金属螯合亲和色谱介质的合成及其色谱特性研究
金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究
李淑娟等：金属萱台亲和层析介质用于六聚组氨酸融台蛋白的纯化研究 度测定结果可粗略计算：２００血裂解液纯化后所得 ｃＤｌ５５Ｄ１融合蛋白量约为２００旭。 ２．５ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ－ｓｅｐｈａｒ∞ｅ用于六聚组氨酸融合蛋 白大量纯化的初步研究 根据小量纯化的优化条件，将介质体积放大２５ 倍纯化六聚组氨酸融合蛋白ｃＤｌ５５Ｄｌ，取５０％的 ｃｏ－ｃＭ．Ａ叩一ｓｅｐｈａｒ姻ｅ悬浮液１．５ｍＬ与５ｍＬ含 ｃＤｌ５５Ｄｌ的细胞裂解液孵育，ｃｏ．ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓ８ｐＩｌ哪ｓｅ 悬浮液装入层析柱中，洗柱后用５ｍＬ含２００ｍｍｌ，Ｌ 咪唑的ｃ液洗脱蛋白，收集洗脱液５ｍＬ。用Ｂｍｄ州 法测定蛋白浓度并计算可知蛋白质总量为４．６ｎ蜗。 ２．６Ｃｏ?ＣＭ－Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ辨与Ｎｉ?ＮＴＡ?Ａ辨ｒｏ辨的比较 将ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ—ｓｅｐｈ删ｓｅ与商品化Ｎｉ—Ｎ１俳Ａｇａｒｏｓｅ进行蛋白纯化的比较，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ８ｐ． ｓｅｐｈａｌｏｓｅ悬浮液和５０％的Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ静ｒｏ特悬浮液各６０皿分别与２００ｆｔＬ含六聚组氨酸融合蛋白ｇｐ４ｌ（分子量３６ｋＤ）的细胞裂解液孵育，并按各自清洗溶液对介质清洗后洗脱蛋白，对纯化后的剩余液和洗脱 液进行ｓＤＳ．ＰＡＧＥ，结果如图６所示。从图６中可看出经ｃ０．ＣＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ∞与Ｑｉａｇｅｎ公司的Ｎｉ．Ｎ１ｒＡ．Ａ∞”介质纯化后剩余液中蛋白质的组成几乎一 样，洗脱得到卵４１蛋白的量相当，说明两者蛋白结合容量差别不大。但是，以Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ朗ｆ０８ｅ纯化后的洗脱液电泳结果中可见有少量杂蛋白的条带，而且与ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ．ｓ印ｈａｒ∞ｅ相比，Ｎｉ，ＭｒＡ．Ａｇ啪眈介质纯化后剩余液泳道中杂蛋白减少较多，说明有较多的杂蛋白非特异性结合到Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａｇｍ”介质上，便影响了纯化后所得蛋白的纯度。这与文献中报道含镍螯台介质可与不含六个组氨酸残端的蛋白结合，因而会表现出一定非特异性吸附的结果一致““。而以ｃｏ－ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化的洗脱液电泳条带中不存在杂蛋白，可见ｃｏ—ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｍｓｅ对融合蛋白选择性高，非特异性吸附降低，因而表现出较好的纯化效果。 以羧甲基天冬氨酸为配基制备的ｃ０一ｃＭ．Ａｓｐ． ｓｅｐｈａｒ０∞能牢固地结合金属离子从而有效防止了金 属离子的泄漏，将ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ－ｓｅｐｈｍ蛇用于纯化六 聚组氨酸融合蛋白ｃＤｌ５５Ｄｌ和印４１的结果表明，该介质可大规模纯化蛋白，通用性较好，对蛋白结合选择性高，蛋白结合速度快、与现有商品化Ｎｉ．Ｎ１阻一Ａ辨ｒｏ”相比，具有可简单清洗、洗脱得到的蛋白纯度高等特点。 图６ＳＤｓ－ＰＡＧＥ对Ｃｏ＿ｃＭ．Ａｓｐ－ｓｅｐｌｌａ瑚ｅ和 Ｎｉ．ＭＨ，Ａ异ａｒｏ跎纯化融合蛋白的结果比较 Ｆｉｇ．６ＳＤｓ＿ＰＡＧＥ卸一ｙ出０ｆｐ耐ｅｉ珊出ｅ‘ｐＩｌ曲ｃａｔｉｏⅡ珊ｉＩ．ｇ（ｂＣＭ－ＡｓＰ－ｓｅｐｈｒｏ陀ⅡｎｄＮｉ－ＮＴＡ－＾ｇａ瑚ｅ８ｅｐａｒａｔｅｌｙＩ：ｐ删戚ｎｎｍｋ盯；２，３：ｄｌｌ咖矗咖Ｎｉ?ＮＴＡ?