成像流式细胞仪原理及应用

二代流式技术产品-成像流式细胞分析

邱又彬

Merck&Millipore旗下品牌Amnis于近期推出了新一代高速细胞成像系统ImageStreamX Mark II。这是第三代ImageStream成像流式细胞仪，具有无与伦比的细胞分析能力。

显微镜可提供详细的细胞图像和形态信息，是研究细胞功能的重要工具。然而，显微图像的解释却是主观、定性且费力的。流式细胞仪擅长定量的表型分析，可产生统计学上可靠的结果，不过，流式细胞仪却缺乏成像能力，因此无法了解亚细胞定位。

ImageStream系列开创性地将流式细胞检测与荧光显微成像结合于一体，既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供了细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布的完整信息。

ImageStreamX Mark II能实时捕获每个流动细胞最多12幅高分辨率图像，检测速率可达5000细胞/秒，并具有更强荧光灵敏度。ImageStreamX Mark II的这些功能可以对细胞形态、荧光探针的强度和定位进行检测，进而为科学家提供广泛的图像分析应用，包括细胞间相互作用、吞噬、凋亡和自噬、核易位、形态变化等。

ImageStreamX Mark II的特征如下：

?速度更快：Mark II对进样速度进行了提升，每秒可以分析多达5000个细胞，简单易用的补偿向导可以指导您轻松完成多色补偿运算。

?操作更简单：全新而直观的用户界面提供了每一个细胞的图像及实时绘图相关的图形化控件。

?样品适应性更强：Mark II可选配7个激光；样品容量20-200 μl，增加了实验的灵活性，适用于多用户实验室。

?样品利用率更高：Mark II将样品利用率提高到了95%，更适用于稀有的细胞样品，而且未使用的样品也可回收用于进一步分析。

从2005年开始，Amnis量化成像流式分析仪被广泛应用于各个研究领域。其中超过300篇的文章发表在高水平的同行评议杂志（peer-reviewed journal）上。这些研究领域包括生物化学、药物研发、血液、免疫、微生物、海洋、肿瘤、寄生虫、干细胞、毒理、病毒等等。并且由于Amnis与众不同的实验理念和卓越性能，使得这个名单不断变长。

1.生物化学：

经典的生物化学技术主要用于分子定位和共定位检测，这非常适合使用Amnis量化成像流式分析系统，比如转录因子从细胞质到细胞核的转位、分子在亚细胞器间的运输、蛋白质在细胞内和细胞间的共定位。它可以获取复杂样品每个细胞中探针定位和共定位的统计学结果，这对于传统生物化学研

究是极大的补充和拓展。

示例1：T细胞-抗原递呈细胞中NF-κB的转运：

NF-κB在与抗原递呈细胞（APC）和特异性多肽连接的转基因T细胞中从细胞质转位到细胞核的转位。在此使用Similarity参数是指两幅图像间像素信号的相似性，即Similarity值越高代表NF-κB（绿色）和7-AAD染核（红色）信号相似度越高。

示例2：抗体-药物耦联复合物与内涵体和溶酶体的共定位：

荧光特异性标记的抗体-药物耦联复合物（ADC）通过细胞内吞作用进入细胞后与内涵体和溶酶体的共定位。此处endosome/lysosome colocalization的衡量是通Bright Detail Similarity参数实现的，它代表的是两幅图像中荧光亮点的位置。

示例3：ImageStream系统中利用FRET（荧光能量共振转移）检测蛋白质间的相互作用：

FRET（荧光能量共振转移）：在荧光显微镜下可以看到，荧光团可以在吸收一个波长的光之后发射出波长较长的光；当第二个荧光团离第一个荧光团足够近的时候，它就可以从第一荧光团获取能量，发射出波长更长的光。

FRET对于荧光团之间的距离很敏感，如果发生了FRET，说明荧光团之间

的距离大约是在10 nm。当用两个荧光团分别标记蛋白时，可以通过供体和受体荧光团间的FRET来推断蛋白质间的距离。ImageStream可以定量分析稀有细胞亚群中的FRET，来衡量细胞内蛋白相互作用和细胞间连接。区别胞内发生和未发生FRET蛋白的位置可以改进我们对于信号转导通路的理解。

