锰对植物毒害及植物耐锰机理研究进展

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (4): 506–520, https://www.360docs.net/doc/c610341613.html, doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.04.014

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收稿日期: 2009-07-06; 接受日期: 2009-10-20

基金项目: 国家转基因生物新品种培育重大专项(No.2009ZX08009-130B)和中国矿业大学(北京)2009年大学生创新性实验计划项目(No.091209Z)

* 通讯作者。E-mail: tychai@https://www.360docs.net/doc/c610341613.html,

锰对植物毒害及植物耐锰机理研究进展

张玉秀1, 李林峰1, 柴团耀2*, 林单1, 张红梅1

1

中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院生物工程系, 北京 100083; 2

中国科学院研究生院生命科学院, 北京 100049

摘要 含锰矿渣的排放造成了严重的土壤锰污染。揭示锰毒害和植物的耐锰机制对于污染土壤治理具有重要意义。研究表

明, 高浓度的Mn 2+能够抑制根系Ca 2+、Fe 2+和Mg 2+

等元素的吸收及活性, 引起氧化性胁迫导致氧化损伤, 使叶绿素和

Rubisco 含量下降、叶绿体超微结构破坏和光合速率降低。而锰超累积植物则具有多种解毒或耐性机制, 如区域化、有机酸螯合、外排作用、抗氧化作用和离子交互作用等。根系主要通过有机酸的螯合作用促进植物对Mn 2+的转运解毒, 同时能够将过量的Mn 2+区域化在根细胞壁中; 叶片可通过酚类物质或有机酸螯合Mn 2+, 并将其区域化在叶片表皮细胞和叶肉细胞的

液泡中(或通过表皮毛将Mn 2+排出体外)。其中, 金属转运蛋白在植物对Mn 2+

的吸收、转运、累积和解毒过程中发挥着重要

作用。

关键词 锰毒, 金属转运蛋白, 耐性

张玉秀, 李林峰, 柴团耀, 林单, 张红梅 (2010). 锰对植物毒害及植物耐锰机理研究进展. 植物学报 45, 506–520.

重金属锰是地壳的组成元素之一, 它通过风化作用从原生矿物中不断地释放出来, 与O 2、CO 32–和SiO 2结合形成MnO 2、Mn 3O 4、MnCO 3和MnSiO 3等次生矿物质。土壤中对植物有效的锰可以分为3类, 即水溶性锰、交换态锰和易还原态锰, 前2类锰均以Mn 2+形式存在, 而后者是高价锰氧化物中易被还原成植物有效Mn 2+的部分。锰是植物生长必需的微量元素, Marschner(1995)曾报道植物最佳生长发育要求体内锰含量至少应为30 mg·kg –1 DW 。锰参与植物光合电子传递链的氧化还原过程及PSII 系统中水的光解, 且对维持叶绿体的正常结构具有重要作用。此外, 锰也是植物体内一个重要的氧化还原剂, 通过氧化还原调节细胞中Fe 2+浓度以及细胞中抗坏血酸和谷胱甘肽的氧化还原状态(Shenker et al., 2004)。锰还是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和硝酸还原酶等酶的辅助因子, 对其具有活化作用。然而, 由于锰矿的开采和大量尾矿渣的排放, 导致土壤中可溶性的锰含量过高。例如, 湖南省湘潭锰矿区土壤中锰含量约为湖南省平均值(459 mg·kg –1

)的330倍(张慧智等, 2004); 土壤中过量的锰不仅对植物造成伤

害、降低植物生产力、影响产量和品质, 同时, 还能够通过食物链影响人类身体健康, 如人体锰摄入量过高能够引起类帕金森氏综合症, 影响肝脏、心血管系统和免疫系统的正常功能, 并对生殖系统产生不良影响等。

目前, 重金属锰污染已成为锰矿区主要的环境问题, 如何有效地清除土壤中的锰已成为许多科学家共同面临的难题。植物修复技术(phytoremediation)以其潜在的高效、廉价及环境友好性受到了社会各界人士的高度重视, 植物修复技术的主体是重金属超累积植物(张玉秀和柴团耀, 2006)。近年来, 国内外在锰对植物毒害和植物对锰的累积/耐性机理研究方面取得了很大进展, 为植物修复锰污染土壤奠定了基础, 本文就这些方面的研究进展进行综述。

1 锰的毒害作用

锰毒能够引起植物叶片萎蔫坏死、叶片厚度减小、节间缩短和生物量降低, 且毒害症状因植物物种、基因型、Mn 2+处理浓度以及生长条件不同而异。用512和2 048 μmol·L –1的MnSO 4·H 2O(pH 5.0)处理澳洲绢毛

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张玉秀等:锰对植物毒害及植物耐锰机理研究进展 507

相思(Acacia holosericea)幼苗70天后, 幼叶表现出萎黄病症状, 叶状柄出现坏死斑点; 同时, 在2 048 μmol·L–1锰离子浓度处理下, 75%的幼苗死亡, 存活幼苗生长十分缓慢。白千层(Melaleuca leucadendra)幼苗在128和512 μmol·L–1锰离子浓度处理下, 除新叶外所有叶片表面均出现褐色斑点, 且沿其纹理部分斑点尤其明显, 植株生长也很缓慢; 当Mn2+浓度提高到2 048 μmol·L–1时, 幼苗节间缩短, 植株矮小, 叶片扭曲变形, 并在叶柄至叶片边缘部分出现红色斑点(Reichman et al., 2004)。商陆(Phytolacca ameri-cana)是锰超累积植物, 当用浓度小于5 000 μmol·L–1 MnCl2处理商陆幼苗45天时, 幼苗生长基本正常, 在MnCl2浓度为500和2 000 μmol·L–1时, 幼苗地上部干重与对照相比差异不大(薛生国等, 2003); 但是, 当Mn2+浓度提高到8 000–12 000 μmol·L–1时, 植株老叶在处理28天后便开始出现枯斑, 并逐渐变大, 根、茎、叶干重急剧下降, 在12 000 μmol·L–1 MnCl2处理下, 幼苗地上部和根干重较对照分别减少了81.9%和88.5%; 当Mn2+浓度继续提高到15 000 μmol·L–1时, 处理17天叶片即出现明显坏死斑, 并逐渐枯萎死亡。实验结果表明过量的锰可导致叶片坏死, 生物量降低, 并最终死亡, 只是由于不同物种或同一物种不同生态型对锰毒的耐性不同, 其锰毒症状出现的时间和处理浓度不同而已。Mora等(2009)报道了4种智利黑麦草(Lolium perenne)幼苗地上部与地下部干重在锰胁迫下出现不同程度的下降, 其中, 耐性品种Jumbo 和Kingston在150 μmol·L–1 MnCl2(pH4.8)处理15天后, 地上部干重仅减少了16%, 地下部干重减少了22%, 而敏感品种Aries和Nui地上部干重则分别减少了67%和57%, 地下部干重分别减少了62%和40%; 与对照相比, 耐性品种Jumbo和Kingston根长变化不明显, 而敏感品种Aries和Nui的根长几乎降低了50%, 表明不同遗传背景的同一物种对锰毒害响应不同。另外, 白菜(Brassica campestris)在低浓度Mn2+(5 mg·L–1)处理时, 茎和叶生物量降低幅度(13.64%和10.46%)明显大于根系生物量降低幅度(5.00%), 随着Mn2+浓度 (15.0–30.0 mg·L–1)进一步增加, 根系生物量降低幅度与茎和叶相近(曾琦等, 2004), 说明过量的锰首先使地上部出现锰毒害症状, 生长受到抑制, 随着锰毒害程度的加剧, 根系也明显受到伤害, 生长进一步受到抑制。锰毒可导致玉米(Zea mays)叶片厚度减小, 在锰胁迫下, 锰敏感型品种Kneja 605的叶片厚度(由185.41 μm减至92.92 μm)、上表皮层厚度(由24.75 μm减至16.65 μm)和下表皮层厚度(由18.63 μm减至15.45 μm)均显著减少, 而锰耐性品种Kneja 434的叶片、上表皮以及下表皮层厚度不仅没有减小, 反而略有增加。叶片的透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)解剖结构分析进一步表明, 在500 μmol·L–1MnSO4胁迫下, 玉米锰敏感品种Kneja 605的表皮层细胞由正常的饱满圆球状变成扁平状, 导致叶肉细胞层的细胞间隙狭小, 叶片厚度较对照明显减小(Doncheva et al., 2009)。叶片表皮作为防御屏障对植物体起着保护作用, 表皮层厚度的减小必然导致叶肉细胞更容易受到外界伤害, 并最终引起植株地上部生物量的减少。

