细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法.doc
“动物的克隆”知识梳理与概念辨识
杨念文（舟山中学316000）
1．动物细胞培养和组织培养
动物细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
动物组织培养：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。培养过程中可以伴随组织分化。广义的组织培养包括细胞培养、组织培养和器官培养。动物克隆的技术基础是动物的细胞和组织培养。
培养的过程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
培养的条件：①无菌、无毒的环境。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。②营养（合成培养基成分）：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，通常需加入血清、血浆等天然成分。③适宜温度、pH：哺乳动物多以36.5℃±0.5℃为宜；多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。
动物细胞培养与植物组织培养的区别
2．原代培养和传代培养
原代培养：从机体取出后立即进行的细胞、组织培养称为原代培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
传代培养：将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖，称为传代培养。严格地说，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶就称为传代培养。
3．细胞系与细胞株
细胞系：是指能够可连续传代培养的细胞群体，这个群体可能包含多个种类的细胞。原
代培养物开始第一次传代培养后的细胞称之为细胞系。其中，能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的细胞称为有限细胞系。大多数二倍体细胞为有限细胞系。无限细胞本质上已是发生转化（遗传物质改变）的细胞系，如肿瘤细胞。
细胞株：用单细胞分离增殖形成的或通过筛选细胞系获取的具有特殊性质纯化细胞群称细胞株。即是由一个祖先细胞经过增殖形成的细胞系，此细胞群体中所有细胞的生物学性能和理化性质都是一致的。可以说，细胞株是一种特殊的细胞系，细胞系的概念中包含细胞株。可连续多次传代的细胞株称为连续细胞株；可传代次数有限的细胞株称为有限细胞株。
动物的克隆培养法或细胞克隆即是建立细胞株。所以必须保证所建成的克隆来源于单个细胞。
4．细胞融合与细胞杂交
细胞融合：是指两个或多个细胞融合形成一个细胞的现象。
细胞杂交：细胞融合可以在基因型相同或不同的细胞间进行，其中基因型不同的细胞间融合就是细胞杂交。
动物细胞融合与植物细胞融合的比较
植物细胞融合（番茄－马铃薯植株）动物细胞融合（单克隆抗体）过程
第1步原生质体的制备（酶解法）正常小鼠的处理（注射灭活抗原）
第2步原生质体的融合（物化法）动物细胞融合（物化生法）
第3步杂种细胞的筛选和培养杂交瘤细胞的筛选和培养
第4步杂种植株鉴定提纯单克隆抗体（特异性强、灵敏度高）原理/理论基础细胞膜的流动性、植物细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞增殖
融合前处理酶解法除去细胞壁：纤维素酶、果胶酶注射特定抗原法免疫处理正常小鼠
促融因子
物理法：电激、离心、振动
化学法：聚乙二醇、CaCl2等
物化法：与植物相同
生物法：灭活的仙台病毒意义和用途
①克服有性远缘杂交不亲和性，获得杂
种植株；②克服有性杂交的母系遗传，
获得细胞质基因的杂合子，是研究细胞
质遗传的有力手段
制备单克隆抗体的技术之一，有助于疾
病的诊断、治疗、预防
5．动物体细胞核移植和克隆动物
动物核移植：是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。
体细胞核移植的大致过程如下图：
克隆动物：用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。动物的克隆繁殖的理论基础是细胞核的全能性，属于无性繁殖。
与新个体产生相关的个体有三个：体细胞核供体、卵细胞细胞质供体、代孕母体。新个体细胞核基因型与体细胞核供体完全一样，因此新个体性状与体细胞核供体基本相同。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
