ⅰ型酶，Ⅱ型酶，Ⅲ型酶。

基因工程中常使用Ⅱ型酶。它在基因克隆中得到广泛应用，是最重要的工具酶，它能识别DNA分子内部的特异位点和切割双链DNA，其切割位点的序列可知，固定。通常所说的限制性内切酶就是指这一类酶。

限制性内切酶特点：具有特定的识别和切割位点，通常是4－6个碱基对，具有回文序列（palindrome）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’粘性末端（sticky end）.

同工异源酶：来源不同而功能相同的一类酶。举例：BamHI和SstI等。

同尾酶：切割DNA后产生相同末端的酶。

二．基因克隆中各种具有不同功能的工具酶

1．DNA聚合酶Ⅰ：常用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ。DNA聚合酶I的分子量为l09kD，是一条约1000个氨基酸残基的多肽链。它具有三种活性：

①5’→3’DNA聚合酶活性（能以单链DNA为模板，在3’-OH引物的引导下，按5’→3’方向，合成互补的DNA序列）；

②3’→5’外切核酸酶活性(能够去除延长的核酸链上的3’-OH末端上的核苷酸，可以沿3’→5’方向降解双链或单链DNA，释放5’单核苷酸；

③5’→3’外切核酸酶活性(能从DNA链5’-OH末端降解双螺旋DNA的一条链，沿5’→3’方向，释放出单核苷酸或寡核苷酸)。

DNA聚合酶I的主要用途：

①用切口平移方法标记DNA(可作杂交探针)；

②利用其5’→3’外切核酸酶活性降解寡核苷酸作为合成cDNA第二链的引物；

③用于对DNA分子的3’突出尾进行末端标记，用于DNA序列分析。

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(K1enow片段)：K1enow片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I产生，或通过克隆技术而获得。此酶是单一多肽链，分子量76kD。它具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，而无5’→3’外切酶活性。

2．Klenow片段（Klenow fragment）：

①补平限制性内切酶切割DNA产生的3’凹端；

②用[32P]dNTP补平3’凹端，对DNA片段进行末端标记；③对带3’突出端的DNA进行末端标记；

④在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；

⑤在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA；

⑥应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序。

3.逆转录酶（reverse transcriptase）：用于mRNA为模板合成cDNA，是构建cDNA 文库和RT－PCR等技术的关键工具酶。

4．T4DNA连接酶(T4 DNA ligase)：该酶催化DNA相邻的5’磷酸基和3’羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA单链缺口封合起来。

5.碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）：去除DNA或RNA5’端的磷酸根。

6．末端脱氧核苷酰转移酶（termial deoxynucleootidyl transferase,TdT）：将脱氧核苷酸加到DNA的3’羟基上，主要用于探针标记，或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便用于进行基因克隆。

7．基因克隆中用到的其他酶：Taq DNA聚合酶，T4多聚核苷酸激酶，RNA聚合酶，核酸外切酶等。

第二节基因克隆中的载体

基本概念：

载体：能将外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达，并能在该宿主细胞内进行自我复制和表达的介质。

克隆载体和表达载体：前者只是进行克隆和扩增特定的DNA片段，后者兼具克隆和表达两种功能。

基因克隆载体基因工程所用的克隆载体常称之为分子克隆载体（molecularcloningvector），它是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。

一．常用克隆载体主要来自质粒和病毒

1．质粒：

广泛存在于包括细菌，酵母在内的多种微生物中，在宿主细胞染色体外以稳定的方式遗传。

双链环状DNA分子。不同的质粒含有不同的抗药性基因和其他遗传标志。

克隆载体质粒所必备的条件：

a．分子领相对较小，能在细菌内稳定存在。有较高的拷贝数。

b．具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择。

c．具有多个限制性内酶切的单一切点，便于外源基因的插入。

?质粒DNA分子呈双链共价封闭环状、自然旋转成超螺旋构型(closedcircleDNA，ccDNA)，有时会因单链断裂而成为开链环状DNA(opencircleDNA，ocDNA)，有时双链断开成线性DNA(linerDNA，1DNA)。

?由于它们的空间构型不同，这三种DNA分子的电泳行为也不同。根据这一特性，常用琼脂糖凝胶电泳将它们分开。

?由于质粒DNA分子构型不同，它们与溴化乙锭结合能力也有差异，造成分子密度不同，可经氯化铯密度超离心，将三种不同构型的质拉DNA彼此之间或同染色体

DNA、RNA分子区分开来。这就是氯化绝密度梯度离心分离、纯化DNA的原理。

不同种类的质粒的分子最大小不一，小的2kb～3kb，大的可达数百kb。

细菌的天然质粒种类很多，特征也不相同。不同质粒在细菌内的复制方式也不同。

按质粒复制与宿主菌的相关程度，可以把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒两类。

?严密型质粒的复制与宿主菌密切相关，宿主菌内只有l～2个质粒拷贝存在，当宿主菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止。

?松弛型质粒在宿主菌内通常可含10～200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成的影响，当宿主菌蛋白质合成停止时，例如当宿主菌遇上有抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素(specfinomycin)存在时，质粒DNA的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至几千个。