过量的Mn2+能够抑制Fe2+和Mg2+等元素的吸收及活性, 并可导致叶绿体结构破坏、叶绿素合成下降和光合速率降低(图1)。镁和铁是叶绿素的重要组分, 在叶绿素的合成及光合电子传递过程中发挥着重要作用。同时, 由于Mn2+半径介于Ca2+与Mg2+之间且与Fe2+相近, 故可能与Mg2+、Ca2+和Fe2+在植物根部具有相同的结合位点。另外, Mn2+的结合能力较强(Pittman, 2005), 过量的锰能够抑制必需元素镁、钙和铁的吸收, 导致叶绿素合成减少, 光合作用效率下降; 过量锰还会催化生理活性的Fe2+氧化形成Fe3+, 从而影响组织中Fe2+的功能。曾琦等(2004)报道随着营养液中Mn2+浓度(0.5–30 mg·L–1)的不断增加, 白菜根、茎和叶中的锰含量显著升高, 而茎和上部叶片中的钙和铁含量及茎、叶的生物量显著降低, 证实过量的锰可以抑制钙和铁的吸收, 影响植物的生长。Ferroni等(2004)用10 mmol·L–1MnSO4 (pH 3.3)处理眼虫藻(Euglena gracilis)24–72小时后, 发现其细胞中的叶绿素b含量明显增加, 叶绿素a/b的摩尔比率明显降低; 透射电子显微镜观察结果显示, 80%–90%的叶绿体在进行分裂, 但均失去了叶绿体典型的“雪茄”形状, 而变成折叠的丝带状, 同时, 在叶绿体基质中没有成型的类囊体结构, 而只有一些疏松的无规则的类囊体膜, 表明过量锰能够导致叶绿体的正常结构被破坏及叶绿素合成减少。Doncheva等(2009)报道随着MnSO4处理浓度(50–500 μmol·L–1)的升高, 玉米耐锰品种Kneja 434与锰敏感品种Kneja 605幼苗叶片的叶绿素a和b含量均下降, 锰敏感品种的总

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图1锰对植物毒害及植物耐锰机制示意图

左边为毒害机制A:叶绿体结构破坏, 由正常椭球状变成丝带状或球状: B:锰毒造成与CO2固定及NH4+吸收和重吸收的相关酶(如Rubisco、RA、RBP和GOGAT)含量及活性降低; C:锰毒扰乱细胞ROS产生和清除的稳态平衡, 导致ROS大量产生, 进而引起氧化胁迫; D: Mn2+半径介于Ca2+和Mg2+半径之间, 与Fe2+接近。过量锰影响根细胞对钙、镁和铁元素的吸收。

右边为解毒机制E:叶片中的锰优先积累在叶片表皮和表皮毛中, 而且可以通过表皮毛将Mn2+分泌(或外排)到植物体外; F:细胞水平上, 锰或锰与有机酸形成的螯合物主要积累在细胞液泡及细胞壁中; G:植物体中的抗氧化系统清除锰诱导产生的过量ROS; H:根系表面形成氧化物薄膜限制根系对锰的过量吸收; I: 根细胞中锰的主要积累部位是根细胞的细胞壁; J:植物根系通过外排作用将体内过量的锰排出体外; K: 根系通过分泌有机酸的螯合作用, 一方面可以螯合根际土壤中的Mn2+降低其毒性, 另一方面促进Mn2+的吸收和转运; L: 金属转运蛋白在植物对Mn2+的吸收、转运和向地上部累积中的功能。

Figure 1 Mechanisms of manganese toxicity and tolerance in plants

Mechanisms of manganese toxicity(left) A: Damage of chloroplast structure, the organelles lost their typical shape and were often ribbon-folded or round in shape; B: The reduction of protein content and activity involved in CO2 fixation and NH4+ assimilation, such as Rubisco, RA, RBP and GOGAT; C: Mn toxicity disrupts the cellular homeostasis, enhances the production of ROS and leads to oxidative stress; D: The ionic radius of Mn2+is between that of Ca2+and Mg2+, and close to that of Fe2+, thus, Mn inhibits the uptake and activity of Fe, Mg and Ca.

Mechanisms of manganese tolerance(right) E: Mn are preferentially accumulated in leaf epidermal cells and trichomes in leaves, and the trichomes may constitute a morphological differentiation for the secretion of Mn-chelating molecules into the growth medium; F: Mn and Mn-chelate complexs are predominantly sequestered in vacuoles and cell walls; G: Antioxidant defense system plays an important role in scavenging of reactive oxygen species; H: Avoidance of uptake by the formation of oxide film; I: Mn predominantly combine with cell walls in root cells; J: Roots can secrete Mn into the rhizosphere soil; K: Chelation of organic acids can decrease Mn availability in the rhizosphere soil, thus, enhancing Mn tolerance in plants and, promote translocation of Mn; L: Metal transporters play important roles in the Mn translocation and uploading.

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类胡萝卜素含量随着Mn2+浓度的升高而明显增加, 而耐锰品种中总类胡萝卜素含量则随着Mn2+浓度的升高而减少; 耐锰品种的叶绿素荧光参数F v/F m和电子传递效率ΦPSII均没有明显变化, 而锰敏感品种在500 μmol·L–1的Mn2+处理下, 其F v/F m和ΦPSII值分别减少了12%和40%; 透射电子显微镜观察结果显示, 锰胁迫下玉米叶绿体由长条形状变成圆球状, 一些类囊体膜表面出现小泡, 而且这种超微结构的变化在锰敏感型玉米中表现得更为明显, 表明过量锰能够引起叶绿体结构变化, 导致叶绿素荧光参数和电子传递效率降低, 进而影响光合作用。另外, 鉴于锰对耐性不同品种的叶绿体结构破坏和叶绿素合成的抑制程度不同, 它们光合作用效率降低的程度也不同。