细胞生物学常用研究方法
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
细胞转染操作方法及各方法比较
细胞转染操作方法 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。 三、第二次细胞传代 1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
软件工程-原理、方法与应用【第三版】复习总结
第一章绪论 1.每18个月芯片的性能和速度均提高一倍，每隔12年软件生产大约提高一倍。 2.软件：是能够完成预定功能和性能的可执行的计算机诚信度。包括使程序正常执行所需的数据，以及有关描述程 序操作和使用的文档。即：软件= 程序+ 文档 3.软件的特征： 软件的开发不同于硬件设计、不同于硬件制造、不同于硬件维修。 4.软件危机出现的原因： 软件维护费用的急剧上升，直接威胁计算机应用的扩大； 软件生产技术进步缓慢，是家居软件危机的重要原因。 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5.软件工程学的范畴： 软件开发技术（软件开发方法学、软件工具、软件工程环境）、软件工程管理（软件管理学、软件经济学、度量学）。 6.软件工程：是指导计算机软件开发和维护的工程学科。它采用工程的概念、原理、技术和方法来开发与维护软件， 目的是为了实现按照预期的进度和经费完成软件生产计划，同时提高软件的生产率和可靠性。 7.软件的发展：大体经历了程序、软件、软件产品3个阶段。 8.工具和方法是软件开发技术的2大支柱。 9.3种编程泛型： 过程式编程泛型、面向对象编程泛型、基于构件技术的编程泛型 10.面向对象程序设计中，数据和操作被封装在一个对象中，对象之间则是通过消息相互联系。 11.构件：标准化/规格化的对象类。 12.常用变成力度的大小来比较3种编程泛型的差异。 粒度由小到大依次是：过程式编程范式、面向对象编程范式、基于构件的编程泛型。 13.软件工程的分化： 传统软件工程：结构化分析-》结构化设计-》面向过程编码-》软件测试 面向对象软件工程：OO分析与对象抽取-》对象详细设计-》面向对象的编码与测试 基于构件的软件工程（以可复用构件和测试工具为后盾）： 领域分析和测试计划定制-》领域设计-》建立可复用构件库-》按‘构件集成模型’查找与集成构件 14.分析先于设计，设计先于编码，使程序（的结构）适合于问题（的结构）。 第二章软件生存周期与软件过程 1.软件生存周期：计划、开发、运行3个时期。 需求分析-》软件分析-》软件设计-》编码测试-》软件测试-》运行维护 2.需求分析（用户视角）：功能需求、性能需求、环境约束、外部接口描述。 3.软件分析（开发人员视角）：建立与需求模型一致的，与实现无关的软件分析模型。 4.软件设计：总体设计/概要设计、详细设计（确定软件的数据结构和操作）。 5.单元测试通常与编码同时进行。 6.软件测试：单元测试、集成测试、系统测试。 7.Boehm软件生存周期的划分：系统需求、软件需求、概要设计、详细设计、编码纠错、测试和预运行、系统维护。-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8.瀑布模型特点：阶段间的顺序性和依赖性、推迟实现的观点、保证质量的观点。 9.瀑布模型存在的问题：只有在需求分析准确的前提下，才能得到预期的结果。 快速原型模型：原型系统只包括对未来系统的主要功能以及系统的重要接口。特点：快速开发工具、循环、低成本。种类：渐进型、抛弃型。
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
细胞转染操作步骤
RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix
加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参
软件工程-原理、方法及应用(史济民第二版)答案