下图所示，受体1和受体2分别用PE（供体）和AF647（受体）标记。

收集细胞图片用488 nm激光激发。受刺激的样品中可以检测到AF647荧光团，说明发生了FRET现象。

2.药物研发：

药物研发的目标是找到高质量的、可以改善治疗效果的候选药物。利用相关信息分析可以很快的减少候选药物的数量，选出那些既不影响效果又不会引起不可预见的致命后果的候选药物，这会节省药品公司为了淘汰某些候选药物进行临床实验而花费的时间和金钱。Amnis的量化成像流式分析系统的一些应用非常适合鉴定药物的性质，包括细胞信号转导、细胞间相互作用、化学因子诱导的细胞形变、细胞死亡、共定位和吞噬。而且，这些应用非常适于全血白细胞这样的异源、原代细胞。

示例1：抗体-药物耦联复合物与内涵体和溶酶体的共定位：

荧光特异性标记的抗体-药物耦联复合物（ADC）通过细胞内吞作用进入细胞后与内涵体和溶酶体的共定位。此处endosome/lysosome colocalization的衡量是通Bright Detail Similarity参数实现的，它代表的是两幅图像中荧光亮点的位置。

示例2：条码：

筛选候选药物需要对大量样品进行快速分析。ImageStream可以将时程、剂量因素结合起来放在1管中进行实验，这大大提高了系统的通量。这个过程是这样实现的，每个样品会基于特定的时间点和处理方式被染上特定强度的荧光染料，就像给它们打上了条形码。系统会根据荧光颜色及其强度自动确定细胞群体，反推出标记样品。下图展示的例子是，在不同的时间点添加不同剂量的TNF-α对胞内NF-κB从细胞质向细胞核发生转位程度的测量。在ImageStream系统中，可以用AlexaFluor 405、488和660和四种不同的浓度做排列组合来标记64个样品在一个管中完成测量。在10到15分钟内接收600000张图片，为了进一步定量分析图片，可以根据样品颜色和强度的排列组合进行反推。电子表格中是Similarity打分的平均值，这种结果可以以heatmap的形式呈现。

注：AlexaFluor 405、488和660染THP-1细胞会产生四种荧光密度形式——negative、dim、med、bright，三种染料就会有64种染料-荧光密度组合。其作用原理是，本身没有荧光，其ester group使其进入细胞，如果是活细胞的话，酯酶（esterase）使其ester group裂解，使AF成为荧光形式succinimidyl ester group形式并与细胞内蛋白胺基共价连接；死细胞不会发光。细胞分裂时平均分配到两个子代细胞内。与蛋白连接的共价键非常牢固，即使经过固定、打孔仍可以保持在细胞内。

3.血液学：

血液学家通常会使用显微镜和流式细胞术两种方式来对血细胞、造血系统和血系统寄生虫进行研究和分类。Amnis独有的对大量悬浮细胞进行图像定量分析能力使得其特别适合血液学领域。这方面应用包括，将免疫表型和形态学结合起来对红细胞生成不同阶段进行划分，鉴定镰刀血细胞或者寄生虫感染的血红细胞，定量分析吞噬、共定位、化学因子诱导的形变、血细胞特异性亚群中的细胞信号转导。

示例：红系细胞分化：

造血干细胞向红系细胞分化过程中，在向红细胞分化时中会发生收缩、进而脱核的现象。同时，血型糖蛋白A的表达逐渐增加，而CD71逐渐降低。

这个实验向我们展示的是ImageStream在将强度、形态和定位结合起来将细胞进行分类的独特能力。下图所示的是细胞核脱出的过程，利用Delta centroid XY 来衡量细胞核DRAQ5染色和血型糖蛋白A之间的位置关系。Delta centroid XY是指两个图像选区中心点间的距离。

4.免疫学：

先天和获得性免疫系统中的细胞保证人体免受病原体的攻击。免疫系统中不同类型的细胞的区别不仅是细胞表面标志物的差别，还有对于不同病原体或是刺激的反应。将定量图像分析工具和流式细胞术的大样本量结合起来，ImageStream可以独特的将多种应用使用在免疫学领域，包括转录因子的细胞核转位、T细胞和抗原递呈细胞的相互作用和免疫突触上的蛋白质聚集、化学因子诱导的形变和吞噬。

示例1：NF-κB在与抗原递呈细胞结合的T细胞中的转位：

NF-κB在与抗原递呈细胞（APC）和特异性多肽连接的转基因T细胞中从细胞质转位到细胞核的转位。在此使用Similarity参数是指两幅图像间像素信号的相似性，即Similarity值越高代表NF-κB（绿色）和7-AAD染核（红色）信号相似度越高。