Ａ删；４：蚰畔ｍ出ＪｌＩ聃吨一ｉ—ＭＡ—Ａｇ哪种；５，６：ｄ瑚忙ｈ姗ｃｐｃＭ—Ａ妒ｓｅｐＩｌ一；７： 蚰非蚴啪ｔ商１唱Ｃ乎ＣＭ－Ａ咿ｓｅｐＩｍⅫ∞；８：咖ｄｅｌｙ姐把． ＲＥＦＥＲＥＮ傀ｓ（参考文献Ｊ ［Ｉ］Ｐ０ｒ８山Ｊ，ｃ吐蝴ｎＪ，ｏｌ自咖ｌＩ，“出．Ｍｅｔ丑｜ｃｈｅＩＢｋ幽ｎｉ竹曲砌㈣吖砷ｌＩｙ，?ｆ＊”且ｐ㈣ｈ“ｐ。ａｋ洫丘删ｏｍｄ叩．Ｍ眦ｍ， １９７５，２５８（５５３６）：５９８—５９９． ［２］ＴｉｅＦ（铁锋），王ｔＩｉＧ（茹刚）．ｕＬＹ（李令握），ｄｄＰＬⅡｊｌ；ｃｍｉ帆ｏｆｍＨａｎｍｈ嘶如而幽ｍｅ啪ｄｄｎｅ—■ｎｉ畔ｄ唧幡ｎ幻目‘ａｐｈｙ． ｎ嘴删Ｂ砒ｍ眦哼僦ｄ丑卸蛳ｂ（生物化学与生物物理进 展）．Ｉ∞４．２ｌ（５）：４４７一＂０． ［３］】蛐ｋｎ即ｈＲ，ｄｅＭ州ｙｆ蚶Ｇ，【棚Ｊ．＃一Ｒａｐ讨ａｌＩｄｄ五ｃｉｅ址ＰＩｌ曲ｃ丑Ｉｉ帆０ｆｎａｌｊｖｅＫｍｉ也腓?ｔ８９驴ｄｐｒＤＩｄｎ槐ｐ瞄８ｅｄｈ 嘣ｍＫＩ珊ｔｖ批ｃｉｎｉａ咖．Ｐｍ＾Ⅻ＾∞ｄ蹦啪．１９９Ｉ．疆 ‘２０）：８＂２—８９７６． ［４］ｈ删ｈＪ，０ｂｎＢ．ＩⅡＩ咖ｂｉｌｉｚｅｄｍｅ叫ｉ０ＩＩ椰五可ｄｄ岬ｄ叫盯ｄｉⅡＩｍｏｂｉ血耐ｍ乩ｄｉ蚰胡ｉⅡｉ竹ｃｈｍ呻‘ｑｇ‘ａｐｈｙｏｆＭ叩删嘲柚㈣ 口‰赶“∞缸砂ｉ—¨“～““ｃｋｄｉ慨 日“㈣”，１９８３，２２（７）：１６２ｌ—１６３０ ［５］｝妯ＩｌｌｉＥ，Ｄｃ山出Ｈ，＆ｈ肼ｈ盱＾．ＮｗｍｄｄｃＩｌｅｈｌｅａｄ帅ｒｂｅ呲嗣ｅｃｔｉＹｅｋＰｍｌｅｉ哪叫ｐｅＰｔｉｄｅＢｃ曲“ｎｉ玎ｇｍ咄嘶哗ｋｓｔｉ‰ 嗍；ｄｌ瑙．如岍耐旷ｃｈ阳“哪”ｌ＾ｊ’．●９８７，４１１：１７７一ｌ“． ［６］Ｐ帆ｍＪ．Ｉｍ啪Ⅻｉ∞ｄｍｅ试ｉ帆曲面可ｃｈ耶叶０Ｆ叩ｌ｜ｙ．竹啪ｍ凸ｐ嘲ｈ‘帅ｄＲ懒ｈ，１９９２．３（４）：２６３—２８１． ［７］Ｍ皿咖ｍ姗Ｔ，ＰｃｒＩｍＨ，Ｐ０ｒａ出Ｊ．Ｐ“６ｃ正衄０ｆ ６嫩ＶⅢ：ｃ曲ａｇｕｌ蛆ｔａｃｔｉ咖ｆｒ嘲麒ｌｉｖ盯ｎ舯Ｐ丑珊Ｍｈ严瑚ｃ印ｃＩｌｌｔＬ呻ｎｌｅｄｉ啪 ｂｙｉｍ啪ｈｄｊｚ。ｄｎ埘ｄｉ瑚赫ｒＩ姆ｄｌ刑Ｔ１８唧ｈ．尉曲抽Ｍ蛳 ∞ｄ驯Ｗ口ｈｂ岫，１９９１，１３（１）：３１５—３２２． ［８］ｗ伽ｇＪｗ。Ａｌ嫡加ＲＬ，ｗ８ｎｇⅣ吐．Ｉ皿ｒ－ｏｂ血。ｄ附衄ｌｉ衄蛳ｔｙｃｌＩ删ｏｓ呷ｈｙ（１ＭＡｃ）一ｅｌＩｅ血Ｂｎｙ“Ｋ∞ｅｌＪ蚰６０ｎａ—ｋｍｉ０．１． 两Ｗｈ∞ｄ＾ｒ黜ｈｍｍ．１９９１．∞（Ｉ）：４９—１∞．（９］Ｎｄｓ叽ｌＰｓ，Ｙ甜Ⅵ竹，“ｎｓＲ，ｄ缸．ｕｓ～删，６２４２５８１．２００１?０６．０５． ［１０］Ｐ蛆Ｆ（潘飞）。ｏｉｕＹＬ（邱雁『临）．Ｐｕ曲ｃ撕∞０ｆｒｅｄｕｃｅｄ —ｌｎ越ｈｉｏｒ＊ｂｙ；ｍⅡ?ｏｂｉＨ∞ｅｄｍｅＩｍｉ帅血正哼ｃｈ—“鲫ｂ 删哪ｅ知＂ｎｄ矿朋甜州唧枷（中国医药工业杂志）．２００６， ，７（４）：２３７—２３９．
金属螯合层析介质
金属螯合层析介质（征求意见稿） 编制说明 《金属螯合层析介质》 国家标准起草工作小组 二〇一九年一月
《金属螯合层析介质》国家标准 编制说明 （征求意见稿） 一、任务来源 本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会专项《国家质量基础的共性技术研究与应用》项目《生物产业共性技术标准研究》中课题《海洋生物产品质量控制与检测技术标准研究》，项目编号“2016YFF0202304”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2019年完成。本标准起草工作组由中国科学院过程工程研究所等单位共同组成。 二、目的和意义 金属螯合层析是近40年来出现的一种亲和层析技术，也称固定化金属离子亲和层析。它于1975年首先被Porath和他的合作者们成功用于分离纯化人血清蛋白，并在此后的三十年里迅速发展。该法利用蛋白质表面的某些氨基酸和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而实现蛋白质分离。高流速琼脂糖金属螯合层析介质是将亚氨基二乙酸（IDA）、次氮基三乙酸（NTA）等配基键合在高流速琼脂糖微球上，并螯合金属离子Ni2+（或其它金属离子）而形成的一种亲和层析介质[1]（图1）。该类层析介质具有吸附容量大、选择性好、分辨率高、易于再生以及成本较低等优点，在标签蛋白等生物大分子纯化领域具有极为广泛的应用。 图1 金属螯合层析介质（IDA）结构示意图（X可以是H2O、缓冲液中离子以及蛋白配体等） 目前国内外已有多家企业进行金属螯合层析介质的生产，由于缺乏相应的国家标准，金属螯合层析介质的性能要求没有统一标准，从而对其应用造成很大困