软——应 课习题 件工程原理、方法与用后答案最完整版 绪论 1.什么是软件危机？为什么会产生软件危机？ 答：软件危机是指在计算机软件的开发和维护过程中遇到的一系列严重问题。 (1).软件维护费用急剧上升，直接威胁计算机应用的夸大。 (2).软件生产技术进步缓慢 2. 什么是软件生产工程化？工程化生产方法与早期的程序设计方法主要差别在哪里？ 答：结构化程序设计地出现，使许多产业界认识认识到必须把软件生产从个人化方式改变为工程化。采用工程的概念、原理、技术和方法开发与维护软件，把经过时间考验而证明正确的管理技术和当前能够得到的最好的技术方法结合起来，以经济地开发出高质量的软件并有效地维护它，这就是软件工程，同时这也是工程化生产方法。 3. 分别说明（1）软件开发方法与开发工具；（2）软件技术与软件管理的相互关系。 答：（1）工具和方法，是软件开发技术的两大支柱，它们密切相关。当一种方法提出来并证明有效后，往往随之研制出相应的工具，来帮助实现和推行这种方法。新方法在推行初期，总有人不愿接受和采用。若将新方法融合于工具之中，使人们通过使用工具来了解新方法，就能更快促进新方法的推广。 （2）在工业生产中，即使有先进的技术和设备，管理不善的企业也不能获得良好的效益。 软件在生产中不能按质按时完成计划，管理混乱往往是其中的重要原因。所以对于一个理想的软件工程环境，应该同时具备技术和管理两个方面。 4.试从你的亲身实践，谈谈软件工具在软件开发中的作用。 答：用C++开发一个软件，是校园一卡通的模块。首先，要在编辑程序支持下在计算机中输入源程序。然后编译程序，把源程序翻译成目标程序。如果发现错误，就重新调入编辑程序对源程序进行修改。编译通过后，再调用连接程序吧所有通过了编译目标程序连同与之有关的程序连接起来，构成一个能在计算机上运行的可执行软件。编译程序，编辑程序，连接程序以及支持他们的计算机操作系统，都属于软件工具。离开这些工具，软件开发就是去了支持，变得十分困难和低效，甚至不能运行。5.什么是软件工程环境？谈谈你对环境重要性的认识。 答：方法与工具相结合，再加上配套的软、硬件支持就形成环境。例如在批处理时代，用户开发的程序是分批送入计算机中心的计算机的，有了错误，就得下机修改。程序员对自己写的程序只能继续地跟踪，思路经常被迫中断，效率难于提高。分时系统的使用，使开发人员从此能在自己的终端上跟踪程序的开发，仅此一点，就明显提高了开发的效率。 6. 何谓面向对象软件工程？简述它与传统软件工程在各型软件开发中的作用。 答：以面向对象程序设计为基础。 7. 软件按规模大小可分成哪几类？简述软件工程中各型软件开发中的作用。 答：按规模分为极小、小、中、大、甚大、极大。 （1）中小型软件：软件工程对改进软件质量，提高程序员生产率和满足用户的需求，有很大的作用。（2）大型软件：这类软件必须从头至尾坚持软件工程的方法，严格遵守标准文档格式和正规的复审制度，才能避免或减少混乱，真正开发出大型的软件。 8. 什么是形式化软件开发方法？实现这类开发的困难和出路在哪里？
细胞生物学研究方法
一、章（节、目）授课计划第页
二、课时教学内容第 技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有 显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技 术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的 方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有: 核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨率 R=λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。 （2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的 比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是 100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决 定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的 d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： M=d′/d 二、显微镜的分类 现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学
分子对接的原理,方法及应用
