颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其抗原性与免疫原性[1]
20卷2期2004年3月
生 物 工 程 学 报
Chinese Journal o f Biotechnology V ol.20 N o.2
March 2004
收稿日期:2003-08-15,修回日期:2003-12-01。
基金项目:福建省科技重大项目(N o.2002F013),教育部跨世纪优秀人才培养计划。
3通讯作者。 T el :86-592-2184110; Fax :86-592-2184110; E -mail :nsxia @https://www.360docs.net/doc/7017347950.html,
颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其抗原性与免疫原性
何志强 张军 李少伟 林鉴 刘如石 陈毅歆 王颖彬 夏宁邵
3
(厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建省医学分子病毒学研究中心,厦门361005)
摘 要 过去的研究发现大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒(HE V )衣壳蛋白ORF2的aa394-606片段NE2可以形成同源多聚体,并具有良好的免疫保护性,但纯化后的免疫原性较弱。这里表达了3个NE2蛋白的N 端延伸突变体,发现对应于ORF2aa368-606的重组蛋白HE V 239在体外可以形成颗粒性抗原。HE V 239抗原颗粒与戊肝患者血清反应性良好,对中和性单克隆抗体8C11的反应性与NE2抗原相当,而对另一中和性单克隆抗体8H3的反应性较NE2抗原有显著提高,表明HE V 239抗原颗粒具有比NE2更好的抗原性。纯化后的HE V 239抗原颗粒直径约为15～30nm 。铝佐剂吸附的HE V 239免疫Balb Πc 小鼠的半数有效剂量(E D 50)在0108～0125μg 之间,而同样以铝佐剂吸附的NE2抗原60μg 剂量免疫的抗体阳转率仅25%,表明HE V 239抗原颗粒具有更好的免疫原性。关键词 戊型肝炎病毒,衣壳蛋白,疫苗,颗粒性抗原,原核表达
中图分类号 R37312 文献标识码 A 文章编号100023061(2004)022*******
戊型肝炎(戊肝)是一种由戊型肝炎病毒(HE V )
引起的经肠道传播的急性肝炎,临床表现与甲型肝炎类似,但病死率较高(1%～3%),孕妇感染病死率
可高达20%[1]
。我国是戊肝主要流行区之一,1986～1988年在新疆南部地区发生的大规模戊肝爆发流行,造成20万人发病,死亡1000余人;除新疆外,我国吉林、辽宁、内蒙古及山东等地均有戊肝爆发流
行的报道[2]
。由于戊肝病毒尚不能进行有效的体外组织培养,传统的减毒疫苗和灭活疫苗的研制无法进行,基因工程疫苗的研制成为戊肝疫苗的最大希望所在。
HE V 含3个开放读码框架(ORF ),其中ORF2编码660个氨基酸的多肽(PORF2),为病毒主要结构
蛋白,组成病毒衣壳[1]
。目前已发现多个ORF2重组蛋白具有免疫保护作用,表明ORF2蛋白上存在着重要的中和表位[3-5]
。最近,我们在大肠杆菌中表达了HE V ORF2aa394-606的一个片段,获得的重组蛋白(NE2)对戊肝急性期、恢复期血清均有很强
的反应性,免疫恒河猴可产生良好的保护性[6-9]
。利用NE2蛋白制备的单克隆抗体成功地鉴定出HE V ORF2上的2个不同的中和表位区域,分别被
中和单抗8C11和8H3所识别
[10]
。但随后的研究发
现,当NE2纯度提高到95%以上时,其免疫原性显著下降,成为疫苗研制的一大障碍。为有效提高疫苗的免疫原性,我们进一步对NE2的延伸突变体进行了的表达、纯化和免疫原性研究。
1 材料与方法
111 质粒与菌种
含有HE V ORF2a.a.394～a.a.606基因片段的
非融合表达载体pT O-T 7-E2[6]及pT O-T 7[11]
为本实验室所构建与保存,受体菌E .coli ER2566购自New England Biolabs 公司。112 引物
根据HE V 基因Ⅰ型中国株(DDB J 登录号D11092)序列,合成5′段延伸引物如表1(上海博亚公司),引物5′端均引入Nde Ⅰ位点。以引物HERP (5′-ctcgagaaataaactataactcccga-3′)为反向引物,引物5′端引入Eco R Ⅰ位点。113 工具酶及其它
