尿素-SDS-PAGE测定小分子多肽相对分子质量方法的建立

王丽荣，程福亮，陈雷，谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安 271000）

摘要：目的建立一种简易快速测定小分子多肽相对分子质量的SDS-PAGE电泳方法。方法通过改进分离胶交联度为6%，丙烯酰胺总浓度为15%，并加入6%的尿素，对所测得的多肽相对分子质量进行线性回归分析。结果得到的标准曲线线性相关系数r2达到0.9938，测得条带的相对分子质量分别为9.2129KD。结论本研究建立的方法操作简单、耗时短，且小分子多肽成像清晰，是一种具有很高实用价值的测定方法。

关键字：SDS-PAGE；小分子多肽；尿素；相对分子质量；转移因子口服液Development of Urea-SDS-PAGE Method for the relative molecular mass of small molecular peptide

WANG LI-Rong CHENG Fu-Liang CHEN Lei GU Wei

(Shandong BaoLai-LeeLai bioengineering Co. Ltd, Tai an, Shandong, 271000)

Abstract: Objective In order to establish a simple and rapid measuring method SDS-PAGE of the relative molecular mass of small molecular peptide. Method by improving the separation gel, the crosslinking degree was 6%, total acrylamide concentration was 15%, and 6% of urea was added, the relative molecular mass peptides was obtained by linear regression analysis. Results the linear correlation coefficient of the standard curve is 0.9938, and the relative molecular mass of the target protein bands was measured to be 9.2129 KD. Conclusions this study established the method of simple operation, short time consuming, and clear imaging, so, as a kind of measuring method of the relative molecular mass peptides of small molecular peptide, it has a high practical value.

Key words: SDS-PAGE; small molecular peptide; relative molecular mass; urea 蛋白质的生化分析和基因表达产物的分离纯化中，难免会需要分离某种或某些小分子蛋白质成分。近年来，用电泳法测定分子量在几千道尔顿小分子多肽分子量的研究报道较少。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法用作蛋白质大分子量测定的技术最早由Shapiro 等人于20世纪60年代建立[1,2]，之后Weber等人进行了改进，显示出了该方法在分离鉴定和纯化蛋白质方面的优越性[3]。20世纪80年代初，Schabgger等[4]应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，进行了系统地研究和摸索，能够分离较大相对分子质量范围内的蛋白质。随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出，而小分子多肽分子量的测定，目前多采用Tricine-SDS-PAGE系统[5,6,7]，但系统中的Tricine价格昂贵，电泳时间较长，且由于小分子多肽相对分子质量小，易受电泳缓冲系统、凝胶浓度、电泳时间、染色和脱色等的影响，极易引起条带扩散、不易着色，使分辨率降低，因而直接影响多肽分子量的测定。现有多肽分子量的三层胶电泳测定方法操作复杂，且结果也不理想。报道也有张晓楠等[8]采用尿素SDS-PAGE法快速测定了Mr为2500～17000的多肽，郭燕捷等[9]和石继红等[10]也分别对小分子肽类进行了测定。Kyte等[11]发现由25～250个残基组成的多肽可用含有8mol/ L尿素和0.1%SDS的20%PAGE来分离。

转移因子(TF)属于淋巴因子，可特异或非特异性地调节机体免疫状态、增强其细胞免疫[作者简介]王丽荣(1985-）,女,汉，硕士研究生，山东莱阳人，主要研究方向：禽病学、中药发酵。

和骨髓造血功能，已在临床应用多年，在原发性免疫缺陷病或慢性病毒感染疾病中作为免疫治疗药物作用，目前已得到肯定，特别是对病毒性上呼吸道感染治疗取得良好效果[12]。主要成份为小分子多肽和核苷酸，为免疫调节剂。

本研究根据小分子多肽条带分辨率高、操作简便、分析时间少、低成本等原则，旨在改进低分子量蛋白——转移因子的尿素-SDS-PAGE方法，并为小分子多肽相对分子质量的测定提供有效方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

垂直电泳仪及其配件、Power PAC200稳压稳流电源，Bio-Rad公司；GDS28000凝胶图像处理系统，英国UVP公司。低分子量蛋白Marker购于北京天恩泽基因科技有限公司；小分子多肽样品由山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院保存。

1.2试剂及配制

（1）30%丙烯酰胺：称取29g丙烯酰胺和1g N, N'-亚甲双丙烯酰胺溶于80ml超纯水中，然后定容至100ml。0.45um滤膜过滤后，测PH值。

（2）10%SDS：称取10gSDS 溶于80ml超纯水中，然后定容至100ml。

（3）1.5M Tris-CL：称取18.171g Tris-Base 溶于80ml超纯水中，用浓盐酸调整PH值至8.8，然后定容至100ml。

（4）0.5M Tris-CL：称取6.057g Tris-Base 溶于80ml超纯水中，用浓盐酸调整PH值至6.8，然后定容至100ml。

（5）10% APS：称取2.282g过硫酸铵溶于8ml超纯水中，定容至10ml。

（6）Running Buffer：称取3.03克Tris-Base，18.8g Glycine，5克SDS溶解定容至1000ml。（7）1×SDS上样缓冲液：0.05M Tris-HCL，100mM β-巯基乙醇，2% (m/V)SDS，0.1%(m/V) 溴酚蓝，10%(V/V)甘油

（8）染色液：0.1% (m/V)考马斯亮蓝R-250，25%(V/V)甘油，10%(V/V)冰醋酸

（9）脱色液：10%(V/V)醋酸，5%(V/V)乙醇量取100ml醋酸、50ml乙醇溶于800ml超纯水中，定容至1000ml。

1.3 实验方法

1.3.1 实验准备及样品处理：用自来水清洗烧杯、电泳仪及其配件，然后四蒸水冲洗干净，晾干备用，玻璃板先用自来水清洗，擦干，酒精棉球擦干，自然晾干备用。

1.3.2 配胶：如表一所示，制15％分离胶。制备方法如下：

在烧杯中依次加入2.3ml超纯水、30%丙烯酰胺5ml、1.5M Tris-CL 2.5ml、10%SDS 0.1ml、10% APS 0.1ml，最后添加TEMED0.004ml。加入TEMED混合均匀后，立即用吸管加入胶板中(倒胶时，以梳子齿端为参照，预留1cm浓缩胶空间)。然后，胶上加满蒸馏水封闭，以防蒸发。分离胶室温30min左右即可完全凝固。5%浓缩胶：烧杯中依次加入合适量的超纯水2.1ml、30%丙烯酰胺0.5ml、0.5M Tris-CL0.38ml、10%SDS0.03ml、10% APS0.03ml，先将分离胶上的超纯水倒掉，并用滤纸小心吸干残留水分，此时再将TEMED0.003ml加入烧杯中，混合均匀立即用移液枪滴加到分离胶上，插入合适的梳子。积层胶20min左右可完全凝固。