过量的锰能够引起氧化胁迫, 并导致C、N同化相关的酶和蛋白质含量降低(图1)。Mn2+在叶绿体中可被光激活的叶绿素氧化为Mn3+, 氧化还原电位提高, 致使O2··–、H2O2和·OH等活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基大量累积, 叶绿素进一步受到破坏, 叶绿体功能不能够正常发挥。同时, ROS可启动膜脂过氧化作用, 导致膜脂过氧化产物丙二醛(malondialchehyche, MDA)的大量累积, MDA具有很强的交联性能, 可以使蛋白质和核酸等生物大分子发生交联, 进而使蛋白质分子和酶功能丧失, 膜结构被破坏。Feng等(2009)用600 μmol·L–1的MnSO4(pH 6.5)处理黄瓜(Cucumis sativus)幼苗16天, 发现叶片中的H2O2和硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substance, TBARS)含量显著增加(均约为对照含量的3倍), 叶绿素荧光参数F v/F m和ΦPSII值显著降低, 净光合速率和气孔导度均下降近50%, 说明过量锰可以引起膜脂过氧化程度上升, 膜系统受到伤害, 导致光合作用效率下降。我们的研究表明, 用1 mmol·L–1的MnCl2分别处理商陆和烟草(Nicotiana tabacum)4天后, 与对照相比, MDA的含量分别增加了17.4%和347.3%, 光合速率分别下降了13.3%和75.5%, 烟草的相对电导率显著升高(120.1%), 而商陆没有明显变化, 表明锰对烟草引起了严重的氧化损伤, 而对锰累积植物商陆的损伤则相对较小(张玉秀等, 2009)。烟草幼苗用1 mmol·L–1的Mn2+处理9天时, 叶中Mn2+浓度从70 mg·g–1DW增加到5 000 mg·g–1DW, 光合作用降低60%, 多酚氧化酶活性随着叶片中锰累积浓度的增加而增强, 表明光合作用的降低和多酚氧化酶活性的增强是幼苗锰过量累积的标志。锰处理烟草幼苗3–4天后叶片开始出现锰毒症状, 其光合作用速率的降低先于锰毒症状的出现。进一步研究表明, 烟草叶片细胞间的CO2浓度、叶绿素和蛋白质含量在锰毒害症状出现之前均未发生变化, 在锰毒害症状出现之后才显著降低, 所以, 锰毒发生早期光合作用速率的降低现象可能是由于锰毒导致体内核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)的羧化活性降低所致(Robert et al., 1988)。大麦(Hordeum vulgare)在18.3 μmol·L–1(1倍浓度)的MnCl2处理下正常生长, 当用10倍浓度的Mn2+处理5天, 幼苗仍能正常生长, 当将Mn2+浓度提高到100倍时, 叶片开始出现坏死斑, 但是叶绿素的含量并没有降低, 表明胁迫初期并没有影响叶绿素的合成。Rubisco的催化活性需要金属离子, 且对结合位点特异金属催化的氧化反应高度敏感。Demirevska-Kepova等(2004)利用免疫印迹法(immunoblotting)对大麦的研究结果表明, 用 1 830 μmol·L–1的MnCl2处理大麦5天后, Rubisco大亚基、核酮糖二磷酸羧化酶活化酶(Rubisco activase, RA)、核酮糖二磷酸羧化酶结合蛋白(Rubisco binding pro-tein, RBP)和谷氨酰胺合酶(glutamate synthase, GOGAT)等的含量均明显降低。叶绿体RA和RBP参与Rubisco的活化和装配过程, 而GS(glutamine synthetase)/GOGAT参与植物光呼吸过程中NH4+的同化和再利用, 这些酶和蛋白含量的降低会直接影响叶绿体中CO2的固定与N素的同化, 因此, 锰胁迫初期引起的光合作用下降可能是由于CO2和NH4+同化代谢相关酶和蛋白含量降低所致。

2植物耐锰的生理机制

尽管锰毒害能够抑制植物的生长和发育, 但一些锰耐性植物却能够在高浓度的Mn2+污染土壤中生存, 完成生命周期, 并且在地上部累积高浓度的锰, 表明植物在长期的进化过程中亦相应的产生了抵抗锰毒害的防卫机制。重金属离子在重金属累积植物中的累积过程可能包括4步。 (1)土壤中的重金属离子跨膜运输进入根细胞; (2)降低根细胞液泡中金属贮存量; (3)增强金属离子由木质部薄壁细胞向木质部的上载, 并运输到地上部的枝和叶; (4)木质部中金属离子跨膜运输至叶片, 并贮存在液泡和细胞壁中。根是锰的吸收器

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官, 快速地吸收和向茎中高速率的输出是茎和叶累积锰的前提, 而根细胞高效的解毒机制是其发育及吸收、运输的基础; 茎的木质部是锰由根向叶片长距离运输的主要通道, 韧皮部也部分参与了金属离子的运输和解毒作用; 叶是锰的累积部位, 涉及复杂的金属解毒和累积。所以, 在重金属累积植物中, 根、茎和叶不同器官的耐性机制不尽相同(图1), 只有根、茎和叶的协同作用才能够形成植物的重金属超累积特性。目前的研究认为, 植物的锰耐性/累积机制包括区域化作用、有机酸的螯合、限制吸收和外排作用、抗氧化作用以及离子的交互作用等。

2.1 区域化作用

植物能够将有毒的金属离子转运和贮存在特定的组织器官或细胞的特定区域, 有效地降低代谢活性区域的金属离子浓度, 这是植物提高重金属耐性/累积能力的重要机制之一。锰耐性/累积植物能够将锰区域化在地上部的特化组织中, 如表皮毛或叶片的表皮层、叶肉细胞的液泡和细胞壁中, 将其与代谢活性区域(如细胞质、线粒体和叶绿体)隔离, 从而维持正常生理代谢的顺利进行(图1)。商陆、水蓼(Polygonum hydropiper)和角菱(Trapa natans)等锰累积植物可以将锰主要累积在地上部的茎、叶中, 而重金属非累积植物则将锰主要累积在根部。商陆吸收的锰有87%–95%分布在地上部, 表明根系吸收的锰有很强的向地上部运输的能力。Xu等(2006)利用同步辐射X-射线荧光光谱(synchrotron radiation X-ray fluores-cence, SRXRF)微探针分析了锰在商陆根、茎和叶中的分布, 结果表明用2 mmol·L–1的MnCl2处理商陆28天后, 锰在根、茎和叶的维管组织中含量最高; 同一叶片中, 叶边缘的锰含量约为叶中脉含量的3倍; 叶片的横切面分析显示, 表皮层细胞的锰含量明显高于叶肉细胞, 并且在表皮层细胞中上表皮层的锰含量高于下表皮层, 在叶肉细胞中栅栏组织中的锰含量高于海绵组织, 说明商陆的叶片是其锰累积的主要器官, 而叶片的边缘和表皮层是其锰累积和解毒的主要组织; 同时, 根、茎和叶的维管组织中存在高浓度的锰, 有利于其长距离运输和向叶片不同组织中分配。

叶片能够累积高浓度的锰, 那么, 锰在亚细胞中的定位如何？早在1988年, Clarkson就通过动力学分析和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)发现液泡是细胞贮存锰的主要细胞器。在过量锰(200 μmol·L–1)存在的情况下, 菜豆(Phaseolus vulgaris)叶片液泡中锰含量约占叶片总锰含量的80%; Bringezu等(1999)报道耐重金属植物Silene vulgaris ssp. humilis能够将多种金属离子累积在叶片表皮细胞壁上。徐向华等(2008)利用化学分析和差速离心技术分析了MnCl2处理28天的商陆叶片细胞内锰的分配, 发现随着锰离子(500–5 000 μmol·L–1)处理浓度的升高, 叶片各亚细胞组分中的锰含量相应增加, 并且细胞质可溶性(含液泡)部分的锰含量增加最大, 其次是细胞壁, 细胞器中锰含量最少。例如, 用5 000 μmol·L–1的锰处理商陆, 其细胞质可溶部分(含液泡)的锰含量占叶片总锰含量的81.9%, 细胞壁占14.7%, 细胞器部分仅占3.4%, 由于成熟细胞内大部分(95%)都是液泡, 推测叶片中大部分锰均累积在液泡中, 表明液泡锰的区域化作用是商陆锰耐性/累积的主要机制之一。水蓼经MnSO4处理30天也得到类似的结果, 随着锰处理浓度(500–5 000 μmol·L–1)的增加, 根、茎和叶中累积的总锰含量不断升高, 细胞质、细胞壁和细胞器中结合的锰含量也随之增加; 然而, 不同器官细胞中锰累积量的变化不同: 随着锰处理浓度的增加, 根细胞质可溶性部分锰含量不断减少, 细胞壁结合的锰含量及茎细胞质中的锰分配率逐渐增加; 细胞壁和细胞器中锰分配率降低; 叶片亚细胞组分中锰含量虽然均有所增加, 但是细胞质(含液泡)中分配的锰绝对增量最大。例如, 在高浓度(5 000 μmol·L–1)Mn- SO4处理下, 根中锰主要累积在细胞壁(61.22%)中, 其次是细胞质(34.58%), 细胞器中最少(4.21%); 茎中细胞质的锰含量(58.6%)最高, 其次是细胞壁(37.1%), 细胞器中最少(4.3%); 而在叶片中, 锰在液泡中累积量(65.64%)最高, 细胞壁(36.34%)次之, 细胞器累积量(5.48%)最少。上述结果表明, 在高浓度的锰胁迫下, 锰超累积植物水蓼的根主要通过细胞壁结合方式解毒, 避免锰在原生质体中累积导致细胞中毒和影响根系向地上部的快速运输功能; 叶片是重金属累积的主要器官, 液泡中累积大量的锰可以避免其它细胞器遭受毒害; 茎主要通过蒸腾作用使根中吸收的重金属由木质部导管向上运输, 所以其细胞质中锰含量最高, 有利于锰向叶片中的运输和累积(王华等, 2008)。