限制性核酸内切酶、Taq DNA 聚合酶和pMD 18-T 载体为T aK aRa 产品,酶标记抗体购自晶美公司,为PROT OS 产品,预染蛋白分子量标准和蓝染试剂为HyClone Pierce 公司产品。
表1 NE 2N 端延伸引物
T able 1 The primers of NE 2N -terminal extension
Peptide Am ino acid location
Primer name Primer sequence
HE V 217380-606217FP 5′-CAT ATG TCGG CAGG TGG ACAG CTG TTCT ACTCTCG T -3′
HE V 227370-606227FP 5′-CAT ATG CT AGG CGG TCT ACCCACAG AATTG ATTTCG TCGG CAGG TGG ACAG -3′HE V 239
368-606
239FP
5′-CAT ATG AT AG CG CTT ACCCTG TTT AACCTTG CTG ACACCCTG CT AGG CGG TCT ACCCA-3′
114 重组表达载体的构建以pT O-T 7-E2为模板,分别利用正向引物
217FP 、227FP 、239FP 以及反向引物HERP ,依次进行PCR 反应:94℃5min ;94℃50s ,57℃50s ,72℃50s ,共25个循环;72℃10min 。扩增产物以胶回收试剂(上海华舜公司)回收后,直接连接至pMD18-T 载体中,测序无误后用Nde Ⅰ和Eco R Ⅰ切下目的基因,连到同样酶切处理的pT O-T 7上,获得NE2N 端延伸突变体表达载体
pT O-T 7-217、pT O-T 7-227和pT O-T 7-239。图1显示了pT O-T 7-239的主要基因元件。
图1 pT O -T 7-239质粒图谱
Fig.1 Plasmid map of pT O -T 7-239
115 蛋白的表达与复性
表达载体转化大肠杆菌ER2566进行IPTG 诱导
表达。诱导条件为25℃,012mm ol ΠL IPTG,6h 。离心收集菌体,超声(S ONICS&MATERI A LS 公司,Uilbra-Cell VCX500型超声破碎仪)破碎,包涵体经1%T riton X -100洗涤2次,溶于缓冲液A (4m ol ΠL 尿素,20mm ol ΠL T ris ?Cl ,pH815,5mm ol ΠL E DT A ,100mm ol ΠL NaCl )中,对1×P BS (pH7145)透析过夜,离心获得复性上清液。
116 NE2蛋白N 端延伸突变体的分子筛保留时间检测
重组蛋白复性样品用高效液相色谱(HP LC ,Beckman Syster G old N ouveau 125NMP Π166NMP )进行分子筛保留时间检测,层析柱为TSK G 3000SW X L (718mm ×30cm )。
117 HEV 239重组蛋白的纯化
将缓冲液A 中的239重组蛋白经4m ol ΠL 尿素
水溶液透析过夜,进行等电聚焦电泳纯化。等电聚焦仪选用Amershan Pharmacia 公司生产的Is o-Prime pI8型制备型多腔等电聚焦电泳系统。6个固相化pH 膜为pH5110、pH5120、pH5125、pH5130、pH5135和pH5140;溶液为4m ol ΠL 尿素水溶液。上样于pH5125-pH5130腔室中;电泳参数为200V 2h 、500V 2h 、800V 2h 、3000V 60h 。聚焦后的239重组蛋白位
于pH5125～pH5130之间。
经过等电聚焦纯化的239重组蛋白(2mg Πm L )进一步以HP LC 纯化。收集时间:105～120min ,获得239纯化样品100m L ,4mg Πm L (S DS -PAGE 蓝染单一纯)。层析柱选用TSK 公司的Phenyl-5PW 2115mm ×15cm 。缓冲液:015m ol ΠL 硫酸铵、4m ol ΠL 尿素、20mm ol ΠL 磷酸缓冲液pH712;洗脱液:4m ol ΠL 尿素、20mm ol ΠL 磷酸缓冲液pH712,流速:4m L Πmin ,洗脱程序为015～0m ol ΠL 硫酸铵连续梯度洗脱120min ,收集时间:105～120min ,获得239纯化样品。
HP LC 纯化样品进行切向流复性,使用PA LL 公司的切向流系统,膜包截留分子量为30kD ,运行时压力为01034MPa ,流速为500m L Πmin ,切向流速为15m L Πmin ;复性缓冲液为20倍样品体积的P BS pH7145。