表1：尿素-SDS-PAGE 法制胶配方

成分

分离胶 15％浓缩胶 5％超纯水(ml)

2.3 2.1 30％丙烯酰胺(ml)

5.0 0.5 1.5M Tris-CL(ml ）

2.5 --- 0.5M Tris-CL(ml)

--- 0.38 10%SDS(ml)

0.1 0.03 10%APS(4℃)(ml)

0.1 0.03 TEMED(4℃) (ml)

0.004 0.003 尿素(g) 3.6 ---

1.3.3 加样：小心拔掉梳子，组装好电泳仪。然后倒入1×Running Buffer 。将蛋白Marker 和处理好的样品按顺序加入胶孔，并做好记录。

1.3.4跑胶：加样完毕即可跑胶，可固定电压进行跑胶。Bio-Rad 电泳仪可固定在200V ，君意电泳仪固定在150V ，当染带刚刚跑出胶板时，跑胶完成。

1.3.5卸胶：小心拆卸胶板，用分离器小心将两层玻璃板分离，切去积层胶。

1.3.6染色：将分离胶放于染色盒中，倒入20ml 染色液，然后一起放在摇床上，慢慢摇动。染色20min 即可。

1.3.7脱色：将分离胶取出，放于脱色盒，倒入30ml 脱色液，然后放在摇床上慢慢摇动过夜，或随时观察，直至分离胶除有蛋白的地方为蓝色其余部分变为无色即可。

1.3.8 小分子多肽样品中蛋白迁移率的测定及其分子量的计算

用倍率计读出照片上各样品色带中心与溴酚蓝前沿的距离，按标记变化比率换算出实际尺寸进行计算。电泳迁移率为Rf ，即样品迁移距离与溴酚蓝迁移距离的比值。以标准组多肽的迁移率为横坐标，以其对应的分子量对数为纵坐标作图，经线性回归计算，得到标准曲线。然后根据未知样品的迁移率在曲线上查出其对应的分子量。

2 结果与分析

2.1 小分子多肽样品的尿素-SDS-PAGE 结果

图1 小分子多肽的尿素-SDS-PAGE 蛋白电泳结果 1:阴性对照；2：小分子蛋白样品结果；M ：低分子量蛋白Marker

1 2 M 97.4KD 66.2KD 43.0KD 31.0KD

20.1KD 14.4KD

由图可知，小分子蛋白样品中蛋白浓度较高，SDS-PAGE 电泳结果显示，蛋白大小处于14.4KD 以下，样品纯度较高，无其他蛋白杂带，阴性对照无特定条带。

2.2 不同稀释浓度小分子多肽样品的尿素-SDS-PAGE 结果

通过10倍稀释小分子多肽样品，进行尿素-SDS-PAGE 电泳，图2显示获得了较好的结果，从A1到A5，小分子蛋白样品浓度逐渐降低，呈现较好的规律变化。

2.3 尿素-SDS-PAGE 中蛋白条带迁移率及分子量标准曲线的绘制

表1 尿素-SDS-PAGE 中蛋白条带迁移率的测定

注：A 为标准品各条带对应的分子量；Rf 为标准品各条带的迁移率测定值；Y 为迁移率的对数值

图3 标准曲线的建立

由表1中的数据绘制完成可进行测定小分子蛋白分子量的标准曲线，如图3所示，其中相项目

数值 Mr

97.4KD 66.2KD 43.0KD 31.0KD 20.1KD 14.4KD Rf

0 4 8.1 11 14 20 Y 2 1.792392 1.60206 1.477121 1.380211

1.146128

图2：小分子多肽样品不同稀释浓度的尿素-SDS-PAGE 结果 A1、A2、A3、A4和A5分别为依次为小分子多肽样品10倍稀释加样量电泳结果；M ：低分子量蛋白Marker

M A1 A2 A3 A4 A5 97.4KD

43.0KD

31.0KD 20.1KD 14.4KD 66.2KD

关系数R2＞0.99，表明建立的标准曲线可以用来测定小分子多肽的分子量。

2.4 小分子多肽样品中蛋白迁移率的测定及其分子量的计算

测定尿素-SDS-PAGE电泳中小分子多肽样品的迁移率为23.5，将此数值带入到分子量测定标准曲线方程中，计算得到待测小分子多肽样品的分子量为9.212977277KD。

3 讨论

随着生物活性多肽物质的发现和多肽类药物的研制，小分子多肽电泳变得越来越重要，已成为生物活性物质纯化分析过程中不可缺少、经常使用的快速鉴定方法。凝胶电泳以其操作简单、分辨率高等优点而广泛应用于蛋白质Mr的测定。蛋白质Mr的测定通常采用非连续的SDS-PAGE缓冲系统，缓冲液采用Tris-HCl；而多肽Mr的测定，采用Tris-Tricine缓冲液，可使小Mr多肽在浓缩胶中有效地浓缩，从而提高分辨率。SDS-PAGE的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径随着双丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而减小，M r低于10000的小分子肽，即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE也不能完全分离。本研究建立的双层胶尿素-SDS-PAGE测定小分子多肽Mr的方法有以下优点：(1) 操作简便。将常规的3层胶改为2层胶(分离胶和浓缩胶)；浓缩胶与分离胶采用了同一缓冲体系，简化了操作步骤，减少了由于凝胶制备而引起的诸多影响电泳的因素；(2)分辨率高。将3层胶改为2层胶后，分离胶的有效长度增加，可使单位凝胶长度下容纳的电泳条带数增加，从而使分辨率提高；(3)成本低。替代了昂贵的Tris-Tricine缓冲系统，电极缓冲液可以重复利用；(4)电泳时间短。由原来5～6 h 缩短为2.5h ，达到了快速检测目的。我们用含6 mo l·L – 1尿素的SDS-PAGE方法，不需银染而直接用考马斯亮蓝R2250 染色1.5～2 h，即可把标准品中的条带显示清楚，且简单方便，实验范围内多肽M r的对数与迁移率呈良好的线性关系, 相关系数r2达到0.9938。该方法的建立为小分子多肽分子量的估算提供了一种较好方法。

参考文献

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the separation of proteins in the range from 1 to 100 KDa[J]. Anal Biochem.1987,166