示例2：鼠巨噬细胞的吞噬作用：

免疫表型鉴定鼠巨噬细胞系RAW（橙色）对酵母聚糖的内化作用。37度条件下，分别在加入酵母聚糖15、30、60分钟时检测发生内化作用细胞的百分比。内化作用的衡量参数是Internalization，是指细胞内某物质荧光与代表整个细胞荧光的比值。

示例3：HIV引起的特异性的NFAT转位：

来源于HIV阳性病人的外周血中HIV激活T细胞核中NFAT的入核现象。在HIV四聚体阳性细胞（橙色）中，HIV鞘蛋白gag特异性刺激NFAT （绿色）转移到细胞核（红色）中。Similarity参数是指两幅图像间像素信号的相似性，分值与DRAQ5核染色和NFAT信号的重叠性相关。Similarity参数打分越高，样品中发生转位的细胞越多。

5.微生物学：

微生物因其致病性对于人类健康和疾病预防十分重要。Amnis量化成像流式分析系统由于其具有图像参数，所以可以基于形态学对细菌进行分类，并且可以检测它们的复制过程。致病菌有一套跨越机体免疫系统的方法，其中包括对吞噬细胞内化作用的抑制。微生物与宿主细胞的相互作用是一个复杂的生物学过程，可以用Amnis量化成像流式分析系统研究这个过程，包括自身免疫系统对病原体的内吞和清除、胞内细菌的维持和扩增以及细菌感染对于宿主细胞信号通路和存活的影响。

示例：有害细菌鉴定和成丝化分析：

从培养或是残余食物当中获得的细菌可以定量的分析其大小、形态和特异性FISH探针的荧光强度。成丝化无论是复制缺陷造成的，还是对宿主免疫系统的反应，都可以测量。衡量细菌成丝程度使用的是尺寸参数——Length，测量的是选区（细胞）长度。第二幅图是用特异性FISH探针检测变质食物中的沙门氏菌。

6.海洋学：

海水的成分和物种对于研究海洋环境中复杂的相互作用是非常关键的。

浮游生物种类和数量是渔业生产、水质监测和保持物种多样性的重要指标。

因为这些海洋生物是漂浮的，具有复杂的形态，Amnis量化成像流式分析系统对于鉴定硅藻的数量、测量海藻细胞分裂和研究以浮游生物为食生物的分布十分理想。

示例：分析码头缆绳上微生物的形态和体积：

定量分析培养基或者海水中特殊的硅藻和其他浮游生物的体积、形态、

荧光强度、结构以及荧光探针或者叶绿体的定位和共定位。形态学参数Aspect Ratio测量图像选区（细胞）中短轴与长轴的长度比值，尺寸参数Area测量图像选区（细胞）面积。

7.肿瘤学：

肿瘤学的研究主要涉及癌症的发展过程和治疗方法。肿瘤学家不仅使用显微镜对癌细胞进行鉴定和分类，还要鉴定化学药物引起的凋亡细胞中细胞核的片段化，或是追踪治疗性单克隆抗体的结合和内化过程。Amnis量化成像流式分析系统可以将免疫表型和量化的形态学参数结合起来，将其应用于潜在转移细胞总的稀有亚细胞群的鉴定，比如循环肿瘤细胞（CTC）。

示例1：抗体药物耦联复合物与内涵体或溶酶体的共定位：

荧光特异性标记的抗体-药物耦联复合物（ADC）通过细胞内吞作用进入细胞后与内涵体和溶酶体的共定位。此处endosome/lysosome colocalization的衡量是通Bright Detail Similarity参数实现的，它代表的是两幅图像中荧光亮点的位置。

示例2：凋亡系数：

DNA固缩和片段化是细胞凋亡一个显著的标志。通过测量细胞核图像中最亮部分的面积和强度，凋亡细胞有亮点的细胞核图像可以和正常、健康细胞核染色图像区别开。这使得自动鉴定细胞凋亡成为可能。结构分析参数Bright Detail Intensity测量的是所选区域内某像素范围内的颗粒数。

8.寄生虫学：

寄生虫是人类健康的大敌，它可以引起疾病甚至死亡，比如疟疾、非洲嗜睡病、黑热病和莱姆病。人类对于寄生虫如何感染机体和宿主免疫系统以及如何清除外来入侵的理解对于开发有效治疗方法至关重要。Amnis量化成像流式分析不仅可以检测被感染细胞，还可以确定细胞内寄生的寄生虫的数量以及它们对亚细胞信号通路的影响。