118 透射电镜观察
复性后HE V 239重组蛋白经2%磷钨酸pH710
负染,固定于喷炭的铜网上进行透射电镜观察(日本E lectronics 公司,J E M -100CX Ⅱ透射电镜)。119 原子力显微镜观察
复性后HE V 239重组蛋白包被于聚苯乙烯微孔
板,进行原子力显微镜观察,扫描面积为1mm 2
。仪器为美国DI 公司生产的Nano ⅢA 型原子力显微镜,探针分辨率为1nm 。1110 动态光散射观察
复性后HE V 239重组蛋白以动态光散射仪(Protein S olutions 公司,DynaPro MS ΠX 型)测量水化动力学直径。使用Regulation 算法。
3
622期何志强等:颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其抗原性与免疫原性
1111 HEV239重组蛋白与戊肝患者血清和抗HEV中和单抗的E LISA反应
纯化的HE V239抗原,溶解于C B中,100ngΠ孔包被96孔聚苯乙烯微量板,37℃吸附2h,4℃过夜; P BST洗液(pH714)洗涤1遍,200μLΠ孔封闭液(20%牛血清P BS)37℃封闭2h,甩尽、拍干后真空密封, 4℃保存备用。检测时,于每孔中加入100μL样品稀释液,然后加入10μL血清,37℃温育30min;P BST洗涤5次,扣干后每孔加入100μL稀释好的抗人IgG-HRP(北京万泰生物药业公司提供),37℃温育30min;洗涤5次,扣干,加入显色剂,37℃温育10min,终止液50μL(2m olΠL H2S O4)终止,读取OD450nmΠ620nm的读值。
5份戊肝患者急性期血清和5份抗HE V抗体阴性血清由北京万泰公司惠赠。抗HE V中和单抗8C11和8H3由本实验室制备[10]。
1112 HEV239重组蛋白颗粒免疫小鼠的半数有效剂量测定
纯化复性后的HE V239抗原以P BS稀释至40μgΠm L,铝佐剂吸附过夜后以铝佐剂3倍系列稀释疫苗至终浓度分别为20、6167、2125、0174、0125、0108μgΠm L;以1m L腹腔注射抗HE V抗体阴性5～6周龄SPF级BA LBΠc小鼠,每剂量组8只。免疫前0d、免后1月、2月、3月、4月、5月、6月分别以定量毛细采血管采集鼠尾静脉血20μL。以239为抗原的间接E LIS A法检测鼠血清抗体。血清稀释度为1∶100,每份标本进行双孔检测,取平均值判断结果。
2 结果
211 NE2蛋白N端延伸突变体的表达及复性产物分子筛柱层析保留时间分析
将重组表达载体质粒转化大肠杆菌进行诱导表达,HE V217、HE V227和HE V239重组蛋白均有较好表达,表达产物溶解于4m olΠL尿素后透析复性纯化。利用G3000SW
X L分子筛层析柱在HP LC中观察复性纯化产物的保留时间,结果发现HE V217和HE V227蛋白的保留时间稍短于NE2,但其保留时间对应的分子量显著短于相应的单体分子,提示三者均主要以多聚体形式存在。而HE V239随穿透峰出现,其保留时间明显短于其他蛋白,相当于> 500kD的分子,提示其形成了颗粒(图2)。
212 HEV239重组蛋白的纯化
质粒pT O-T7-239转化的E.coli菌体经诱导后, S DS-PAGE显示在电泳迁移率相当于31kD
左右有一
图2 重组蛋白的分子筛保留时间
Fig.2 Retained time of recombinant proteins in gel
filtration chromatogram
表达条带,表达量约为30%(图3,lane1),主要以包涵体的形式存在。经2m olΠL、4m olΠL和8m olΠL尿素洗涤,可见尿素上清中有电泳迁移率相当于43kD左右的二聚体蛋白(图3,lane3～5)。取4m olΠL尿素溶解的样品进一步以等电聚焦电泳、疏水相互作用层析和切向流复性纯化,纯化样品的S DS-PAGE显示目的蛋白主要为二聚体形式(图3,lane6),煮沸后仅出现单体带,未见杂带(图3,lane7)。经HP LC分子筛层析柱及S DS-PAGE稀释染色法鉴定纯化蛋白纯度大于95%(结果未列出)。最终纯化得率约为包涵体重组蛋白的20%
。
图3 HE V239重组蛋白的S DS-PAGE电泳
Fig.3 S DS-PAGE of recombinant protein HE V239