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小分子肽在高血压中的作用

小分子肽在高血压中的作用摘要：心血管生物活性多肽是维持人体生命活动最重要的物质基础，它们在调节和整合心血管系统的生长发育及疾病的发生发展等方面均起到了重要的作用。小分子活性多肽是心血管活性多肽的一大类，具有分子量小（相对分子质量一般小于10000）、结构简单、组织分布广泛、生物效应多样、合成与代谢迅速和免疫原性低等特点，是心血管自稳态调节的最重要成分，其功能紊乱具有重要的发病学意义。高血压是最常见的心血管疾病之一，神经、体液因素网络调节异常和平衡失调以及心血管局部旁/自分泌功能紊乱是高血压病的发病基础，高血压发病过程中多种小分子活性肽参与其中，如肾素-血管紧张素系统（renin angiotensin system, RAS）、钠尿肽（natriuretic peptides，NPs）、内皮素等，以及新发现的Apelin、偶联因子6（Coupling Factor 6）等，形成复杂的网络调节系统，共同参与高血压的发生和发展。对小分子活性肽在高血压中作用的研究，可进一步认识高血压的发病机制，以小分子活性肽为靶点防治高血压可能具有广阔的临床应用前景。近年心血管分子生物学、反向生理学、反向药理学和反向药物学以及孤儿G蛋白偶联受体策略的应用极大促进了心血管活性多肽的发现及其功能的研究，开拓了生物活性分子研究的新领。这些活性多肽大多都是小分子物质，称作小分子肽，是心血管自稳态调节的最重要成分，其功能紊乱具有重要的发病学意义。近年来，心血管活性多肽对高血压调节作用及在高血压发生机制及诊断、治疗和早期干预措施中的作用正被大家重视，其基础和临床研究不断取得新的进展，已成为当前生命科学研究中最活跃、发展最迅速的领域之一。本文将主要从最近几年在小分子活性肽的生物学效应、参与高血压发病的机理以及其在高血压中可能具有的临床应用等方面的研究作一论述。一、肾素-血管紧张素体系（renin angiotensin system, RAS）肾素-血管紧张素系统（renin angiotensin system, RAS）)是人体经典的循环调节系统，通过对心脏、血管、肾脏的调节维持机体水、电解质及血压的平衡，是人类生理功能的一个重要调节机制。它的过度激活是高血压和其他心血管疾病发展的重要决定因素，并因此成为高血压治疗的重要靶点。近年来发现组织中包括血管壁、心脏、中枢神经、肾皮质髓质中亦有肾素一血管紧张素系统，这又引申出新的RAAS的作用机制：局部组织性RAS，它在细胞中通过自分泌、旁分泌和胞分泌各自在其组织细胞发挥作用。随着近年来研究的深入，又发现了血管紧张素转换酶(ACE)的同族物——ACE2以及ACE的各种旁代谢产物如血管紧张素1-9(Angl-9)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)以及Ang 1-7的受体Mas等，其中ACE2、Ang 1-7成为研究的热点，它们在血压调节中发挥着与ACE、AngⅡ相抗衡的作用，目前被看成是心血管系统保护因子。 Ang1-7是近年发现的Ang新成员，在ACE2、脯氨基内肽酶、中性肽酶等酶的作用下水解水解Ang II、Ang I产生，与G蛋白偶联Mas受体结合，从而形成ACE2-Ang(1-7)-Mas轴，拮抗传统RAS中关键轴ACE-Ang lI-AT1的生物学活性，在体内发挥广泛的生物学效应，如强大的利钠利尿作用，具有强大的舒张血管、抗细胞增殖等作用，以及增强缓激肽效应发挥降低血压的作用。新的RAS体系参与血压调控主要依赖于ACE与AngⅡ，ACE2与Ang(1-7)两条途径，一条起升压效应；另一条对抗前一路径，引起血压下降。ACE与ACE2一旦失衡，将使体内血压改变。在ACE2相对缺乏状态，AngⅡ作用占优势，导致血管收缩增强，引发高血压。大量研究已表明，肾素-血管紧张素系统在高血压的发病以及高血压所引起的心脏和血管重塑等病理生理过程中发挥了重要的作用。心肌重塑是高血压最常见、最重要的并发症，它是导致多种心血管疾病独立的危险因子。最近发现，ACE2-Ang（1-7）-AT1轴在抑制心肌重塑方面发挥重要的作用。用慢病毒携带ACE2基因体内转染自发性高血压大鼠（SHR），ACE2基因

尿素测定方法

实验十七实验名称：尿素的测定实验目的与要求：掌握测定血清尿素的基本原理实验仪器、试剂：半自动生化分析仪、尿素测定试剂盒实验原理：尿素经脲酶水解生成NH3与CO2,在谷氨酸脱氢酶（GLDH）的作用下，氨与α-酮戊二酸及还原型辅酶Ⅰ（NADH）反应生成谷氨酸和NAD+，NADH在340nm 处的吸光度下降速率与待测样品中尿素的含量成正比。操作方法： 1、将试剂R1：R2=4：1混合，即为工作液 2、按下列顺序加入各试剂单位ml 空白标准样本蒸馏水0.01 —— 样本－－0.01 标准液－0.01 －工作液 1.0 1.0 1.0 3、混匀各管，340nm,空白管调零，延时30秒，读取初始吸光度A1，60秒后读取A2，计算ΔA 实验现象与数据：记录ΔA 结果分析与结论：尿素＝ΔA样/ΔA标×C标（8.32 mmol/l）参考范围：1.7-8.3mmol/l 临床意义：实验十八实验名称：血清尿酸的测定实验目的与要求：掌握尿酸酶-过氧化物酶耦联法测定尿酸的基本原理实验仪器、试剂：尿酸测定试剂盒，722E/723分光光度计实验原理：尿酸酶氧化尿酸，生成尿囊素和过氧化氢，在过氧化物酶催化下，过氧化氢使ESBmT和4－氨基安替比林缩合成有色化合物，其在546nm吸光度与尿酸浓度成正比。操作方法：按以下步骤操作单位ml 标准测定空白样本－0.025 －标准液0.025 －－蒸馏水－－0.025 酶试剂 1.0 1.0 1.0 混匀37℃温浴5min，以空白管调零。546nm，0.5cm比色杯，测定各管的A 实验现象与数据：记录各管的A 结果分析与结论：血清尿酸浓度＝A样/A标×C标（357μmol/l）参考值：男202－416μmol/L，女142-339μmol/L