锰以何种形式累积在叶片的液泡中？Baldiss-

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erotto等(2007)研究了角菱幼苗在1 mmol·L–1MnSO4处理下叶片中锰的存在状态, 透射电子显微镜分析结果表明, 处理7天后叶片液泡中存在小的黑色沉淀物, 30天后叶片的表皮、第1层栅栏组织和海绵组织异细胞的液泡中沉积了大量的黑色沉淀物; 叶片横切面的Folin-Ciocalteu组织化学反应显示, 黑色沉淀物是酚类螯合物, X-射线微量分析进一步证实沉淀物均为锰与酚类形成的螯合物, 表明角菱能够通过区域化作用将过量锰以酚类螯合物的形式累积在叶肉和表皮细胞的液泡中, 推测这可能是其锰耐性的主要机制之一。商陆和水蓼叶片细胞质(液泡)中的锰均以可溶性有机酸盐的形式存在, 表明酚类化合物和有机酸在液泡中的锰累积过程中发挥重要作用。另外, 植物体对锰的吸收、转运和累积过程也与金属转运蛋白的作用有关(下文详述)。

2.2 有机酸螯合作用

植物响应环境胁迫最直接和最明显的反应, 往往是根系分泌的有机化合物在组成与含量上的变化, 这些有机物不仅能够活化土壤中的重金属, 而且能够与重金属形成较为稳定的金属螯合物, 其作用一方面可降低重金属的毒性, 另一方面可促进植物对重金属的吸收和转运。同时, 形成的重金属螯合物被累积在叶片的不同组织、细胞和细胞器中, 提高了植物的重金属累积能力(图1)。植物体内与锰解毒机制相关的有机酸主要有4种: 柠檬酸、草酸、苹果酸和琥珀酸(Horst et al., 1999)。Mora等(2009)研究发现, 用10–150 μmol·L–1的MnCl2(pH4.8)处理黑麦草15天, 根系中的有机酸含量上升, 其中草酸和柠檬酸的分泌速率分别从1增至8 μmol·g–1·h–1及从1 增至5 μmol·g–1·h–1, 且分泌速率是苹果酸和琥珀酸的10倍; 同时, 耐锰品种(Kingston和Jumbo)根系中的草酸和柠檬酸水平显著高于锰敏感品种。柠檬酸和草酸与二价和三价的金属离子有很强的亲和力, 容易形成较为稳定的螯合物, 从而降低重金属的胁迫强度(Hoffland et al., 2004), 因此, 通过根系分泌大量的有机酸(尤其是草酸和柠檬酸)螯合Mn2+, 可能是耐锰黑麦草品种的耐性机制之一。有机酸在叶片锰的累积过程中也发挥着重要作用。Bidwell等(2002)研究发现, 耐锰植物Austromyrtus bidwillii(桃金娘科)叶片中含有大量的有机酸, 如草酸、琥珀酸和苹果酸等, 且有机酸的浓度是Mn2+浓度的3倍摩尔当量, 这些足量的有机酸能够与植物体内游离的Mn2+结合, 抑制并降低其毒性。徐向华等(2008)报道了随着MnCl2(500–5 000 μmol·L–1)处理浓度的增加, 商陆叶片中水提取态的锰含量(83%–91%)增加, HCl提取态的锰(14%–8%)含量降低, 表明水提取态锰是叶片中锰的主要存在形式, 其次是HCl提取态锰。与对照(9.1 μmol·L–1)相比, 随着锰处理浓度(500–5 000 μmol·L–1)的增加, 水蓼根中水溶态锰含量大幅度下降(63.6%–29.8%), HCl提取态和NaCl提取态锰增加; 茎中水溶态锰含量增加(34.55%–50.26%); 叶片中水溶态和HCl提取态锰含量分别由38.6%上升至44.2%及20.66%上升至28.74%, 表明根中水溶性锰有机酸盐形式不是主要的解毒方式, 而茎中存在的水溶性有机酸盐形式更有利于锰的解毒和向上运输; 在叶片中锰则主要以水溶性有机酸盐形式存在, 其次是草酸盐形式, 这样更有利于锰的解毒和累积。这些结果与锰主要累积在水蓼根细胞壁、茎和叶细胞质(液泡)中的结果一致, 进一步说明锰累积植物的叶片主要通过形成可溶性锰有机酸盐累积在液泡中的方式解毒。另外, HCl提取的主要是草酸盐, 水蓼叶片中草酸锰占总锰含量的20.66%–28.74%, 商陆中草酸含量达500 μmol·g–1DW 以上, 为干重的9%–11%, 且在不同浓度锰离子处理下草酸锰含量无明显变化, 说明高含量的草酸累积可能是商陆和水蓼本身共同具有的特性, 同时也说明草酸是锰累积植物叶片解毒的主要有机酸。进一步化学提取和色谱分析表明, 锰的草酸盐形式是商陆叶片中锰的主要形态, 因此, 锰与草酸螯合可能是锰超累积植物叶片锰累积和解毒的主要机制之一。

2.3 限制吸收与外排作用

植物可以将Mn2+氧化成非有效态, 从而限制对过量Mn2+的吸收和转运。在渍水条件下, 水稻(Oryza sativa)根际能够将Mn2+氧化成非有效性的四价锰化合物, 限制根系对Mn2+的吸收(Engler and Patrick, 1975)。同时, 根际的氧化作用可使淹水土壤中大量的Fe2+和Mn2+被氧化, 其氧化物沉积在根表面和根质外体中, 形成明显可见的红色铁和锰氧化物膜, 且膜厚度随着铁和锰含量的增加而增加, 从而进一步限制植物对Fe2+和Mn2+的过量吸收(Conlin and Crowder, 1989)。此外, 根际微生物在土壤锰的氧化

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还原过程中也起着重要作用, 其自身的生长依赖于Mn2+氧化反应释放的自由能。例如, 用锰处理大豆(Glycine max), 接种菌根的大豆植株锰毒症状明显减轻, 推测可能是由于过量的锰刺激了氧化菌的活性, 抑制了还原菌的活性, 从而限制了植物对锰的吸收, 增强了锰耐性(Heenan and Campbell, 1981)。