1:bacterium lysis;2:supernatant of bacterium;3:supernatant of2m olΠL urea s olution;4:supernatant of4m olΠL urea s olution;5:supernatant of8m olΠL urea s olution;6:purified by HP LC;7:purified by HP LC (boiled);8:protein m olecular weight marker
213 HEV239重组蛋白颗粒的形态
透射电镜观察负染的纯化后的HE V239重组蛋白,可见直径约为15～30nm的颗粒(图4)。以原子力显微镜观察,同样可见直径约为15～30nm的颗粒(图5)。动态光散射仪测定重组蛋白在溶液中的平均水化半径为13125nm(图6)。
462生 物 工 程 学 报20卷
图4 HE V 239重组蛋白颗粒的电镜照片
Fig.4 E lectromicroscopy photo of HE V 239recombinant
particle
图5 HE V 239蛋白颗粒的原子力显微镜观察
Fig.5 HE V 239recombinant particle under atomic force
microscopy
图6 HE V 239蛋白颗粒在溶液中的水化半径
Fig.6 The hydrated radius of HE V 239recombinant
particle in s olution
214 HEV 239重组蛋白颗粒的抗原性
21411 HE V 239重组蛋白颗粒对戊肝患者血清的
反应性:5份阳性血清分离自戊肝患者急性期,5份
阴性血清来自健康体检人群,其相关背景及对重组239V LP (作为包被抗原)的反应性见表2。5份阳性血清用G enelabs 公司的抗HE V IgG 试剂(G L-IgG )和IgM 试剂(G L-IgM )均为阳性,用万泰公司以NE2为抗原的抗HE V IgG 试剂(NE2-IgG )和IgM 试剂(NE2-IgM )亦为阳性,同时具有典型的急性肝炎临床表现。5份阴性血清G L-IgG 试剂为阴性,用NE2-IgG 试剂和NE2-IgM 试剂亦为阴性,同时无A LT 异常和其他肝炎表现。
21412 HE V 239重组蛋白颗粒上中和表位活性:不同浓度重组蛋白239或NE2包被,以间接E LIS A 检
5
622期何志强等:颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其抗原性与免疫原性
测对单抗8H3或8C11,结果如图7。239蛋白上
8C11表位的活性与等量NE2抗原相当,而8H3表位
的活性显著高于等量NE2抗原。
表2 HEV 239重组蛋白颗粒与戊肝患者血清的E LISA OD 值
T able 2 OD value of HEV 239recombinant p article against sera of hep atitis E p atients detected by E LISA
Sera Sex Age Days after onset
A LT G L-IgG G L-IgM E2-IgM E2-IgG HE V 239-IgG Patient 1M ale 73930430164331461310503143021857Patient 2M ale 73192281105631527311333140221933Patient 3M ale 35161744100031518315423145021234Patient 4Female 37143554100011539410004100031137Patient 5
M ale
41
12
286
31000
31416
31216
31051
21453M ean
217223Healthy 1M ale 48-901051-010850102101022Healthy 2Female 20-1201058-010910101501017Healthy 3Female 21-2301052-010890101901016Healthy 4M ale 42-1701019-011100101901036Healthy 5
M ale
24
-7
01023
-01091
01016
01015M ean
010213
3The mean OD value for anti-HE V 239IgGon hepatitis E
patients was significantly higher than that on healthy individuals (P <01001,S tudent T test ).