小分子肽多肽

百病本源——神奇的小分子肽（免疫球蛋白小分子肽）益寿康免疫球蛋白小分子肽配料表：胶原蛋白肽、牛初乳冻干粉、葡萄糖、安赛蜜、卵白蛋白规格：75g（5g×15）用量：请在医生的指导下服用。（温馨小提示：本品一定要用温水冲调，记着是温水哦）本品每袋含免疫球蛋白1Gg 抗体含量560mg 免疫球蛋白来源于“黄金奶源带”的牛初乳中提取；牛初乳到加工车间加工过程不超过20分钟，以保证营养含量和抗体含量不流失。胶原蛋白肽：胶原蛋白肽来源于深海鳕鱼身上提取的。是由胶原或明胶经蛋白酶降解处理后制成的一种胶原蛋白前体产品，比普通胶原蛋白分子量小，更易消化吸收。针对于人体衰老细胞分裂、衰竭、萎缩，微整形术后损伤、新细胞再生受阻、细胞生长变异、增生等多项细胞修复功能障碍问题研发的医生营养。大量国内外研究证明，胶原蛋白肽具有多种功效，例如抑制血管紧张素转化酶活性，具有抗氧化活性，能消除自由基，减少膝关节或髋关节等骨关节炎患者的疼痛，增强骨密度，维持骨代谢平衡等。益寿康免疫球蛋白中的肽是以小分子肽的形式出现。小分子肽又称寡肽，或称为低聚肽，一般由2～10个氨基酸组成，拥有很多独特的生物活性，是蛋白质结构的功能片断，在生物体内具有重要的生理功能，小分子肽可介导细胞与细胞、蛋白质与蛋白质、细胞与蛋白质及其他非肽类药物、蛋白调控因子与基因表达之间的相互作用。所以，小分子肽虽然在生物体中含量较少，但活性强、作用大，是细胞分化、识别、免疫、应激、衰老及分子进化等一切生命过程的参与者或调节因子。小分子肽的优势：抑制——抑制细胞变性，增强人体免疫力。激活——激活细胞活性，有效清除对人体有害的自由基。修复——修复人体变性细胞，改善细胞新陈代谢。促进——促进、维持细胞正常平衡的新陈代谢。 A、四大优势 1.直接直接吸收，不需要消化，直接作用于细胞，激活细胞活性，修复基因。 2.快速快速吸收，如同针剂。主动吸收，运送营养。100%吸收，无排泄废物。 3.全面调控人体八大系统，使人体器官达到最佳运转机制。 4.安全与人体自身分泌的完全一样，对人体无任何毒副作用。 B、五大作用作用一：健壮筋骨，预防风湿、类风湿、骨质疏松、松骨、骨膜、滑膜、关节等。作用二：提高免疫力，预防白血病、白癜风、牛皮癣、甲亢、癌症等。作用三：延缓机体衰老，恢复心、肝、肺、肾等脏器功能。作用四：修复受损组织，包括胃肠粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜、眼角膜、视网膜、虹膜等。作用五:修复肝损伤，改善心脑血管、促进造血和代谢功能，调节内分泌，术后和化疗后体能恢复等。

科普一下：临床医学检验中“尿素”与“尿素氮”的正确使用!

科普一下：临床医学检验中“尿素”与“尿素氮”的正确使用！发表时间：2019-12-04T11:09:47.143Z 来源：《健康世期界》2019年15期作者：徐登波 [导读] 四川省成都市武侯区人民医院 610041 我国经济建设以来，医疗行业得到较快发展，其中医学检验技术在此过程中得到不断优化，成为临床诊断中较为重要的一种检测方法，能够有效提升临床诊断准确性，不但能够使临床工作顺利开展，而且对患者疾病情况实施全面的测定，为采取针对性治疗方案奠定良好的基础。随着人们生活质量的不断提高，生活与工作压力逐渐增加，肾病发生率逐年提升，主要是受一些因素的影响，比如饮食习惯、生活习惯以及环境等，对患者生活质量造成不同程度的影响，这就需要采用科学、有效的检验方法对疾病实施有效评价，以此能够提升临床诊断准确性，从而提高患者治疗的效果，为提升患者生活质量奠定良好的基础。本文以尿素与尿素氮为例，首先阐述尿素氮与尿素的临床检验与尿素氮临床检验意义，而后对尿素氮检验使用与常见问题进行探究，最后着重探讨尿素在临床中的使用与两者之间检验方法的正确选择，分析在临床治疗过程中检验方法的正确使用，这对选择正确的治疗方法具有加大促进作用。一、尿素氮与尿素的临床检验在对患者肾功能医学检验的过程中，尿素临床检验在其中较为重要，但是因传统书籍中把尿素编写为尿素氮，导致临床医生在对两者检验区别与分析的过程中，很难对两者有全面的理解，致使无法深入分析尿素氮与尿素检验之间存在的差异性，这对临床科学判定产生不同程度的影响，所以为了提高肾功能患者诊断正确性，需要对尿素氮与尿素临床检验进行深入分析与应用，这提供患者治疗效果，恢复肾功能具有较大促进作用。二、尿素氮临床检验意义在对尿素氮进行临床检验的过程中，会出现数值增高的情况，这在较大程度上与肾前性少尿、肾功能损伤以及摄入过多等因素有关。此外，在对尿素氮进行临床检验期间，能够有效提升临床诊断准确率，但是在一些情况下检验报告很难对患者具体病情进行准确反应，这就需要通过化验单实施针对性判断，以此对患者实际病情与病情发展得出有效结论。除此之外，还需要采用科学的临床检验方法，能够为尿素氮数值的有效控制奠定良好的基础，并且在此基础上也是提高治疗方法疗效的重要标准。尿素氮数值降低在检验的过程中也时有发生，主要是与患者怀孕、肝脏功能等因素有较大关系，若出现数值降低的情况，应当对肝功能进行全面检查，并在此基础上对此进行全面分析，以此采取针对性治疗措施，这对疾病治疗具有较大的促进作用，为患者生活质量的提升意义重大。三、尿素氮检验使用分析 1、尿素氮检验使用目前我国临床在对尿素氮检验的过程中，一般情况下正常值为3.3 mmol/L-6.0mmol/L之间为正常，其检验的主要目的是对患者肾功能情况进行准确判断，由此可以看出尿素氮在使用的过程中，对患者疾病诊断与治疗尤为重要。此外，在一些情况下对患者进行痛风检验实施评定的过程中，主要使用血尿素氮检测方法，在检验的过程中首先需要对患者近期饮食情况、身体状况以及服用药物类型等进行全面了解，以此为提升检验结果的准确性奠定良好的基础，能够有效提高检验结果分析的准确性，与此同时对检验结果产生的不良影响的有效降低具有较大促进作用。在对尿素氮临床检验的过程中，对检验结果进行评定分析，能够为患者临床诊断与针对性治疗提供有利的数据依据。 2、尿素氮临床检验常见问题我国尿素氮在进行临床检验的过程中存在一些问题，比如抗凝剂使用不当、稳定性差以及NADH不足等问题，所以需要对患者临床实际检验中存在的问题进行深入分析，并在此基础上采取针对性解决方法，不但能够避免问题的发生，而且还可为检验准确性的提高奠定良好的基础，这对提高患者生活质量尤为重要。但是，因尿素氮中NADH稳定性相对较差，并且易被氧化，根据目前医疗技术很难对此问题进行解决，这就需要在检验期间应采取有效措施，最大程度降低环境因素的影响，并且在此基础上还需要对检测偏差进行纠正，以此确保将偏差降至最低，可有效提升检验结果的准确性，从而使尿素氮临床医学检验具有较高的科学性与可靠性。四、尿素在临床医学检验中的使用尿素与尿素氮之间能够相互转换，并且有固定的转换公式：mg/dL尿素氮0.0357=mmol/L尿素。尿素在临床医学检验的过程中，与尿素氮之间需要进行转换，在转换的过程职工能够通过计算来完成，但是在实际检验的过程中，不能只通过简单计算对尿素实施有效检验，其中与尿素氮检验相比较为全面，并且在此基础上具有较高的准确性，能够针对患者疾病情况收集评价信息。目前，尿素医学临床检验一般情况下采用尿素酶方法与直接方法实施有效测定，其中直接方法是通过尿素与相关试剂之间的有效作用，而对肾功能测定的方法主要使用二乙酰胯方法，尿素酶在医学检验的过程中，主要是将尿素转换成氨，再实施测定的一种方法，两者方法相比，直接方法在检测的过程中相对简单，并且在此基础上具有较高的灵活性，但是在检验期间加热环节会出现不同程度的异味，对检验过程产生一定影响，随着医学技术的不断发展逐渐被尿素酶替代。尿素酶所采用的方法具有较高的特异性，并且反应专一，不受外界因素的影响，具有较高的准确率，其缺点是检测过程需要花费大量时间来完成，并且会受到氨的影响。这就需要在临床实际应用的过程中，根据患者实际情况针对性选择检测方法。在检测的过程中，还应采取有效措施降低外部因素与内部因素造成的影响，从而为检测准确率的提升奠定良好的基础，也为临床医师进行准确诊断提供有利依据。五、正确选择尿素与尿素临床检验方法尿素氮与尿素两种临床检验方法在检验期间会受到较多因素的影响，这就需要在检测期间对影响因素与实际检测情况进行深入分析，以此选择科学合理的检验方法。此外，检验工作人员需要认识到检验方法选择的重要性，并且检验方法选择完成后需要对患者实际疾病情况进行全面了解，同时此基础上对医院医疗技术进行分析，针对性选择制备检测过程中所使用到的材料与试剂，能够确保检验结果的正确性，以此避免因一些材料与试剂存放不正确导致检验结果出现偏差。除此之外，检验工作人员还应采取有效措施对检验结果产生的偏差与