扰，严重阻碍该类介质和层析技术的应用发展水平，对我国生物产业产生不利影响。以金属螯合层析介质的载量测定方法为例，一种方法是将介质装柱并连在层析仪上，平衡后经含有His-乳酸脱氢酶的样品上样，上样结束后，依次经淋洗和洗脱，收集洗脱液，根据洗脱液中蛋白含量计算洗脱载量；另一种方法是用纯His-乳酸脱氢酶上样，依次经平衡和洗脱，收集洗脱液，根据洗脱液蛋白含量计算洗脱载量。这两种方法测定同一介质样品得到的结果具有明显差异。类似问题也出现在其他的参数测定上。因此建立关于金属螯合层析介质的国家标准具有重要意义。在此基础上，通过标准化工作提高介质及相关技术发展水平，促使我国相关产业在国际贸易方面取得话语权，推动我国层析介质及相关产业在国际上占有一席之地。 三、标准制定原则 （一）标准编制原则 金属螯合介质属于生物体系分离材料，重点围绕介质的主要性能要求，设定相应技术内容。在确保产品质量的基础上，充分体现产品的特点。 （二）标准制订主要依据 1、标准编写遵循GB1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的有关要求。 2、标准编写内容参考我国与化学品相关的法规、标准，包括GB/T 601 化学试剂标准滴定溶液的制备、GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备等等。 四、标准主要技术内容 （一）标准适用范围的说明 本标准规定了金属螯合层析介质的质量要求、检测方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存的标准。 本标准适用于骨架为琼脂糖微球的金属螯合层析介质的生产与检测。 （二）内容提要 金属螯合层析介质的主要理化性质包括外观、粒径、流速、配基密度、动态载量、微生物污染和化学稳定性等。
生物医学亲和层析相互作用
生物医学亲和层析相互作用 1概述 亲和层析属于液相色谱,它是以共价偶联了亲和配体的介质为固定相来吸附或研究与其发生相互作用的分子。亲和配体可以是蛋白分子、酶、抗体、抗原,也可以是一段DNA或RNA序列、仿生染料、酶的底物或抑制剂、小分子化合物(如药物或激素)等。很多亲和配体具有很高的选择性,将偶联了配体的介质装在柱子中,可以很好的用于分离、检测或研究复杂样品中的目标分子。亲和层析介质主要由三部分组成:配体、间隔壁、基质。配体是决定亲和层析成功与否的一个重要因素。根据配体的类型,可以将亲和层析进行分类,如凝集素亲和层析、硼酸盐亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合亲和层析等。在设计和使用亲和层析柱时,偶联配体所使用的基质的类型也很重要。以琼脂糖或纤维素等多糖类物质为基质的亲和层析介质常用于样品预处理或者靶分子的分离纯化。这种基质易于修饰和活化,有利于基质和配体的偶联,并且具有较好的物理化学稳定性,非特异性吸附少。但是这种基质的机械性能较差,在使用时柱压不能太高,分辨率和效率相对于高压系统也较低。对于高压液相亲和层析,可以使用二氧化硅颗粒或者整体柱材料为基质。采用这种基质的亲和层析柱可以用于HPLC或与其他分析方法(如质谱)联合运用。 2亲和层析应用的常见方式 首先,要选择合适的样品处理缓冲液以利于目标分子与配体的结合。将处理好的样品上到亲和层析柱上,与配体无相互作用或作用弱的分子从柱子上穿出;然后通过更改流动相的pH或添加竞争剂,使目标分子与配体解离从而被洗脱下来。根据目标分子的性质,可以通过紫外吸收、荧光、质谱等方法对其进行检测。亲和层析的分离过程简单、快速,具有较高的选择性,广泛用于生物医学和药物分析中样品的分离和预处理。另外,除了可以利用亲和层析的吸附作用来富集目标分子外,同样也可以利用亲和层析来去除样品中影响分析的分子。如在蛋白组学的研究中,可以用亲和层析柱先去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白,再研究低丰度蛋白。 3凝集素亲和层析 凝集素是一种非免疫来源的蛋白质,能识别并结合特定类型的糖基,广泛分布于植物、动物和微生物中。凝集素亲和层析以偶联了凝集素的基质为固定相,常用的凝集素有伴刀豆凝集素A(ConA)、麦胚凝集素(WGA)、榴莲凝素等,它
镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书 一、简介 金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 二、性能参数： 特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体 Ni2+ 配体密度20-40μmol /ml 吸附载量15mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速600cm/h pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 三、适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、应用实例 实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白 实验步骤： 1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml； 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min； 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为 1ml/min；
实验十一 金属螯合亲和层析分离蛋白质
实验十一金属螯合亲和层析分离蛋白质 【实验目的】 1．学习亲和层析的原理。 2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。 【实验原理】 亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。 本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv,该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL 2. 2mol/L NaCL 溶液50mL 3. 1mol/L NaOH溶液50mL 4. 0.2mol/L NiSO4溶液50mL 5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL 6. Ni2＋Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL 7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品20—50ml 8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.0 9. 洗脱液：300mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.0 10 20%乙醇溶液50ml 〈二〉器材 1. 1.5cm X 50cm层析柱 2. 蠕动泵 3. 紫外检测仪 4. 自动收集器 5. 伍豪色谱工作站 【操作方法】 1. 样品的制备 细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。然后8000r/min。离心30min，取上清液。放冰箱备用。 2. 亲和层析柱的安装
金属螯合亲和层析技术及其应用
金属螯合亲和层析技术及其应用 摘要:固定化金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术,它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。因此,其在蛋白质纯化、复性和空间定位以及酶的固定化和金属离子清除等方面具有广泛的应用。 关键词:固定化金属螯合亲和层析;纯化;应用 固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一种亲和纯化技术,它是由Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分离纯化出数百种生物大分子。该法是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化。它因配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点而被广泛应用。随着研究的进一步深入,IMAC的新应用也不断地被发现。 