分子对接的原理，方法及应用 （PPT里弄一些分子对接的照片，照片素材文件里有） 分子对接 是将已知三维结构数据库中的分子逐一放在靶标分子的活性位点处。通过不断优化受体化合物的位置、构象、分子内部可旋转键的二面角和受体的氨基酸残基侧链和骨架，寻找受体小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象，并预测其结合模式、亲和力和通过打分函数挑选出接近天然构象的与受体亲和力最佳的配体的一种理论模拟分子间作用的方法。 通过研究配体小分子和受体生物大分子的相互作用，预测其亲和力，实现基于结构的药物设计的一种重要方法。 原理： 按照受体与配体的形状互补，性质互补原则，对于相关的受体按其三维结构在小分子数据库直接搜索可能的配体，并将它放置在受体的活性位点处，寻找其合理的放置取向和构象，使得配体与受体形状互补，性质互补为最佳匹配 （配体与受体结合时，彼此存在静电相互作用，氢键相互作用，范德华相互作用和疏水相互作用，配体与受体结合必须满足互相匹配原则，即配体与受体几何形状互补匹配，静电相互作用互补匹配，氢键相互作用互补匹配，疏水相互作用互补匹配） 目的： 找到底物分子和受体分子的最佳结合位置 问题： 如何找到最佳的结合位置以及如何评价对接分子之间的结合强度 方法： 1、首先建立大量化合物的三维结构数据库 2、将库中的分子逐一与靶分子进行“对接” 3、通过不断优化小分子化合物的位置以及分子内部柔性键的二面角，寻找小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象，计算其相互作用及结合能 4、在库中所有分子均完成了对接计算之后，即可从中找出与靶标分子结合的最佳分子 应用： 1）直接揭示药物分子和靶点之间的相互作用方式 2）预测小分子与靶点蛋白结合时的构象 3）基于分子对接方法对化合物数据库进行虚拟筛选，用于先导化合物的发现
病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
(完整版)第三章细胞生物学研究方法总结
第三章 细胞生物学研究方法 第一节细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sinα/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1．FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2．不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜 的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微 小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一）电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大有效放大倍 数 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二）主要电镜制样技术介绍
传媒大学专业介绍(doc 15页)
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专业名称（代码）研究方向（代码）拟招 人数 初试科目 （代码） 复试专业课考试 科目（代码） 同等学力考生 加试科目 产业经济学（020205） 01产业系统理论 02文化产业组织理论与政策 03区域文化产业发展 04文化产业市场 05文化产业投融资管理 06娱乐产业发展与管理22(3) ①101政治 ②201英、202俄、203日选一 ③303数学三 ④801西方经济学 01、02方向901 经济学综合； 03、04、05方向 902文化产业管理 与经营； 06方向903娱乐 产业管理运营 01、02方向微观经济学、 高等数学； 03、04、05方向管理学、 文化产业学；06方向管 理学、艺术产业运营学 国际关系（030207） 01国际关系理论 02国际关系与大众传播 03国际关系与跨文化交流 04当代国际关系18(3) ①101政治 ②201英、202俄、203日、240 法、241德选一 ③701国际关系历史与理论 ④802综合考试[国际关系] 904当代国际关系世界政治经济与国际关 系； 世界近现代史
研究方向（代码）人数（代码）科目（代码） 加试科目 马克思主义基本原理（030501） 01马克思主义与当代社会思潮 02社会主义市场经济理论 03马克思主义大众化传播10(2) ①101政治 ②201英、202俄、203日选一 ③702马克思主义基本原理 ④803综合考试[马克思主义基 本原理] 01方向905马克 思主义与当代社 会思潮； 02方向906社会 主义市场经济理 论； 03方向907马克 思主义大众化传 播 马克思主义发展史 中国近现代史 思想政治教育（030505） 01新时期思想政治教育理论与实践 02传媒政治 03政治传播与政治社会化20(3) ①101政治 ②201英、202俄、203日选一 ③702马克思主义基本原理 ④803综合考试[马克思主义基 本原理] 01方向908思想 政治教育原理与 方法； 02方向909传媒 政治； 03方向910政治 