尿素的测定方法第7部分：粒度筛分法(标准状态：现行)

I C S65.080 G20 中华人民共和国国家标准 G B/T2441.7 2010 代替G B/T2441.7 2001 尿素的测定方法第7部分:粒度筛分法 D e t e r m i n a t i o no f u r e a P a r t7:P a r t i c l e s i z e S i e v em e t h o d 2010-06-30发布2011-01-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

前言 G B/T2441‘尿素的测定方法“分为以下九个部分: 第1部分:总氮含量; 第2部分:缩二脲含量分光光度法; 第3部分:水分卡尔四费休法; 第4部分:铁含量邻菲啰啉分光光度法; 第5部分:碱度容量法; 第6部分:水不溶物含量重量法; 第7部分:粒度筛分法; 第8部分:硫酸盐含量目视比浊法; 第9部分:亚甲基二脲含量分光光度法三本部分为G B/T2441的第7部分三本部分代替G B/T2441.7 2001‘尿素测定方法粒度的测定筛分法“三本部分与G B/T2441.7 2001相比主要变化是:分析步骤中增加了人工筛分三本部分由中国石油和化学工业协会提出三本部分由全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会(S A C/T C105)归口三本部分起草单位:国家化肥质量监督检验中心(上海)三本部分主要起草人:张求真二孙丹三本部分所代替标准的历次版本发布情况为: G B/T2448 1981,G B/T2448 1991,G B/T2441.7 2001三

尿素的测定方法第7部分:粒度筛分法 1范围 G B/T2441的本部分规定了用筛分法测定尿素的粒度三本部分适用于由氨和二氧化碳合成制得的尿素粒度的测定三 2规范性引用文件下列文件中的条款通过G B/T2441的本部分的引用而成为本部分的条款三凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本三凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分三 G B/T6003.1 1997金属丝编织网试验筛(I S O3310-1:1990,E Q V) 3原理用筛分法将尿素分成不同粒径的颗粒,称量,计算质量分数三 4仪器 4.1孔径0.85m m二1.18m m二2.00m m二2.80m m二3.35m m二4.00m m二4.75m m和8.00m m试验筛 (G B6003.1中R40/3系列),附筛盖和底盘; 4.2感量0.5g的天平; 4.3振荡器,能垂直和水平振荡三 5分析步骤 5.1根据被测物料,按粒度d(0.85m m~2.8m m二1.18m m~3.35m m二2.00m m~4.75m m二 4.00m m~8.00m m)选取一套(两个)相应的试验筛三 5.2将筛子按孔径大小依次叠好(大在上,小在下),装上底盘,称量约100g实验室样品(精确到0.5g),将试料置于依次叠好的筛子上,盖好筛盖,置于振荡器上,夹紧,振荡3m i n,或人工筛分三称量通过大孔径筛子及未通过小孔径筛子试料,夹在筛孔中的颗粒按不通过计三 6分析结果的表述粒度w,以质量分数(%)表示,按式(1)计算: (1) w=m1?100 m 式中: m1 通过大孔径筛子和未通过小孔径筛子试料的质量的数值,单位为克(g); m 试料的质量的数值,单位为克(g)三计算结果表示到小数点后一位三