图7 HE V 239或NE2抗原与中和单抗8C11
和8H3的反应性
Fig.7 Reactivity of HE V 239antigen or NE2antigen against neutralization m onoclonal antibodies 8C11or 8H3
215 HEV 239重组蛋白颗粒的免疫原性
不同剂量免疫小鼠的抗体阳转情况如表3。可
见在4周时0174μg 以上剂量免疫的小鼠抗体均阳转,0125μg 免疫有7Π8只鼠阳转,0108μg 免疫有3Π8
只阳转,小鼠E D50在0108～0125μg 之间。各免疫小鼠抗体持久性与免疫剂量呈正相关。最大剂量免疫的2组在24周后抗体仍无一阴转。免后24周各组小鼠抗体滴度情况如表4。可见小鼠抗体滴度与免疫剂量也呈明显的正相关。而NE2抗原免疫小
鼠,20μg 以下剂量无一阳转,60μg 免疫阳转率也仅25%(表5)。HE V 239蛋白的免疫原性显著高于NE2蛋白。
表3 HEV 239重组蛋白颗粒免疫小鼠不同时间的抗体阳性数
T able 3 Antibody positive number of mice on different month after being vaccinated by HEV 239recombinant p article
Vaccinated d ose Πμg
Vaccinated
num ber Antib ody positive num ber
0week 4week 8week 12week 16week 20week 24week 20808888886167808888882122
808888770174808888430125807655220108
8
3
2
表4 不同剂量HEV 239重组蛋白颗粒免疫小鼠24周后
抗体滴度分布
T able 4 Antibody titer distribution of mice on tw enty-fourth w eek following vaccinated by different
dosage of HEV 239recombinant p article
1Πtiter Vaccinated dose Πμg
2061672122017401250108Negative 001568100001020100000430010000882000T otal positive
8
8
7
3
2
6
62生 物 工 程 学 报20卷
表5 不同剂量NE2重组蛋白免疫小鼠后4周的
血清阳转情况
T able5 Seraconversion of mice on fourth w eek following vaccinated by different dosage of HEV239recombinant p article
D oseΠμg51015203060
Vaccinated N o.448488 Seraconversion N o.000012
3 讨论
在过去的研究中,我们发现所表达的HE V衣壳蛋白片段NE2可以形成良好的构象性中和表位,以弗氏佐剂免疫恒河猴具有良好的免疫原性,并诱导出高效价保护性抗体,使免疫猴获得对HE V的良好抵抗力[9,10]。但当NE2蛋白纯度提高到95%以上。并且采用铝盐佐剂时,疫苗的免疫原性显著下降。在对NE2蛋白进行研究时,我们已发现NE2在体外可自发形成以二聚体为基础的多种聚合形式,类似于病毒衣壳蛋白的装配过程[6]。Tsarev等[12]用昆虫杆状病毒表达系统表达HE V ORF2的aa112-660片段时,发现目的蛋白在表达过程中被剪切为55kD蛋白(aa112-607)和53kD蛋白(aa112-578),并且可以形成类病毒颗粒结构。NE2蛋白与55kD蛋白相比,C 端几乎完全重叠,仅N端有286个氨基酸的缺失。因此,延长NE2的N端有可能表达出可在体外组装成颗粒的重组衣壳蛋白。结果发现,当NE2蛋白N 端延伸至aa368时,获得的重组蛋白HE V239的分子筛保留时间出现了显著缩短,提示蛋白颗粒的形成。将HE V239蛋白进一步纯化、复性后,在透射电镜下、原子力显微镜下均可见直径约为15～30nm的颗粒,动态光散射检测蛋白在溶液中主要以平均水化半径13125nm的颗粒存在。
对HE V239重组蛋白颗粒可与戊肝患者血清以及中和单抗8C11和8H3有很强的反应性,对中和单抗的反应性强于等量的NE2抗原,表明该颗粒性抗原上形成了良好的戊肝中和表位。高纯度的HE V 239抗原颗粒以铝盐佐剂吸附后免疫BalbΠc小鼠的E D50在0108～0125μg之间,免疫原性较同等纯度的NE2蛋白的60μg以上有了显著的提高。
迄今通过基因工程技术表达的HE V衣壳蛋白颗粒均是在昆虫杆状病毒表达系统中获得的。该系统生产过程涉及大量的活病毒和异种蛋白,其安全性问题一直未得到充分验证。因此虽然其具有表达量大,目的蛋白翻译后修饰过程更接近于哺乳动物细胞等优点,迄今仍无一种正式上市的生物制品采用该系统进行生产。本研究在国际上首次采用生物制药业广泛使用的大肠杆菌表达系统获得了HE V 衣壳蛋白颗粒,而且所获得的颗粒抗原形成了良好的中和表位,并能诱导出高效价抗体,从而在抗原性、免疫原性和安全性方面均能满足疫苗的要求,为HE V疫苗的研制奠定了坚实的基础。目前该疫苗对恒河猴的保护实验正在进行中,已发现其可诱导出高效价的中和抗体,并能保护免疫猴免受同型和异型HE V的感染(结果另文发表)。
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HE Zhi-Qiang ZH ANGJun LI Shao-W ei LIN Jian LIU Ru-Shi