传播学概论 马克思主义发展史 政治学 文艺学（050101） 01中国古典文论与美学 02文艺学原理与马列文论 03西方文艺理论04审美文化学10(2) ①101政治 ②201英、202俄、203日选一 ③703文艺理论 ④804综合考试[文学] 911文艺美学西方文论史 文艺学基本原理 语言学及应用语言学（050102） 01应用语言学 02对外汉语教学 03语言信息处理22(3) ①101政治 ②01方向为201英、202俄、203 日选一；02方向为201英、202 俄、203日、240法、241德选一 ③704语言学理论 01方向912应用 语言学； 02方向913对外 汉语教学； 03方向914自然 01、03方向汉语知识、 文学知识； 02方向现代汉语、 古代汉语
细胞转染的步骤
【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
第三章 细胞生物学研究方法
一、章（节、目）授课计划第页 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
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二、课时教学内容第页 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大 的作用。没有 显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern 杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： GAGGAGAGGAFFFFAFAF
舆论学原理方法和应用
第一章：舆论传播的源与流 第一节：舆论传播的源头 1.研究对象：变动的整体意识，以及人们的社会行为和社会交往的语言关系所构成的总体模式。 2.研究目的和任务：探讨舆论的各种规律和法则，从而正确地运用这些规律和法则来改造社会。 3.舆论学是研究社会公众的共同意见如何让制约人类生活的一门科学。 第二节：先秦古典舆论思想的二元对立分析 1.民本主义舆论观 源于西周，在春秋时期得到实践和发展，作为一种系统的政治思想由如家学派完成。 理论基础：周公的“以德论天”，儒家的“借天为说”。 2.轻言主义舆论观 以法家学派为代表，商鞅是法家思想体系的奠基者之一。 理论基础：法家学派，韩非“因道全法”-----“以道为常，以法为本”。 第二章：舆论在现代社会公共管理中的角色扮演与功用 第一节：现代舆论的应用基础 一.私人领域的二元伦理 1.个体的“责任伦理” 2.个体的“信念伦理” 二．公共领域的前提与保证 1.公共领域的公民权利保证 2.公共领域的公共权力----国家：国家为市场经济提供法制保障和调节；对公共权力的制衡机制---宪政 第二节：关于舆论在现代公共管理过程中的角色解析 一．关于社会目标的设定 1.社会公共管理决策过程：社会目标---公共管理决策---社会效果 2.马斯洛的“需求层次理论”：生理需求---安全与保障---爱与归属---自我尊重与他人的尊重---自我实现 3.社会目标设定的维度：理性与非理性；合理性与非合理性；社会目标的选择空间：理性--合理，理性---不合理，非理性---合理，非理性---不合理。 二．社会操作过程的实现 1.专业水平，科学意识：决策过程的程序性和阶段性，决策机构的规范化。 2.利益平衡，轻重缓急：政治，社会经济。 三．舆论作用发挥 1.舆论反馈社会效果的目的与作用 2.前提与保证：民意反馈社会效果的首要前提是政治透明；民意反馈社会效果的保证是社会监督制度的建立；民意反馈社会效果的适度性。 3.反馈社会效果的规范方法：定性与定量评价，动态评价与反馈。 第三章：舆论的三要素 第一节：“舆论”之词解与相关定义 1.舆论的定义：舆论是社会或社会群体中对近期发生的、为人们普遍关心的某一争议的社会
软件工程-原理、方法与应用【第三版】重点
第一章绪论 1.软件：是能够完成预定功能和性能的可执行的计算机诚信度。包括使程序正常执行所需的数据，以及有关描述程 序操作和使用的文档。即：软件 = 程序 + 文档 2.软件的特征：软件的开发不同于硬件设计、不同于硬件制造、不同于硬件维修。 3.软件工程方法学：把在软件生命周期全过程中使用的一整套技术方法的集合。三要素：方法、工具、过程 4.软件工程学的畴： 软件开发技术（软件开发方法学、软件工具、软件工程环境）、软件工程管理（软件管理学、软件经济学、度量学）。 5.软件工程：是指导计算机软件开发和维护的工程学科。它采用工程的概念、原理、技术和方法来开发与维护软件， 目的是为了实现按照预期的进度和经费完成软件生产计划，同时提高软件的生产率和可靠性。 6.