锰在植物体内的累积量随着锰处理浓度的提高而增加, 一旦其累积量达到上限, 有些植物则能够通过外排作用将吸收的锰排出体外, 进而降低锰毒害。Lytle等(1996)通过X射线吸收光谱(x ray absorption spectrum, XAS)分析, 发现锰在篦齿眼子菜(Potamogeton pectinatus)中首先以[Mn2+ (H2O)6]的形式贮存在叶片组织中, 当植株无法累积更多锰时, Mn2+则被氧化成Mn3+, 并通过衰老机制排出体外。Valérie等(2006)利用放射性同位素示踪技术研究白羽扇豆(Lupinus albus)对镍、锌和锰3种元素的吸收及转运特性, 结果表明, 63Ni、65Zn 和54Mn均先通过木质部运输到地上部, 其中63Ni和65Zn可以再通过韧皮部从老叶运输到幼叶中, 而54Mn则只能够在老叶中累积, 即不具有移动性。此外, 放射性同位素检测还发现, 在白羽扇豆根际土壤(围绕根系1–2 mm区域)中含有较高浓度的54Mn, 表明白羽扇豆根系能够通过某种外排机制将锰排出体外。用1 mmol·L–1 MnSO4溶液处理角菱10天, 其地上部锰浓度达到21 603 μg·g–1DW时不再增加, 营养液中仍然保持了较高的Mn2+浓度水平(仅下降了35%), 但溶液底泥中的Mn2+浓度出现逐渐升高现象, 表明角菱并不是将所有吸收的锰都累积在体内, 而是部分外排体外。X-射线微量分析、透射电子显微镜和Folin-Ciocalteu分析结果表明, 角菱叶片下表皮的表皮毛根部存在大量的黑色固体物质(锰-酚类螯合物)。定量分析表明, 其酚类物质的浓度是对照的5倍。由于锰-酚类螯合物与培养液和底泥中高浓度的锰相关, 推测表皮毛可能是角菱为了分泌锰螯合分子而在形态学上分化出的特化组织, 而表皮毛分泌锰-酚类螯合物则可能是角菱细胞避免受锰毒害的一种耐性机制(Baldisserotto et al., 2007)。

2.4 抗氧化系统

正常条件下, 植物细胞内产生的ROS量非常少而且受到植物体控制, 而逆境(包括重金属)胁迫则会破坏细胞内氧化还原反应的平衡状态, 大大增强ROS的产生。如Mn2+在叶绿体中可被氧化为Mn3+, 因此, 过量的锰必然会导致氧化还原电位提高, 致使O2·ˉ、H2O2和·OH等活性氧大量累积, 造成氧化胁迫。H2O2不仅可以从产生部位扩散一定距离, 并且能够穿透膜结构, 相对其它ROS分子而言是一个长命分子。植物体内抗氧化防卫系统能够清除ROS, 保护细胞免受氧化胁迫的伤害, 这也是植物耐受重金属胁迫的主要机理之一(图1)。ROS的清除主要由超氧化物歧化酶、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catal- ase, CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate per-oxidase, APX)、谷胱甘肽还原酶(glutathione re-ductase, GR)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)等抗氧化酶系统以及非蛋白巯基(nonprotein thiols, NP-SH)物质、抗坏血酸(ascorb- ate, ASC)等多种抗氧化物质协调完成。抗氧化酶是蛋白质, 其活性既受胁迫诱导, 又对氧化损伤敏感。SOD是一种金属酶, 可将胞质、线粒体和叶绿体中的O2·–歧化为H2O2和O2,防止O2·–对细胞的破坏; CAT(主要位于过氧化体中)和APX(主要位于线粒体和叶绿体中)可将H2O2分解为H2O和O2, 清除体内累积的H2O2; POD(主要位于液泡、细胞质和细胞壁中)则主要清除植物体内的过氧化物, 包括H2O2。此外, GPX和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transfer- ase, GSTs)在维持细胞氧化还原平衡方面起着重要作用。谷胱甘肽在植物体内PCs的合成和抗氧化胁迫方面均起着重要作用。正常条件下, 植物组织中ASC 和谷胱甘肽的含量为毫摩尔量级, 胁迫下呈现增加趋势, 其中ASC是主要的一级抗氧化物质, 通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环可以直接与ROS重复作用, 同时, 也可以作为二级抗氧化物质, 还原氧化型的维生素E 并防止膜损伤(Mishra et al., 2006)。

用600 μmol·L–1Mn2+处理锰敏感黄瓜幼苗16天后, 叶片中SOD、GPX、APX和GR活性均增加(Feng et al., 2009); 油菜幼苗随着锰毒害程度的增加, 叶片中CAT活性显著降低, POD活性显著升高(曾琦等, 2004), 表明抗氧化酶系统在锰解毒方面起着重要作用。大麦在(183和1 830 μmol·L–1)锰胁迫下, 其叶片中H2O2的累积量显著增加, 酶活性定量测定和同功酶电泳分析发现, CAT和GPX活性显著升高, APX活性下降, 但ASC总含量明显增加, 表明CAT和GPX可

张玉秀等:锰对植物毒害及植物耐锰机理研究进展 513

能是清除H2O2的主要的抗氧化酶(Demirevska- Kepova et al., 2004)。ASC除了可以作为主要的抗氧化物质外, 还是一些植物(大麦)草酸合成的主要前体来源(Smirnoff, 2000), 草酸螯合锰已经被证实是锰累积植物重要的解毒机制之一, 因此大麦叶片ASC 含量在锰处理后上升可能是大麦对锰的应激反应。虽然大麦不是耐锰植物, 但在锰胁迫条件下其体内的抗氧化系统能够通过调节酶活性和抗氧化物质的含量响应锰胁迫, 表明抗氧化系统是植物体响应逆境胁迫中普遍存在的一种适应机制, 对提高植物的抗逆性有重要作用。Mora等(2009)报道随着Mn2+处理浓度的升高, 黑麦草叶片中APX和GPX活性增加, 且耐性品种较敏感品种增加幅度更大; SOD活性在耐性品种中上升, 而在敏感品种中下降, 表明抗氧化酶活性升高可提高黑麦草对锰的耐性。本课题组的研究表明, 随着Mn2+处理浓度的提高和时间的延长, 商陆和烟草叶片中SOD和POD的活性迅速增加, 其中锰累积植物商陆SOD活性的增加幅度大于烟草; 且商陆CAT活性持续上升, 烟草CAT活性显著下降, 表明抗氧化酶活性显著升高(特别是CAT)是锰累积植物的锰耐性机制之一(张玉秀等, 2009)。值得一提的是, GPX虽然在清除植物体的H2O2方面起着重要作用, 但是, GPX活性的增加也容易导致锰毒性症状加重, 这是由于GPX能够催化诱导多酚类物质的形成(Takahama and Oniki, 1992), 而多酚类物质与植物叶表面坏死斑的形成密切相关, 因此多酚类物质的增加容易导致坏死斑的出现。进一步的实验表明, 在上述锰处理黄瓜幼苗的实验中加入硅后, 坏死斑症状显著减轻, 可能是由于硅-锰离子交互作用, 叶片GPX活性明显降低所致。