示例：椎体虫：

椎体虫可以引起非洲嗜睡病。下图所示是定量研究GFP标记分子入核现象的两个例子。直方图显示的是每个细胞的GFP图像和DRAQ5染核图像的一致性，用similarity这个参数来打分表示。Similarity参数是指两幅图像间像素信号的相似性。Similarity打分高说明GFP图像和DRAQ5染核图像高度相似（GFP转移到细胞核内）。低的Similarity打分说明没有发生核转位。

9.干细胞：

在体内，干细胞具有分化成各种细胞的能力。阐明这个过程可以促使我们更好的理解动物发育的过程和制定出更好的替代受损组织的治疗方案。由于干细胞在向终末分化细胞分化过程中通常会涉及到明显的细胞形变，所以Amnis量化成像流式分析系统十分适于这方面的研究。测量维持干细胞多潜能性蛋白的细胞定位或是衡量干细胞分化过程中的信号转导事件，Amnis量化成像流式分析系统可以分析大样本量细胞的特点简化了稀有干细胞的鉴定和分类。

示例：红系细胞分化：

造血干细胞向红系细胞分化过程中，在向红细胞分化时中会发生收缩、进而脱核的现象。同时，血型糖蛋白A的表达逐渐增加，而CD71逐渐降低。

这个实验向我们展示的是ImageStream在将强度、形态和定位结合起来将细胞进行分类的独特能力。下图所示的是细胞核脱出的过程，利用Delta centroid XY 来衡量细胞核DRAQ5染色和血型糖蛋白A之间的位置关系。Delta centroid XY是指两个图像选区中心点间的距离。

10.毒理学：

环境中的健康风险和药物剂量评估是毒理学研究的核心问题。微核分析常用于评价候选化合物或药物的基因毒性，这种毒性会诱导染色体片段化，使得在细胞分裂过程中无法分配到子代细胞中。传统上，统计这种微核的数量要使用显微镜手动进行。Amnis量化成像流式分析系统将高速细胞成像和图像定量分析结合起来，可以大大推动这个研究领域，使得快速、自动化鉴定细胞内微核成为可能。

示例：微核检测：

微核分析是评价药物和其他化学试剂基因毒性的最好方法。从下面这个实验可以看出，ImageStream仅仅使用明场和细胞核染色的图像就可以快速对细胞群中凋亡、双核和微核事件进行分类。传统上，细胞生物学家不得不在手动荧光显微镜（耗时）和流式细胞术（快速分析大量细胞，但无法对胞内细胞核成像）之间进行选择。Amnis量化成像流式分析系统将精准的数字成像和分析能力结合起来，解决了这个问题。形态学参数Aspect Ratio测量图像选区（细胞）中短轴与长轴的长度比值，尺寸参数Area测量图像选区（细胞）面积。

11.病毒学：

病毒可以引起人的各种传染病，包括普通感冒、水痘、艾滋病和SARS 等。研究病毒和宿主细胞的相互作用和在其中的复制以及病毒如何入侵和参与免疫系统，是开发抗病毒治疗方案的核心问题。使用Amnis量化成像流式分析系统基于图像的多种参数可以鉴定病毒感染细胞、衡量感染在凋亡、细胞形变和细胞死亡方面的影响。

示例1：浆样树突细胞中CpGB与内涵体和溶酶体的共定位：

ImageStream鉴定CpGB与浆样树突细胞结合、被其内化和与细胞内溶酶体共定位。与免疫表型结合起来，浆样树突细胞（橙色）中溶酶体的空间分辨与强度（绿色）与CpGB（红色）一致。内化作用的衡量参数是Internalization，是指细胞内某物质荧光与代表整个细胞荧光的比值；

colocalization的衡量是通Bright Detail Similarity参数实现的，它代表的是两幅图像中荧光亮点的位置。这组数据提示了ImageStream的强大功能：

1)将免疫表型和图像一致性以及内化分析结合起来，可以在特定范围内测量

分子的共定位和内化。

2)可以测量体积小、细胞质组分小的原代细胞中的事件。

示例2：HIV引起的特异性的NFAT转位：

来源于HIV阳性病人的外周血中HIV激活的T细胞的细胞核中NFAT 的入核现象。在HIV四聚体阳性细胞（橙色）中，HIV鞘蛋白gag特异性刺激NFAT（绿色）转移到细胞核（红色）中。Similarity参数打分与DRAQ5核染色和NFAT信号的重叠性相关。Similarity参数是指两幅图像间像素信号的相似性。Similarity参数打分越高，样品中发生转位的细胞越多。