软件的发展：大体经历了程序、软件、软件产品 3个阶段。 7.工具和方法是软件开发技术的2大支柱。 8.3种编程泛型：过程式编程泛型、面向对象编程泛型、基于构件技术的编程泛型 9.面向对象程序设计中，数据和操作被封装在一个对象中，对象之间则是通过消息相互联系。 10.构件：标准化/规格化的对象类。 11.3种编程泛型的差异: 粒度由小到大依次是：过程式编程式、面向对象编程式、基于构件的编程泛型。 12.软件工程的分化：1、传统软件工程2、面向对象软件工程3、基于构件的软件工程 13.消除软件危机的途径：①正确认识计算机软件；②充分认识到软件开发是一种组织良好、管理严密、各类人员协 同工作的工程项目；推广使用在实践中总结出来的开发软件的成功的技术和方法；③开发和使用更好的软件工具。第二章软件生存周期与软件过程 1.软件生存周期：计划、开发、运行3个时期。 需求分析-》软件分析-》软件设计-》编码测试-》软件测试-》运行维护 2.需求分析（用户视角）：功能需求、性能需求、环境约束、外部接口描述。 3.软件分析（开发人员视角）：建立与需求模型一致的，与实现无关的软件分析模型。 4.软件设计：总体设计/概要设计、详细设计（确定软件的数据结构和操作）。 5.软件测试：单元测试、集成测试、系统测试。 6.软件开发方法可区分：形式化方法、非形式化方法。 7.形式化开发模型：转换模型、净室模型
4细胞生物学研究方法答案
第二章细胞生物学研究方法 一、名词解释 1、resolution：分辨力是指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小距离的能力。能够区分的两点间的距离越小，表示分辨力越高。 2、显微结构：通过光学显微镜所观察到的样品的各种结构，如细胞的大小、外部形态以及细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体等内部构成都属于显微结构。 3、超微结构：也称亚显微结构。指在电子显微镜下所观察到的细胞结构，如细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体、核糖体、微管、微丝等细胞器的微细结构。 4、细胞培养：指活细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞、模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养皿中继续生存、生长和繁殖的方法。 5、原代培养：指从机体组织中取材后接种到培养基中所进行的细胞培养，即直接取材于机体的细胞培养。所形成的细胞称原代细胞，它是在体外培养任何一种体细胞所必须经历的阶段和传代培养的基础。 6、传代培养：指当原代培养的细胞在培养瓶中生长、增殖到一定密度后，一分为二或以其他比例分装或转移到2个以上的培养瓶中所进行的再培养。 7、细胞融合：又称为细胞杂交，指细胞彼此接触时，2个或2个以上的细胞合并成为一个细胞的现象。 8、cell line ：原代培养首次传代成功后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力，能持续生存的细胞系，则称为连续细胞系或无限细胞系。 二、选择题 【A1型题】 1、A； 2、B； 3、B； 4、A； 5、C； 6、D； 7、A； 8、D； 9、C；10、D；11、C；12、A；13、A；14、B； 15、C；16、A；17、E；18、A；19、C；20、D；21、C；22、E；23、A；24、D；25、B；26、E 【A2型题】 1、E； 2、D； 3、C； 4、D； 5、A； 6、B； 7、C； 8、D； 9、D；10、A 【X型题】 1、ACE； 2、CDE； 3、AE； 4、CE； 5、ABCD； 6、ABC； 7、ABCED； 8、ACD； 9、ABCD 三、填空题 1、普通显微镜相差显微镜暗视野显微镜荧光显微镜 2、照明系统光学放大系统机械装置系统 3、电子照明系统电磁透镜成像系统真空系统记录系统电源系统 4、物镜和照明系统的位置颠倒 5、扫描电子显微镜透射电子显微镜 6、0.1μm 0.1mm 3nm 7、差速离心法密度梯度离心法 8、0.2μm R=0.61λ／N.A. N.A.=n·sinα／2 9、细胞化学法荧光细胞化学和免疫荧光镜检术放射自显影技术细胞显微分光光度测定技术流式细胞计量术细胞组分的分级分离法 10、冰冻蚀刻 11、原代培养传代培养 12、单层生长形态变成多态性具有接触抑制现象 13、体外环境不能与体内的条件完全等同 四、判断题 1、√； 2、×； 3、√； 4、×； 5、√； 6、×； 7、√； 8、√； 9、√；10、×；11、√；12、×；13、×；14、×