2.5 离子交互作用

近年来国内外对于土壤-植物系统中元素的交互作用也有一些报道。对于锰的研究则主要集中表现在锰与其它元素(如硅和铝)的拮抗或协同作用上, 并试图探讨通过这些作用矫正锰毒, 进而达到改良土壤的目的。Peng等(2008)研究发现用10或50 μmol·L–1 Cd2+处理美洲商陆22天, 其叶片出现明显的萎黄病症且根、茎和叶的生物量显著降低。然而, 在相同Cd2+浓度处理条件下, 若再添加1 000、2 000或5 000 μmol·L–1的Mn2+, 商陆根、茎和叶的生物量则随着Mn2+浓度的升高显著上升, 如用50 μmol·L–1Cd2+单独处理, 商陆单株的根、茎和叶的生物量分别为76.0、17.1和102 g; 用50 μmol·L–1 Cd2+和5 000 μmol·L–1 Mn2+联合处理, 商陆单株的根、茎和叶的生物量分别高达112、29.2和216 g, 且镉毒症状完全消失。进一步实验证明, 随着Mn2+浓度的增加, 商陆所有器官中的镉浓度水平均减少, 表明锰能够抑制商陆对镉的吸收, 从而减轻镉毒对美洲商陆生长的抑制作用。有关镍-锰2种重金属离子的交互作用也有报道。Broad- hurst等(2009)研究发现在土壤正常锰浓度条件下, 镍超累积植物庭荠(Alyssum corsicum)的表皮毛能够积累高水平的镍和锰; 盆栽实验发现土壤中镍的含量能够影响植物对锰的吸收, 如土壤中仅添加40 mmol·kg–1锰, 再加镍时, A. corsicum叶片中锰积累量仅为306 mg·kg–1, 当同时添加40 mmol·kg–1锰和镍时, 其叶片锰积累量达到924 mg·kg–1。Yang等(2009)报道用400 μmol·L–1MnCl2处理大豆7天时, 其叶片出现褐斑, 幼叶褶皱变形, 幼苗较对照生长矮小; 而用200 μmol·L–1 AlCl3和400 μmol·L–1 MnCl2联合处理相同时间, 大豆的锰毒症状显著改善。原子吸收光谱(atomic absorption spectrum, AAS)结果显示, 随着MnCl2浓度(100–400 μmol·L–1)的升高, 大豆根、茎和叶中的锰含量均显著增加, 而铝-锰共同处理后根、茎和叶中的锰含量增加幅度明显下降, 表明Al3+可以抑制大豆根系对Mn2+的吸收。抑制机制可能有2种: 一是由于细胞壁和细胞膜表面的负电荷对三价Al3+的吸引和结合能力强于二价Mn2+, 因此Al3+可以竞争根部Mn2+的结合位点, 从而影响大豆对Mn2+的吸收; 二是Al3+可能在一定程度上破坏了根细胞的生理功能, 从而影响了根系对Mn2+的吸收。

硅元素在地壳层中的含量位居第2, 它不但不具有毒性, 而且是植物体生长的有益元素, 具有促进植物生长和提高植物抗逆性的作用, 因此研究硅-锰离子交互作用具有重要的应用价值。lwasaki等(2002)研究发现, 用50 μmol·L–1 MnSO4处理锰敏感植物豇豆(Vigna unguiculata)7天后, 豇豆叶片出现了典型的锰毒症状(如老叶的深棕色斑点、幼叶变形), 而用1.44 mmol·L–1K2SiO3和50 μmol·L–1MnSO4共同处理相同时间, 植株生长基本正常, 成熟叶片未出现萎蔫坏死症状且幼叶生长良好, 锰毒症状得到明显改善, 表明硅-锰离子交互作用能够增强锰敏感植物豇豆的

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锰耐性。Feng等(2009)报道硅-锰离子交互作用可使锰敏感黄瓜幼苗叶片明显变绿, 萎黄症状基本消失, 并且叶绿素荧光参数F v/F m和ФPSII值维持在较高水平, 净光合速率明显提高; 同时, 叶绿体中抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的APX、DHAR (dehydroa-scorbate reductase)和GR活性均大大增强, ROS含量降低, 表明硅与锰交互作用能够提高抗氧化酶的活性, 有效地清除体内过量的ROS, 减轻锰毒伤害。推测硅能够增强幼苗对铁的吸收, 减少对锰的过量吸收, 或将锰分布到其它部位以降低锰毒。

3植物吸收和运输锰的分子机理

近年来, 利用T-DNA插入突变和酵母菌功能互补实验在植物中鉴定了多种转运蛋白基因, 这些转运蛋白包括ZIP(zinc-regulated transporter/iron-regulated transporter (ZRT/IRT1)-related protein transport-ers)、NRAMP(natural resistance-associated macro- phage protein)、YSL(yellow stripe-like)、CAX (cation exchanger)、CDF(cation diffusion facilitator trans-porter)和P IIA-ATPases等蛋白家族, 主要运输铁、锌、铜和钙等离子, 也部分参与锰的跨膜运输(杨中宝等, 2007)。进一步分析表明, 转运蛋白在细胞水平上参与锰向细胞内的转运和向不同细胞器(叶绿体和线粒体等)的释放, 以及活性离子在内膜区域(液泡、高尔基体和内质网等)的屏蔽作用; 而在整个植株水平上参与植物对锰的吸收、长距离运输和在地上部的累积过程。

3.1锰的吸收和向地上部转运

根系对Mn2+的吸收和向地上部的快速转运涉及多种转运蛋白。根细胞膜铁还原酶(Fe(III)-chelate re-ductase, FRO)能够还原土壤中的Fe3+, 提高Fe2+的生物有效性; 在缺铁条件下, FRO活性升高, 不仅能够还原Fe3+, 还能够还原Mn3+, 过量的铁抑制植物对锰的累积, 表明铁转运蛋白能够运输锰(Pittman, 2005)。ZIP家族转运蛋白具有广泛的底物结合专一性, 拟南芥(Arabidopsis thaliana)Fe2+转运蛋白AtIRT1 (iron regulated transporter)除能够转运铁外, 还能够转运其它金属离子, 如Cd2+、Zn2+和Mn2+; 基因敲除突变体irt1的缺铁表型在补充外源铁后消失, 而Mn2+却没有恢复其表型的作用, 表明AtIRT1是植物根系获得Fe2+的主要途径。另外, 在缺铁条件下, irt1突变体根中锰离子浓度远低于野生型, 说明IRT1是植物Mn2+吸收途径中主要的转运蛋白(Vert et al., 2002)。其它植物的多个ZIP成员也具有转运锰的能力, 如苜蓿(Medicago truncatula)的MtZIP4和MtZIP7(López-Millán et al., 2004)、番茄(Lycope- rsicon esculentum)的LeIRT1和LeIRT2 (Eckhardt et al., 2001)等。根吸收动力学研究表明, 锰进入根系的Km值介于4–400 μmol·L–1之间; 对表达AtIRT1的酵母菌锰吸收动力学研究表明, 锰吸收速率依赖于外源锰离子浓度, 并可以达到饱和值, Km为9 μmol·L–1, 与整个植物测定的Km值一致, 表明转运蛋白对锰离子的亲和力较低。Nramp家族在根中也具有转运Mn2+的能力, 拟南芥的AtNramp和番茄的LeNramp是定位在根维管束细胞液泡膜上的铁转运蛋白, 其表达受铁缺乏上调。研究表明AtNramp1、AtNramp3、AtNramp4、LeNramp1和LeNramp3能够互补SMF1 (Nramp)基因缺失的酵母突变体smf (Bereczky et al., 2003), 说明Nramp具有锰运输作用。最近的研究表明, 重金属锌/镉累积植物遏蓝菜(Thlaspi caerules- cens)的TcNramp3和TcNramp4定位在液泡膜上, 可转运Fe2+、Mn2+和Cd2+(Oomen et al., 2009), AtNramp3能够运输Mn2+、Zn2+和Cd2+, 大豆铁转运蛋白GmDMT1除转运Fe2+外, 还转运Mn2+、Zn2+和Cu2+, 说明Nramp具有广谱的金属底物专一性。在铁缺乏时, 拟南芥AtNramp3基因敲除突变体的锰含量提高, 而过量表达植株的锰含量降低, 表明该基因的作用是调控液泡向细胞质中释放Mn2+(Thomine et al., 2003)。YSL是定位在细胞膜上的Fe2+转运蛋白, 主要参与玉米、水稻和拟南芥等植物铁复合物由根向地上部的长距离运输过程(Roberts et al., 2004)。NA (nicotianamine)是金属螯合剂, 主要螯合Fe2+, 也能够螯合Mn2+, 金属-NA复合物是YSL转运的潜在底物。有研究表明S, 一些YSL能够转运Mn2+复合物; 水稻OsYSL2主要在缺铁的叶片中强烈表达, GFP定位分析表明, 其定位于细胞膜上, 卵母细胞表达系统分析表明, OsYSL2能够转运等量的Fe2+-NA和Mn2+-NA; 缺铁时, OsYSL2启动子能够在维管束的韧皮部细胞和发育的种子中特异表达, 表明OsYSL2能够跨膜运输和吸收锰-NA复合物, 并将其分配到韧