?因此，通常选用松弛型质粒作为基因工程载体，以期在质粒插入外源基因后，可在子代细菌的重组质粒中获得高产量的目的基因。

?但在另一些情况下，在大量的克隆化基因和克隆化基因产物可能又是有害的，此时可使用严密型质粒来分离、纯化多拷贝的质粒上大量表达时可呈现致死效应的功能性基因。有的质粒带有一种tra基因，该基因产物促进质粒与细菌结合。根据质粒是否带tra基因，质粒又可分为结合型和非结合型质粒。

质粒载体可用于简便、快速、大量地制备某些克隆的DNA片段。早期改建的一些人工质粒大多来源于大肠杆菌的天然质粒。1977年Bo1iver等构建了pBR322质粒，多年来被广泛采用并经改进，产生了更多更有用的质粒载体。这些载体多已商品化，可由国内、外市场购得。

穿梭载体（shuttlevector）

多克隆位点区（multiplecloningsite）：由于不同基因的末端可以由不同的限制酶所产生，因而为了减少分子克隆的工作量，科学家们构建了具有多个克隆位点的载体，而且将多个克隆位点集中在一个很短的序列内，这种序列常常被称之为多克隆位点区。

病毒型载体：这类载体中所含的复制起点是来自病毒DNA。在大肠杆菌中，以噬菌体λ所组建的charon系列，λEMBL和λNM系列载体和以单链DNA噬菌体M13组建的M13mp 系列载体。在动物细胞中，也有好几种病毒复制起点被用来组建克隆载体。

混合型载体：这类载体复制起点来自质粒和病毒，比如适合于大肠杆菌的DNA载体pEMBL8和pEMBL9含有质粒pMB1和单链噬菌体f1复制起点。用于动物细胞的DNA载体则含有大肠杆菌的质粒复制和动物病毒复制起点。使用得最广泛的动物病毒复制起点来源子SV40。实际上，这类混合型载体也是穿梭型的，即它们既可以在大肠杆菌中复制，亦可在动物细胞中复制。

在大肠杆菌中，天然存在的质粒主要有三类：大肠杆菌素因子(ColEfactor)，抗药性因子(Rfactor)和性因子(Ffactor)。在这三类质粒中，R和F因子的复制受到大肠杆菌染色体上的基因严格控制，因此每个细胞仅有1?/FONT>2个拷贝，但是它们很稳定。ColE因子的复制则不象R和F因子那样严格地受到宿主细胞基因控制，每个细胞的质粒数可达20个左右，但是不稳定。直接利用天然质粒作为分子克隆载体是不合适的。于是Bolivar等人在1979年利用ＣolE１质粒的复制起点和R质粒中的药物抗性基因构建了一系列载体pBR。随后，适用于各种目的的载体相继问世。目前已组建的质粒载体的复制起点绝大多数都是来自ColE1类中的质粒pMB1，这是因为它是属于松驰型质粒，每个细胞可产生大量的的质粒DNA。科学家还利用缺失突变的方法从pBR322获得了一个新质粒载体，其拷贝数可达200。由于每个细胞内的质粒载体拷贝数高，那么利用这种载体增殖外源DNA和cDNA片段就极其有用。

大肠杆菌质粒载体上的选择和检测标记基因主要来自各种R因子的药物抗性基因，比

如pBR322中的Apr和Ter基因。虽然药物抗性基因在鉴定重组子时十分直观，但操作时还是略有些麻烦。在80年代初期，Messing等人又构建了另外一个pUC系列质粒载体。这个系列的载体有三点与pBR系列载体不同：一是pUC载体较小，全长仅2686bp；二是只保留了一个药物抗性基因Apr，另一个标记基因是β-半乳糖苷酶基因(LacZa)，该基因是一个生化标记基因，极易检测；三是有一个多克隆位点区，共有10个克隆位点，极有利于克隆外源基因。

2. 噬菌体载体

噬菌体λ是一种双链DNA病毒，大小约50kb，在噬菌体颗粒中它是以线状形式存在，线状分子的两端有一个12个核苷酸(5'一GGGCGGCGACCT－3')的5'一端突起的可互补的粘性末端（Cohesiveend,COS）。当λ侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端连结成环状分子。用λ作载体比起用质粒作载体有以下几个优点：

a.λ载体可容纳的较大的外源DNA片段；

b.λDNA进入细菌细胞容易，它不需要象质粒载体那样需要采用化学介导法才能进入细菌细胞；

c.由于λ能裂解宿主细胞，因而不管是提取λ载体DNA或重组λDNA，或是提取重组λ中外源基因产物都比较容易

d.用λ载体组建的DNA或cDNA文库易于长期保存。目前由λDNA组建的载体已有上百种之多，根据外源DNA进入载体的方式可以将其分为两种类型：(1)插入型载体(insertionveetor)：即把外源DNA或cDNA插入载体中的某个遗传标记基因中而使其失活，这与利用质粒载体克隆外源DNA的方式十分类似。图15所示的插入型λ载体λgt11可以在EcoRI位点处插入长达7kb的外源DNA片段。该载体也是一个表达型载体，因为克隆位点位于LacZα基因编码区内，因此常用于cDNA文库的建立。重组λ的检出与上述的重组pUC18十分相似，因为它们所用的都是β-半乳糖苷酶基因。