SDS-PAGE电泳标准操作流程

SDS-PAG电泳标准操作规程（网上） 3. 程序: 端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。 3.1.2分离胶的配置 3.122 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内（胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm）。 3.1 . 2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。 3.1.3浓缩胶的配置混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内（分离胶上方），轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。 3.2.1安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%勺凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly 电泳缓冲液。 3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80 pl的样品，依次加上20Q 5x buffer （加了B-巯基乙醇），混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer （加了B-巯基乙醇）煮沸10分钟。 3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10 p l，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。 3.2.4电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。 3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。 3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时, 完成后染液倒掉并用水洗掉染液。 3.4. 脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。 3.5. 拍照将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。 4. 注意事项 4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%交；50KD-30KD选用12%胶； 30KD-10KD选用15%交。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。 4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。 4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。 4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过

血清尿素氮BUN谷氨酸脱氢酶测定法作业指导书

血清尿素氮BUN谷氨酸脱氢酶测定法作业指导书 1.实验原理脲酶-谷氨酸脱氢酶（Urease-GLDH）连续监测法。尿素被脲酶水解产氨。在NADH的存在下，氨和α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，NADH同时被氧化成NAD＋。NADH的减少和样品中尿素浓度成正比。本法是连续监测法。脲酶尿素+ 2H2O 2 NH4＋+ 2 HCO3－谷氨酸脱氢酶 NH4＋+α-酮戊二酸+NADH L-谷氨酸+NAD＋+H2O 2 标本： 2.1 病人准备：血清无特殊要求。要留取24小时尿样。 2.2 类型：血清、血浆（不可使用肝素铵）、新鲜尿液。无溶血和凝块的血清，如果必须使用血浆，建议使用

无铵离子的抗凝血剂，如EDTA和肝素钠。用新鲜尿液作样品时，用蒸馏水作1:100稀释。 3. 标本存放：血清或血浆稳定性：4～25℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定1年。尿液稳定性：20～25℃保存可稳定2天；4～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定1个月。 4. 标本运输：常温条件下保存运输。 5. 标本拒收标准：细菌污染的标本。 6. 实验材料 6.1 试剂：申能尿素测定试剂盒（142 3107170 1 试剂1：6×64ml＋试剂2：6×16ml） 6.1.1 试剂组成试剂1： Tris缓冲液pH7.8 120mmol/L α-酮戊二酸7mmol/L ADP 0.6mmol/L 谷氨酸脱氢酶≥1000U/L

脲酶≥6000U/L 试剂2： NADH 0.25mmol/L 6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。 6.1.3 试剂稳定性与贮存试剂保存于2～25℃，若无污染，可稳定至失效期。试剂不可冰冻。 6.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。 6.1.5 注意事项：此试剂为体外诊断用。不要入口，吞下有害。保护剂为叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜，与下水管中的铅反应形成爆炸性化合物，即使只含有少量的叠氮钠，如果排向下水道请用大量的水冲洗。应采取必要的预防措施使用试剂。 6.2 校准品：使用DiaSys公司提供的TruCal U校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品

美极客小分子肽-徐老师

美极客小分子肽-徐老师要想知道获得健康，那么就要知道人类为什么会生病，是吗？从根源找起。徐老师微信：746894458我们人体是由什么组成的？细胞对吗？那么我们人类就不该有成千上万种病，而是只有一种病，那就是细胞故障，我们的细胞生病了为什么我们的细胞会生病呢？细胞得不到需要的营养，因为我闷偏食，喜欢的就拼命吃，不喜欢得一口不吃，又因为平时我们吃的东西都含有一定得毒素，时间一长造成了毒素超载，从而细胞就生病了了！我们身体的毒素只有20%通过排便系统排出来的。剩下得80%都将进入我们得血液里，最后导致疾病，那么得病了怎么办？世界卫生组织告诉我们说，治愈疾病的最有效的途径就是修复细胞，改善细胞，激活细胞，如何做到这些呢，那就是要补充能够合成肽的物质，叫做活性肽。徐老师微信：746894458什么是肽？肽是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，是介于大分子蛋白质和氨基酸之间的一段最具活性、最易吸收、生理功能效价高的一种崭新营养。分子量段在5000~180之间的才能称为“肽”。分子量段在5000~3000之间的肽称为“大肽”；分子量段在3000~1000之间的肽称为“多肽”，分子量段在1000~180之间的称为“小肽”、“寡肽”、“低聚肽”，也称为小分子活性多肽，一般由

2~6个氨基酸组成。生物学家将肽称为“氨基酸链”，将小分子活性多肽统称为“生物活性肽”。“酶法多肽”是生物活性肽中一类具有极强活性和多样性，具有天然绿色食品属性，功效营养成份最完整的小分子活性肽。到现在，人们已发现100多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，在世界范围内已经出现了一个空前的繁荣景象。肽的特点就是直接吸收不需要经过肠胃消化，第二就是快速吸收，喝下去5-10分钟就进入我们所有器官血液，徐老师微信：746894458肽是构成人体细胞的基本材料，人体的一切活性物质都是以肽的形式存在，没有肽生命就会停止。科学家研究发现，30岁以后，活性肽在体内的分泌量会逐渐下降，尤其是生存环境的破坏以及不健康的生活方式导致现代人严重缺肽，缺肽会导致细胞逐渐萎缩，分裂减缓，并失去原有的活力，这时组织器管慢慢萎缩，功能渐渐退化，身体开始快速衰老并且疾病丛生。人体各个领域，包括激素，神经，生殖及细胞的更新，代谢，生长，修复，以及各个器官和细胞得生理功能都有肽的参与，所以我们要健康就要立刻补肽，是不是，很多运动员或者健美人士都知道要补蛋白质，所以去喝那些桶装蛋白质粉，其实他们不知道直接喝蛋白质作用不是很大，为什么呢？第一就是液体蛋白，人体分解它的能力很弱，第二呢，液体蛋白遇酸就会变性，而我闷得胃是不是酸性的，所以大多数的蛋白质都被破坏了！而只有小分

实验十三血清尿素氮测定(脲酶—Berthelot比色法)