1金属螯合亲和层析作用原理 固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合,金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点,在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时,氨基酸残基的供电原子将取代与金属离子结合的水分子或阴离子,与金属离子形成复合物,从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应,由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属配基的亲和力大小不同,从而可选择性地加以分离纯化[2]。 2金属螯合亲和层析技术的应用 2.1金属螯合亲和层析用于生物分离纯化 IMAC在生物分子纯化方面具有很多优点:(1)结合力强,蛋白结合容量大,可用于工业生产,如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附(EBA)技术可从哺乳动物细
镍离子金属鳌合亲和层析介质使用说明
镍离子金属鳌合亲和层析介质使用说明 简介 金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 性能参数 特点基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体Ni2+ 配体密度10-15μmol/ml 吸附载量20-40mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速150cm/h pH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。 应用实例 实验名称：Ni-亲和介质分离带His标签的重组蛋白
实验步骤： 1、Ni-亲和介质装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml； 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min； 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min； 4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min； 5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度； 6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存。 缓冲液组成： 缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH 2 PO 4 19ml，0.5M Na 2 HPO 4 81ml，NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。 缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH 2 PO 4 19ml， 0.5M Na 2 HPO 4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g,加适量，水调pH后定容到1000ml。 缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制： 咪唑浓度缓冲液1量(ml) 缓冲液2量(ml) 10mM 98220mM 96450mM 9010100mM 8020200mM 6040300mM 4060400mM 20 80 SDS-PAGE流程： 1、BCA法测量样品蛋白浓度
亲和层析
亲和层析 亲和层析原理 生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。 亲和层析的应用 点击次数：692 发表于：2008-08-28 21:05转载请注明来自丁香园 来源：互联网 亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。 1.抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。 另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。 2.生物素和亲和素 生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 15M,洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如