重点、难点及对学生的要求（掌握、熟悉、了解、自学）

掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理、SouthernDNA印迹杂交、NorthernRNA印迹杂交、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交、Westernblot的基本原理；掌握感受态菌的制备；了解ddNTP 链终止法原理；掌握限制性内切酶和DNA聚合酶的原理；了解碱性磷酸酶和逆转录酶的作用；了解重要的大肠杆菌质粒载体、克隆载体的种类。

第三节基因克隆的过程（重点）

基因克隆主要分为以下几个步骤：

1．制备目的基因和相关载体。

2．将目的基因和有关载体进行连接。

3．将重组的DNA导入受体细胞。

4．DNA重组体的筛选和鉴定。

5．DNA重组体的扩增，表达和其他研究。

一．目的基因的获取

1．利用基因文库获得目的基因。

基因组文库（genomic library）：指含有一个机体基因组全套重组DNA分子。

通过构建基因组文库，然后从中筛选得到特定的DNA片段。

2．从cDNA文库中获得

以mRNA为模板合成互补的DNA（cDNA）。获得全场的cDNA片段，构建cDNA文库，

并从中筛选出基因。cDNA文库比基因组文库小得多，目的基因得筛选也比较容易。

3．利用PCR技术获得特定基因。将经过PCR技术体外扩增得DNA片段克隆入质粒载体。

4．人工合成目的基因在已知核苷酸序列后可利用化学方法将这段DNA序列合成出来。DNA合成仪，分段合成，后用连接酶连接。

二．载体的选择

依据基因克隆的目的选择。

首先要获得载体DNA，后进行处理以便于与目的基因片段的连接。

三．DNA片段的连接

四种主要的体外连接法：

a．粘性末端最适合DNA片段连接

b．人工接头用于处理不易连接的DNA

c．加入同聚物尾是处理不易连接的DNA片段的另一种有效方法。

d．带有平端的DNA片段的连接。

四．重组细胞导入宿主细胞

转化（transformation）：指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。

感染（infection）：利用噬菌体将外源DNA导入宿主细胞的方法。

转染（transfection）：指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法，磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法等。

五．阳性克隆的筛选与鉴定

外源基因导入宿主细胞后首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。主要含三个步骤：

1．筛选出带有载体的克隆。

2．筛选出带有重组体的克隆。

3．筛选出带有特异DNA序列的克隆。

a．采用遗传学方法筛选特定的重组DNA

利用抗性标记筛选

利用不同标记筛选。带有重组DNA的克隆可利用载体的不同特性进行筛选。

（1）插入失活法利用特定抗性基因的失活进行筛选。使用于具有两个或两个以上抗生素抗性标记质粒。

（2）α互补(alpha complementation)筛选

b．免疫学方法

利用特异性抗体检测表达产物。

c．核酸杂交法

适合从文库中筛选特定的DNA。

原位杂交

第四节真核细胞可利用不同方法进行基因转染

真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优越性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达克隆的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA；哺乳类细胞表

达的蛋白质通常总是被适当修饰，而且表达的蛋白质会恰当地分布在细胞内一定区域并积累。哺乳类动物细胞表达体系的缺点是操作技术难、费时、不经济。常用于细胞转染的方法有：磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔、脂质体转染及显微注射等。当前采用最多的哺乳类细胞是COS细胞(猿个猴肾细胞)和CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。

第五节利用重组DNA技术可对基因进行改造在基因功能研究中，有时需要人为地改变其一级结构，以进一步分析其功能。在蛋白质工程研究中，更是常常需要改变基因地一级结构，以生产结构发生特定变化更适合应用的蛋白质。

定点诱变技术

第六节克隆基因在适当的宿主细胞中的表达

一．大肠杆菌表达系统适合在大肠杆菌表达外源基因

（一）表达外源基因需要的基本要素

a．来自真核细胞的目的基因需要适当改造。

b．必须选用大肠杆菌载体。

c．目的基因与载体可以不同方式连接，一般将目的基因的5’端连接SD序列的3’端下游。d．选择适当的受体菌株和诱导条件。

（二）采用适当措施可以提高外源基因表达水平。

1．外源基因翻译水平的的提高：

a．调整SD序列与A TG之间的距离

b．用点突变的方法改变某些碱基。

c．增加mRNA的稳定性。

2．将细菌的生长与外源基因的表达在时间上分开。

3．采用不同的措施提高表达蛋白的稳定性。

a．表达融合蛋白

b．采用某种突变菌株

c．表达分泌蛋白

二．在哺乳动物细胞表达外源基因

三．其他宿主细胞中表达制备真核蛋白

昆虫表达系统，酵母表达系统。

第七节电子克隆

电子克隆(in silico cloning)：通过基因数据库进行序列搜索，对比分析，拼接整合，预测新的假定的全长基因，然后通过分子生物学实验方法，加以证实，并从相应的组织，细胞中获得这种基因。