实验十三血清尿素氮测定（脲酶—Berthelot比色法）一、实验目的与要求 1 了解血液尿素氮（BUN）在人体营养学上的生理学意义及其在代谢上的重要性。 2 掌握血液尿素氮测定方法及721分光光度计或AT648半自动生化多用仪的使用方法和现代生化检测试剂盒的应用。二、实验原理尿素在脲酶作用下分解生成氨。在碱性条件下，经次氯酸氧化生成的氯胺与苯酚被亚硝基铁氰化钠催化生成蓝色的靛酶。其反应式为： CH2NH2N尿素O+HOH脲酶NH3彩+CHOH2N氨基甲酸O-2NH3+CO2 氨 NH3+OCl-NH2Cl+OH- 次氯酸氨胺催化剂 NH2Cl+OH+OH-Cl-+H2O+HONH2 苯酚P胺基苯酚 HONH2+OH-+O2==N——O-+H2O 酚靛三、实验仪器与试剂 1 仪器（1） AT648半自动生化分析仪1台；（2） 4孔恒温水浴锅1个；（3）振动摇床1台。 2 分组及仪器2人一组，每组仪器包括：（1）试管架1个；（2） 2ml试管10个；（3） 20μl微量加样器1个；（4） 1ml移液管1个；（5） 5ml移液管2个；（6）吸耳球1个；（7）搪瓷盘1个；（8）微量加样滴头；（9）吸水纸。 3 本试剂盒内含5种试剂：（1）脲酶（冻干） 2瓶（2） pH 8.0缓冲液：由乙二胺四乙酸二钠盐和磷酸氢二钾组成 1×46ml （3）显色剂Ⅰ：由苯酚和亚硝基铁氰化钠组成 1×225ml （4）显色剂Ⅱ：由氢氧化钠和安替福民组成 1×225ml （5）尿素氮标准液（20mg/dl） 2×2ml 四、实验步骤 1 血清（1）取脲酶一瓶，用23.0ml pH 8.0缓冲液溶解。（2）于一系列试管中，按下表加入各溶液。表131系列反应管中所加溶液的量空白管标准管样品管样品（μl）——20标准液（μl）—20—酶液（μl）0.50.50.5 （3）于37℃水浴中保温15min，然后各管分别加入显色剂Ⅰ和显色剂Ⅱ各2.5ml。（4）再于37℃水浴中保温20min，取出冷却至室温，于721分光光度计/ AT648半自动生

大豆小分子肽详细介绍

大豆多肽大豆多肽(soy peptide) ,即肽基大豆蛋白水解产物( peptide - based soy protein hydroly-sate)的简称。它来源于大豆蛋白质的酶解产物，是大豆蛋白质经蛋白酶作用后，再经特殊处理而得到的蛋白质水解产物。大豆中的蛋白质含量高，质量好，营养价值很高，与牛肉的营养价值大致相当。大豆蛋白质所含必需氨基酸种类全面，数量丰富,必需氨基酸模式(氨基酸比值)与人体需求较接近,消化率也较高。大豆多肽通常是由3~6个氨基酸组成的低肽混合物,相对分子质量分布以低于1000D的为主，主要出峰位置在相对分子量300 -700D范围内。其氨基酸的组成与大豆球蛋白十分相似，必需氨基酸的平衡良好,含量也很丰富,因此营养价值很高。大豆多肽的特点 (一)黏度较低，溶解度较高大豆蛋白的黏度随浓度的增加而显著增加。因此，大豆蛋白的浓度不能提得太高,超过13%就会形成凝胶状。若加工成酸性蛋白饮料时，pH值接近4.5左右(大豆蛋白的等电点)时就会产生沉淀。而大豆多肽则没有上述缺点。它的黏度较低而溶解度较高，这是因为水解物的分子量减小了；水解后产生了一些可离解的氨基和羧基基团,增加了水解物的亲水性。与大豆蛋白质相比，大豆多肽具有以下特点:①即使在高浓度时,其黏度较低:②在较宽的pH值范围内仍能保持溶解状态;③吸湿性与保湿性好。大豆多肽的这些性质有利于开发新产品。 (二)渗透压不高大豆多肽溶液的渗透压的大小处于大豆蛋白与同一组成氨基酸混合物之间。当一种溶液的渗透压比体液高时,易使人体消化道周围组织细胞中的水分向胃肠腔内移动而出现腹泻。氨基酸类食品口服易发生这类问题。大豆多肽的渗透压比氨基酸的低得多。因此，大豆多肽可作为口服营养液使用。 (三)吸湿性，保湿性强大豆多肽的吸湿性和保湿性比胶原蛋白多肽和丝蛋白多肽更强,这一特性非常适合于日用化学工业用来配制护发膏及护发霜。 (四)能调节产品质构大豆多肽具有抑制蛋白质形成凝胶的特性,可用来调整食品的硬度与质构。例如，水产品肉禽蛋白质及大豆蛋白质在加热时会形成凝胶，或面粉在形成面团时都会使质构变硬，如果添加一定量的大豆多肽,就会起到软化凝胶的作用。这一特性，可应用于火腿、香肠、鱼糕等高蛋白食品的软化。大豆多肽的功能特性大豆多肽即“多肽基大豆蛋白水解物"的简称,是大豆蛋白质经蛋白酶作用或微生物技术

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理： SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，

加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH 6.7，定容至100ml，4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。实验操作

设计一个制作抗小分子多肽单克隆抗体的流程

实验生物学考试部门：研发姓名：王晓婧8．叶敏设计一个制作抗小分子多肽单克隆抗体的流程用杂交瘤技术制备抗小分子多肽单克隆抗体的主要步骤如下（示意图见下图）： 1、获得免疫的B淋巴细胞用此小分子多肽作为抗原注射进小鼠体内，使其淋巴细胞产生相应的抗体。对小鼠做三次免疫，并在取其脾脏的前三天做一次加强免疫，可使得到的抗体亲和力较好，此过程中不用分离脾脏中的B细胞和T细胞，因为与骨髓瘤融合的过程本身就是一个选择B细胞的过程。取与免疫小鼠同系的小鼠的骨髓瘤细胞，可用不分泌型和酶缺陷型，现多用酶缺陷型，缺乏TK（胸腺嘧啶核苷激酶）和HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）。 2、融合可用化学融合法和电融合法等。常用的化学融合剂为PEG（聚乙二醇），其分子量越大，融合率越高，但同时毒性也越强，故用作细胞融合剂的PEG一般选用分子量为4000及以下的，在pH8.0～pH8.8左右的碱性环境中。电融合用电脉冲，无毒且融合率也高。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶Thymidine T）。在HAT 培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏TK和HGPRT，不能利用补救途径合成DNA，而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，故不可避免的要死亡。停用HAT培养基后，用HT培养基。未融合的B细胞和T细胞在正常培养的情况下都会自然消亡。这样，只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了TK和HGPRT，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能增殖。 4、筛选在HA T培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此必须进行筛选。常用酶联免疫吸附测定（ELISA），筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。 5、克隆化对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌

(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法

SDS-PAGE 一. 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。二. 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；