纤维素金属螯合亲和膜用于蛋清中功能性蛋白质的分离纯化
第25卷第2期2006年3月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology Vol.25 No.2Mar. 2006 文章编号:167321689(2006)022******* 收稿日期:2005205215; 修回日期:2005212225. 作者简介:张亚辉(19762),女,新疆石河子人,工学硕士. 纤维素金属螯合亲和膜用于蛋清中 功能性蛋白质的分离纯化 张亚辉, 杨严俊 (江南大学食品学院,江苏无锡214036) 摘 要:以纤维素滤纸为载体,通过环氧氯丙烷交联活化、亚氨基二乙酸偶联、金属离子螯合制备 得到亲和膜。应用该膜进行的蛋清蛋白纯化试验结果表明,Cu 2+亲和膜具有较好的吸附性能和纯化效果,只需采用两步洗脱的方式即可得到具有明显纯化效果的蛋清转铁蛋白和溶菌酶。关键词:亲和膜;纤维素;卵转铁蛋白;溶菌酶中图分类号:Q 51文献标识码:A Study on the Purif ication of Functional Proteins from Egg White by Cellulose Metal 2Chelated Aff inity Membrane ZHAN G Ya 2hui , YAN G Yan 2jun (School of Food Science and Technology ,Southern Yangtze University ,Wuxi 214036,China ) Abstract :Affinity membrane was successf ully prepared wit h cellulose analysis filter paper as support ,epichlorohydrin (EPI )as crosslinking and activation agent ,iminodiacetic acid (IDA )as ligand. Then p reparation of Ni 2+、Zn 2+、Cu 2+metal -chelated ligand was carried out , respectively.The experimental result s showed t hat t he absorption and p urification effect of Cu 2+affinity membrane were better t han t ho se of Ni 2+ and Zn 2+affinity membranes. The ovotransferrin and lysozyme were p urified as salience wit h two step elution.The affinity membrane supplied a technique for indust rilized membrane separation in t he f ut ure.K ey w ords :affinity membrane ;cellulose ovot ransferrin (O Tf );lysozyme (L ys ) 固定化金属螯合亲和色谱(IMAC )具有螯合介质制备简单方便、吸附容量大、选择性及通用性较好、易于再生等优点,是由Porat h 于1975年引入[1],其基本原理是在不同条件下配位键的形成和解离。由于蛋白质表面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸这一类电子供体可与过渡金属离子形成配位复合物,因而连接上过渡态金属离子的载体可以选择性地吸附含咪唑基或巯基的肽或蛋白质,而亲和力的大小主要取决于蛋白质分子表面咪唑基、巯基的 稠密程度。此外,不同金属离子对亲合力大小也有 一定的影响。在分别螯合有Cu 2+、Zn 2+、Ni 2+、Fe 2+、Fe 3+的IDA 型亲和柱中,Cu 2+2IDA 对蛋白质 或氨基酸的亲和力最强。基于该原理,若将金属离子固定于层析介质上,则能制成金属螯合亲和吸附剂,可用于纯化蛋白质等生物大分子物质[2-3]。 传统亲和介质多为凝胶,但由于凝胶颗粒易压缩变形,蛋白质在颗粒间扩散传质慢,分离操作只能在低流速下进行,这些缺陷限制了其在实际应用