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皮部进行长距离运输(其中包括金属向籽粒中的转运)(Koike et al., 2004)。拟南芥AtYSL1–3与玉米ZmYS1序列相似, 在根和叶片中的表达受锰、铜和锌缺乏上调, 铁缺乏下调, AtYSL2可向细胞中转运铁-和铜-NA复合物(DiDonato et al., 2004), 且AtYSL3能够恢复酵母锰敏感突变体smf1的生长(Wintz et al., 2003), 表明AtYSL能够转运锰-NA复合物。GUS报告基因表达显示, AtYSL1–3主要在根、叶片和花等器官及维管束组织中表达, 衰老叶片中表达水平最高。ysl1ysl3双突变体表现缺铁症状, 叶片中铁离子浓度降低, 锰、锌和铜离子浓度升高, 而种子中铁、锌和铜离子浓度降低, 且花粉育性和胚发育能力降低, 表明AtYSL1和AtYSL3参与老叶中微量元素的重复利用过程。推测AtYSL1–3的作用可能是把微营养输入和输出维管组织(Waters et al., 2006), 参与多种元素的长距离转运和胚的发育过程(Le Jean et al., 2005)。

3.2 细胞内锰的转运与解毒

重金属在内膜系统的区域化是植物累积/耐受重金属的关键途径。细胞可能主要通过以下2种方式降低细胞质中的Mn2+浓度和对其它细胞器的毒害作用。(1)液泡对Mn2+的屏蔽(封存); (2)内质网和高尔基体的外泌, 这2种方式均必须有金属转运蛋白的参与。液泡CAX转运蛋白主要参与Mn2+向液泡运输的过程, 而MTP(metal tolerance protein)参与Mn2+向液泡和高尔基体两者的运输, ECA(endoplasmic reticulum- localized Ca2+-ATPase)主要参与Mn2+向内质网和高尔基体的运输过程。

液泡是一个动态细胞器, 占细胞总体积的90%, 是许多有毒化合物的存贮器。拟南芥基因组中共有6个液泡膜CAX反向转运蛋白(cation/proton anti-porter)基因。酵母菌功能互补实验表明, CAX1 (Ca2+/H+)向液泡转运Ca2+的能力比CAX2强, CAX1在维持Ca2+稳态中发挥作用, 而CAX2(Mn2+/H+)则参与Mn2+的运输(Shigaki et al., 2003); CAX3和CAX4转运Ca2+的能力很弱, CAX3主要参与盐胁迫响应(Zhao et al., 2008), CAX4主要转运重金属Cd2+和Zn2+。CAX2在酵母和烟草中的表达能够介导二者的锰耐性, 表明CAX2也能够转运Mn2+。抑制酵母锰响应的超敏感实验表明, 在100 000多个重组体中, CAX2是被鉴定的唯一能够抑制锰毒表型的基因(Schaaf et al., 2002), 锰耐性是由CAX2转运Mn2+所致。CAX2的T-DNA敲除突变体的液泡中锰含量低于野生型, 而Ca2+的运输并没有受到影响(Pittman et al., 2004); CAX2启动子启动GUS报告基因的研究表明, CAX2在整株的维管组织中强烈表达, 特别是在韧皮部, 说明CAX2主要调节维管系统中锰的上载和下载。水稻的CAX2同源物被证实也能够转运锰(Kamiya and Maeshima, 2004), 且在燕麦(Avena sativa)液泡膜中具有Mn2+/H+反向转运活性, 说明许多植物的CAX2能够介导液泡屏蔽(或扣押)锰毒害作用。拟南芥CAX2对锰的亲和力低, 转CAX2基因烟草在锰胁迫下耐性提高, 推测只有在细胞质中的锰离子浓度过高时, CAX2才发挥向液泡中转运锰的作用。转拟南芥CAX2和CAX4基因的烟草能够耐受镉、锌和锰。镉胁迫下, 转基因植物根中液泡膜的CAX反向转运活性高于对照, 推测带有CAX的液泡膜可以在某种程度上补偿低的液泡膜质子泵活性和质子泄漏, 导致液泡有效地封存镉, 从而提高植物对重金属的耐受性(Korenkov et al., 2007)。

MTP属于CDF家族中的锰组转运蛋白(Montanini et al., 2007), 也能够将锰转运到液泡中, 如耐锰的热带豆科植物加勒比柱花草(Stylosanthes hamata)ShMTP1–4能够赋予酵母高锰耐性, ShMTP8(ShMTP1)在酵母和拟南芥中表达可单一提高锰的耐受性; ShMTP8-GUS融合表达实验表明, 该蛋白位于烟草和拟南芥的液泡膜上, 推测ShMTP8可作为H+/Mn2+反向转运蛋白向液泡中输入锰从而提高植物的锰耐性(Delhaize et al., 2003)。拟南芥和杨树的MTP也能够提高植物的锰耐性。拟南芥有12种MTP, AtMTP8–AtMTP11与ShMTP8相似, 形成一个亚族, 其中AtMTP11是表达量最高的一个成员。拟南芥和杨树MTP11在酵母菌pmr1突变体中的表达可以赋予其锰耐性, 表明MTP11也是通过H+反向转运机制来提高锰耐性的。拟南芥缺失突变体mtp11只对锰敏感, 对铜或锌不敏感; 在非锰毒条件下, 尽管mtp11突变体累积的锰高于野生型, 但生长并没有受到影响, 然而, 当锰含量达到毒性水平时, mtp11突变体地上部累积的锰与野生型相似, 却表现出了锰毒症状。AtMTP11-GFP融合蛋白表达显示, AtMTP11定位于液泡前体区(prevacuolar compartments), 表明AtMTP11具有专一的锰转运活性; 同时, 锰在液泡