血清尿素氮BUN谷氨酸脱氢酶测定法

血清尿素氮BUN谷氨酸脱氢酶测定法 1.实验原理脲酶-谷氨酸脱氢酶（Urease-GLDH）连续监测法。尿素被脲酶水解产氨。在NADH的存在下，氨和α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，NADH同时被氧化成NAD＋。NADH 的减少和样品中尿素浓度成正比。本法是连续监测法。脲酶尿素+ 2H2O 2 NH4＋+ 2 HCO3－谷氨酸脱氢酶 NH4＋+α-酮戊二酸+NADH L-谷氨酸+NAD ＋+H 2O 2 标本： 2.1 病人准备：血清无特殊要求。要留取24小时尿样。 2.2 类型：血清、血浆（不可使用肝素铵）、新鲜尿液。无溶血和凝块的血清，如果必须使用血浆，建议使用无铵离子的抗凝血剂，如EDTA和肝素钠。用新鲜尿液作样品时，用蒸馏水作1:100稀释。

3. 标本存放：血清或血浆稳定性：4～25℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定1年。尿液稳定性：20～25℃保存可稳定2天；4～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定1个月。 4. 标本运输：常温条件下保存运输。 5. 标本拒收标准：细菌污染的标本。 6. 实验材料 6.1 试剂：奥林巴斯尿素测定试剂盒试剂1：＋试剂2：6.1.1 试剂准备：试剂为即用式。 6.1.2 试剂稳定性与贮存试剂保存于2～25℃，若无污染，可稳定至失效期。试剂不可冰冻。 6.1.3 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。 6.1.4 注意事项：此试剂为体外诊断用。不要入口，吞下有害。保护剂为叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜，与下水管中的铅反应形成爆炸性化合物，即使只含有少量的

小分子肽电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽 [日期：2007-02-13] 来源：[字体：大中小] SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽第四军医大学学报2000年第21卷第6期石继红赵永同王俊楼韩苇颜真张英起摘要：目的研究SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示小分子多肽的方法.方法观察不同方法处理的样品，上样量对电泳结果的影响及对分子量标准（M r2512～16949）进行直线回归分析.结果样品的不同处理条件未见有差异；在该实验系统条件下上样样品为每孔5～10μg较佳；分子量标准直线回归系数r=-0.962.结论样品处理方便；上样量少；在160 g·L-1 T，60 g·kg-1 C较低的丙烯酰胺含6 mol·L-1脲的分离胶中能够显示M r为2512的多肽，是一种显示小分子多肽的较好方法. 关键词：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；肽；蛋白质 0引言

20世纪60年代Shapiro建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性，但对于M r小于10000的蛋白质来说是无能为力的［1］. 20世纪80年代初Sch?gger等［2］应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，但分离效果不甚理想且重复性较差.之后他们又进行了系统地研究和摸索，能够分离较大M r范围内的蛋白质.随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出.我们在进行基因工程药物的开发研制中，对SDS-PAGE方法进行了多次改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了理想的结果.此法所需仪器简单，操作方便，重现性好，时间短，只需微克量的多肽便可显带且能迅速估计出其M r，值得进一步推广和利用. 1材料和方法 1．1试剂和仪器SDS、脲、甘油、过硫酸铵均为分析纯，西安化学试剂厂出品；丙烯酰胺（分析纯）为汕头市光华化学厂产品；N，N′-甲叉双丙烯酰胺（分析纯）为浙江黄岩人民化工厂生产；tris（分析纯）为成都试剂厂出品；TEMED为BIO-RAD产品；Tricine(Ultra pure Grade)为Solon Ind产品. BIO-RAD小型垂直式电泳附件模具；FD-201 稳压稳流电泳仪（上海医用分析仪器厂）. 1．2肽分子质量标准肽分子质量标准的M r范围2512～16949为Pharmacia lKB 公司产品. 胸腺肽α1是美国加州圣马刁市赛生药品公司产品（商品名“ZADAXIN”），是一乙酰化的多肽，M r为3108，pI 3.8. 经Sephadex G-25柱去除所含的甘露醇，然后冷冻干燥，用样品缓冲液配成所需样品. 1．3方法 1．3．1电泳贮存液的配制阳极缓冲液中Tris为0.2 mol·L-1用HCl调pH值至8.9.阴极缓冲液为0.1 mol·L-1的Tris，0.1 mol·L-1的Tricine和0.01 g·L-1的SDS溶液，其pH 值约为8.25. 胶缓冲液为3.0 mol·L-1的Tris和0.03 g·L-1的SDS，用HCl调pH值至8.4. 称取48 g丙烯酰胺和1.5 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，溶解混匀后经4号滤纸过滤即得到495 g·L-1 T，30 g·kg-1 C的贮存液；称取46.5 g丙烯酰胺和3.0 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，同样得到495 g·L-1 T，60 g·kg-1 C的贮存液（T 代表丙烯酰胺的总浓度，C代表交联度）.

实验五血清尿素氮的测定

血清尿素氮的测定一.实验原理血清中尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸溶液中共煮时，可生成双乙酰和尿素形成的红色复合物(二嗪衍生物)，其颜色深浅与尿素含量成正比，与同样处理的尿素标准液比色。即可求得血清中尿素的含量。由于反应在强酸中进行，所产生的羟胺是干挠物质，所以必须用氧化剂将其氧化除去。在呈色反应中产生的有色复合物对光不稳定．加入氨基硫脲可增加其稳定性，还可提高尿素与双乙酰反应的灵敏度。二.实验操作取试管3支，注明空白管、标准管、测定管，按下表操作 540nm比色，以空白管调零，测定各管吸光度值。三.计算

血清尿素氮（mmol / L ）=——————— X 17.85 测定管吸光度标准管吸光度正常值参考范围3．57～14．28mmol ／L 四.临床意义血液中非蛋白含氮化合物包括尿素、尿酸、肌酸、肌酐、胆红素及氨等。其中尿素含量约占l ／3～1／2。尿素是蛋白质代谢的产物．通过肾脏排出，故测血清尿素氮可作为检测肾脏功能的试验，并且其增高程度与病变的严重程度呈平行关系。五.试剂 1.尿素氮试剂：蒸馏水lOOml ，浓硫酸44ml ，85％磷酸66ml ，冷却至室温后，加氨基硫脲50mg ，硫酸镉(3CdSO ４·8H 2O)2g ，溶解后稀释至1000ml 。 2.20g ／L 二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟20g ，加入蒸馏水约900ml ，溶解后稀释至1000ml. ３.尿素氮标准贮存液(357mmol ／L)：称取尿素1.072g 溶解于蒸馏水中定容至1000ml 。４.尿素氮标准应用液(17.85mmol ／L)；取贮存液5ml ，加蒸馏水至100ml 。