CHE N Y i-X in W ANG Y ing-Bin XIA Ning-Shao3
(The K ey Laboratory o f Ministry o f Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering,Research Center
for Medical molecular virology o f Fujian Province,Xiamen Univer sity,Xiamen361005,China)
Abstract An E.coli expressed recombinant antigen NE2was reported to aggregate into hom o-olig omer,and can induce protective antibodies on rhesus m onkey,but its immunogenicty was much weak after being purified.In this study,three N-term inal extension mutant of NE2were expressed in E.coli,one of which named HE V239was found to aggregate into particle. HE V239antigen had g ood reactivity w ith sera of hepatitis E patients.The reactivity of HE V239against neutralization m onoclonal antibody8C11was sim ilar as NE2antigen,while the reactivity of it against another neutralization m onoclonal antibody8H3is much better than NE2antigen,which indicated better antigenicity of HE V239than NE21The diameter of purified HE V239particulate antigen was between15nm to30nm.The E D50of immunization of HE V239particle adsorbed by alum inum adjuvant to BA LBΠc m ice was between0108μg to0125μg.In contrast,the seraconversion rate of m ice immunized by NE2antigen adsorbed by alum inium adjuvant was only25%on60μg vaccination.These results suggested that HE V239antigen particle has better immunogenicity as well as antigenicity than those of NE2antigen,so it is a better vaccine candidate against HE V.
K ey w ords hepatitis E virus,capsid protein,vaccine,particulate antigen,prokary otic expression
Received:0821522003
This w ork was supported by G rant from Science and T echnology Projects of Fujian Province(N o.2002F013)and Excellent Scholar Incubation Plan of M inistry of Education,China.
3C orresponding author. T el:86-592-2184110; Fax:86-592-2184110; E-mail:nsxia@https://www.360docs.net/doc/7017347950.html,
安捷伦加大研发创新力度 瞄准国内三大市场
(北京,2004年2月20日)在一年一度的安捷伦年度媒体招待会上,安捷伦中国公司高层宣布新一年的市场重点:无线通信、半导体、和生命科学。同时,安捷伦宣布进一步加大研发创新力度,扩大在华研发中心的规模。
安捷伦科技中国区总经理霍丰先生在记者会上说:“中国是安捷伦全球重点市场,安捷伦将继续加大在华投资力度,扩大研发机构规模,承诺1年前宣布的5年内上亿美元的投资额。在新的一年,安捷伦看好国内的三大市场,并将利用全球的技术创新网络和本地的研发力量,重点发展无线通信、半导体、和生命科学产业。迄今为止,安捷伦在中国的战略性投资已经涵盖了我们所有的业务范围,这必将为我们在通信、半导体、生命科学和化学分析等领域的发展奠定良好的基础。”
在生命科学和化学分析领域,中国在安捷伦全球业务中是第三大市场,仅次于美国和日本。今年,安捷伦生命科学与化学分析事业部将加大对中国市场的投资力度,把高技术的生产线转移到中国,建立全球仓储物流中心,并继续产品的本土化。同时,安捷伦将专注于:食品安全检测;环境安全和环境污染分析;中草药现代化;和蛋白质组学分析,通过找出与疾病有关的蛋白,更快、有效地开发新的药物。这些与人们生活密切相关的领域将成为安捷伦在中国的战略增长点。
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862生 物 工 程 学 报20卷