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前体区的转运可能与拟南芥的锰耐性及其稳态有关(Delhaize et al., 2007)。另外, AtMTP11启动子与GUS融合表达表明, 其主要在根尖、茎边缘和排水器中表达, 不在与锰累积有关的表皮细胞和表皮毛中表达; 然而, MTP11-EYFP融合表达表明, MTP11不在细胞膜和液泡膜中表达, 而在动态的内膜区域――高尔基体反面表达, 表明高尔基体累积的锰可能通过膜泡运输和胞吐作用介导植物的锰耐性。根据mtp11突变体的表型及MTP11的分布和在细胞中的定位, 推测高尔基体介导的外排作用构成了植物保守的锰耐性机制(Peiter et al., 2007)。ECA属于P IIA-ATPase, 能够转运锰。拟南芥有4种ECA。ECA1定位在内质网上, T-DNA插入突变体eca1细胞的内质网钙泵活性降低4倍, 但是其在正常条件下的表型与野生型没有区别, 只是在锰胁迫下才表现出严重的锰毒症状, 过量表达ECA1可以使eca1突变体生长恢复正常。ECA1在缺失内源钙泵的锰敏感酵母菌K616中的表达可以提高其对锰和锌的耐性, ECA1向内质网转运锰是为了降低细胞质中的Mn2＋浓度, 表明ECA1介导锰泵入内质网可能是植物耐锰的机制之一(Wu et al., 2002)。拟南芥ECA3序列与ECA2不同, 但是ECA3能够部分恢复高尔基体和液泡钙/锰泵缺陷酵母菌的生长, 表明ECA3同时参与高尔基体和液泡锰的转运过程。ECA3的T-DNA插入突变体在缺锰时失绿, 根和地上部生长明显受到抑制, 但供给低水平的锰时, 缺锰表型减轻, 表明ECA3在锰营养中具有重要作用。ECA3启动子与GUS融合表达显示, ECA3可在多种组织和细胞中表达, 如初生根尖、根维管束组织、叶片的排水器和保卫细胞等; ECA3-YFP融合表达表明, AtECA3在烟草细胞的高尔基体中表达, 说明AtECA3主要参与锰向高尔基体的运输过程, 且在锰的稳态和营养方面具有重要作用(Mills et al., 2008)。另有报道认为, ECA3能够赋予酵母突变体锰耐性; GFP融合表达显示, ECA3定位在酵母菌的内膜上, 而在拟南芥叶肉原生质体中则定位在内吞体入口(或膜泡前体中)。T-DNA插入突变体eca3在正常条件下根生长受到严重抑制, 且根生长对50 μmol·L–1(正常浓度)的锰敏感, 表明ECA3在锰的解毒过程中具有重要作用, 且其作用不能够被内质网定位的ECA1所取代。值得注意的是, eca3突变体根中产生的质外体蛋白量高于野生型65%, 表明根的分泌过程发生了改变。推测AtECA3可能是通过高尔基体活化作用来协调膜的转运过程, 将锰分配到液泡和细胞壁中, 从而发挥锰的解毒作用(Li et al., 2008)。番茄LCA1是ECA1的同源物, 能够恢复锰敏感酵母菌突变体的生长, 表明LCA1能够使锰进入分泌途径, 并具有补偿植物缺乏Ca2+-ATPase分泌途径的功能(Johnson et al., 2009)。

4展望

综上所述, 重金属锰对植物造成的毒害机制是多方面、多水平的, 既存在差异, 又相互联系; 同时, 植物对重金属锰的胁迫也有多种防卫及耐性机制。因此不能够仅从某一方面孤立地进行研究, 应从整体上把握, 全面考虑Mn2+在植物细胞内的活动, 才能够对植物的耐锰机制有更为清晰的认识。另外, 不同植物或同一植物的不同品种在锰胁迫的响应机制上表现出较大的差异。正是由于锰毒及植物耐锰机制的复杂性及多样性, 因此不能用单一机理去解释植物对金属锰的耐性; 应针对不同植物或不同品种给出最合理的解释, 力求在基因分子水平上分离得到其共同的锰抗性基因, 并利用基因工程培育出耐锰的作物品种, 为治理环境污染及矫正土壤锰毒作出贡献。

利用植物修复技术治理重金属污染已成为当前研究的热点, 国内对于土壤及水体锰毒植物修复的研究, 因受限于研究对象的匮乏或研究对象为多年生木本植物, 不易进行实验室研究等困难而进展缓慢。近年来, 美洲商陆、水蓼这些在本土新发现的锰超累积草本植物为各项研究的深入开展带来了便利。针对目前锰对植物毒害及植物耐锰机制的研究现状, 今后的研究工作应重点关注以下7方面。(1)锰毒能够导致一些植物(如玉米)的叶绿体形态结构畸变, 并且锰敏感品种较耐性品种的变化更大, 那么锰毒诱使叶绿体结构发生变化的作用机制及锰耐性品种是如何减弱叶绿体形态畸变等问题需要深层次探讨; (2)有机酸螯合是植物锰的解毒机制之一, 然而, 植物的根系如何感受锰胁迫信号, 又如何有效调控植物体内有机酸的合成与分泌等问题也需要深入研究; (3)一些植物的根际具有氧化能力, 能够将根际土壤中的锰氧化成非有效态形式从而限制锰的吸收, 然而根际是通过释放氧气, 还是分泌氧化性物质(或其它形式的作用)来获得

张玉秀等:锰对植物毒害及植物耐锰机理研究进展 517

这种根际氧化能力尚有待研究; (4)植物的抗氧化系统在植物抗氧化胁迫方面作用显著, 那么植物体内的抗氧化酶系统以及氧化还原调节网络在响应锰毒胁迫时是如何相互配合、制约、协调作用的问题值得进一步深入探讨; (5)重金属铜、锌和镉等能够诱导拟南芥原生质体DNA损伤(聂志刚等, 2009), 因此加强锰对DNA的毒理效应和损伤机制研究, 可为环境污染检测和植物响应锰分子机理研究提供新的证据; (6)一些金属-金属(如铝-锰)、金属-非金属(如锰-硅)离子交互作用能够抑制植物体对锰的过量吸收, 从而降低各组织器官中锰的浓度以改善锰毒胁迫, 然而, 这种交互作用的机制有待进一步深入探讨; (7)近年来一些金属转运蛋白在锰吸收、长途转运和累积中的作用已经得到确认, 进一步分离鉴定金属累积相关基因, 以便利用基因工程技术改良植物的耐锰能力, 对于开发植物修复技术具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

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520 植物学报 45(4) 2010

Mechanisms of Manganese Toxicity and Manganese

Tolerance in Plants

Yuxiu Zhang1, Linfeng Li1, Tuanyao Chai2*, Dan Lin1, Hongmei Zhang1 1Department of Bioengineering, School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Tech-

nology (Beijing), Beijing 100083, China; 2College of Life Science, Graduate University of Chinese Academy of Sciences,

Beijing 100049, China

Abstract The concentration of available Mn in soil is increasing with increased mining. Excess Mn2+ inhibits the uptake and activity of Ca2+, Fe2+ and Mg2+ and induces oxidative stress, which leads to decreased chlorophyll and rubisco con-tents, damaged chloroplast ultrastructure, reduced photosynthetic rate, and even death. However, a number of plant species have evolved on metalliferous soils and can tolerate high levels of Mn2+ in the soil and, more importantly, in the plant shoot. Thus, they are adapted to extreme soil metal environments. Investigating the mechanisms of Mn toxicity and detoxification can help develop plants suited for remediation of metal-contaminated soils via phytoremediation. Plants have developed various mechanisms, including compartmentalization, chelation, avoidance of uptake and exclusion, antioxidation, and ion interaction, to overcome Mn toxicity. The detoxification mechanisms in different organs are not the same. In roots, the exudation of organic acid mainly contributes to Mn detoxification (both internally and externally), up-take and transport. The storage of Mn in the root cell walls may keep the ion sequestered from the root cytoplasm. In leaves, the Mn preferentially accumulated in leaf epidermal cells may be associated with avoidance of damage to photo-synthesis, because epidermal cells (except for guard cells) lack chloroplasts. At the cellular level, Mn ion or the Mn-chelate complex is predominantly sequestered in the vacuole of mesophyll cells and cell walls by compartmentaliza-tion. Furthermore, the trichomes of the epidermis may excrete Mn-chelating molecules. The conversion of Mn2+ to a me-tabolically inactive compound by organic acid or phenolic compounds, such as the Mn-oxalate complex, is one of the important detoxification mechanisms. The metal transporters involved in removing Mn from the cytosol or moving it to the vacuolar membrane, where Mn can be sequestered into a large and metabolically relatively inert intracellular compart-ment, play important roles in the Mn uptake, transportation and accumulation at whole plant level. Further detailed studies are needed to elucidate the molecular mechanism of Mn tolerance in plants.

Key words manganese toxicity, metal transporter, tolerance

Zhang YX, Li LF, Chai TY, Lin D, Zhang HM (2010). Mechanisms of manganese toxicity and manganese tolerance in plants. Chin Bull Bot45, 506–520.

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*Author for correspondence. E-mail: tychai@https://www.360docs.net/doc/c610341613.html,

(责任编辑: 孙冬花)