量子点的荧光共振能量转移在生物分析中的应用

荧光共振能量转移(FRET)技术在生物研究探究中的运用资料精

荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的应用 高裕锋分析化学B200425012 摘要：简要综述了荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的一些应用。核酸的结构、DNA测序、核酸杂交、蛋白质结构和蛋白质相互作用等的研究是生命科学研究重要组成部分，相关工作一直备受关注，而FRET技术被广泛应用于相关领域研究中，并取得了较突出的结果。 关键词：荧光共振能量转移（FRET），核酸结构，DNA测序，核酸杂交，蛋白质结构，蛋白质相互作用。 生命科学被誉为21世纪的科学，为了揭示生命的奥妙，人们投入了大量的工作。其中对于核酸和蛋白质的研究备受关注，大量的新技术与新方法被用于该领域的研究中。荧光共振能量转移技术是一项经典的荧光技术，但是随着荧光成像技术的发展，二者相互结合，成为了生命科学领域的一个重要研究手段[1,2]。本文简单介绍了基于FRET原理的新技术在生物研究中的一些应用。 一、FRET基本原理[3] FRET现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster[4,5]创立了理论原理。FRET 指荧光能量给体与受体间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程，又称为长距离能量转移。产生FRET的条件（图1）主要有三个：（1）给体与受体间在合适的距离（1～10 nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。 图1 产生FRET条件示意图

FRET 的效率用E 表示，E 用式（1）计算：其中R 0为Foster 距离，表示某一给定给体与受 60660R E R R =+ （1） 240D DA R const n J κφ?=???? （2） 体间能量转移效率为50％时的距离；R 为给体与受体的实际距离。R 0可由式（2）计算：其中κ2 是方向因素,n 是溶剂的反射系数,φD 是供体探针结合到蛋白的量子效率, J DA 是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。 由式（2）可看出R 0对于给定的给－受体是一个特征值，因此，式（1）中E 值与 R 的关系紧密，这也成为了FRET 用于测定分子间或基团间距离的重要理论依据。 E 值可由以下几种方式测定：用荧光强度表征（ E=1- I DA / I D ，I DA 表示A 存在时D 的荧光强度）；用量子产率表征（ E=1-φDA /φD ）；用荧光寿命表征（E=1-τDA /τD ）。这表示研究FRET 可以通过不同的实验设备，既可以用普通光谱仪测定其荧光强度、量子产率，也可以用时间分辨仪测定其荧光寿命。 随着成像技术的发展，用显微成像的方法可更直观地观测FRET 地发生。 二、FRET 探针 FRET 需要两个探针，即荧光给体与荧光受体，要求是给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定交叠，而与受体的发射光谱尽量无交叠。 常用的探针主要有三种：荧光蛋白、传统有机染料和镧系染料。 荧光蛋白[6]是一类能发射荧光的 天然蛋白及其突变体，常见的有绿色荧光蛋白（GFP ）、蓝色荧光蛋白（BFP ）、 青色荧光蛋白（CFP ）和黄色荧光蛋白（YFP ）等。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可 根据需要组成不同的探针对。荧光蛋白的突出优点是自身为生物分子，可有效地与目标分子融 合，更易于在生物环境中使用，且其种类多，可满足不同光谱需要。其缺陷是分子体积大， 空间分辨率较低，且可能与目标分子作用产生化学发光，需要较长地时间来确定荧光形式， 不利于动力学研究。为克服这些缺陷，常使用荧光蛋白与其他染料联用或用其他染料对来研究。 传统有机染料是指一些具有特征吸收和发射光谱地有机化合物组成地染料对。常见的有荧光素、罗丹明类化合物和 青色染料Cy3、Cy5等。该类染料分子体积较小，种类较多且大部分为商品化的分子探针染料，因此应用较为广泛。 镧系染料[7]一般与有机染料联用分 别作为FRET 的给－受体，其主要优点是：测量量可

1荧光共振能量转移 原理 如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个

1.荧光共振能量转移 原理 如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。 优点 1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子, 2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像, 3.准确度高，操作简便 4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息, 缺点 首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变; 其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰; 另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。

2.蛋白质双杂交技术 原理 以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。 酵母双杂交系统的优点及局限 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用

荧光共振能量转移技术的基 本原理和应用 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量

荧光共振能量转移

FRET技术研究PEDF和目标蛋白 之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的 相互作用 一、FRET技术基本原理 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开； ②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。） 以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构 建融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白 质b、YFP（yellow fluorescent protein）。用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。）

生物发光共振能量转移

BRET 生物发光共振能量转移 技术简介： 生物发光共振能量转移（BRET）技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术.它的最大优势是能在活细胞中实时进行检测，因此能够进行相互作用动力学的研究。在应用这个系统研究感兴趣的蛋白前，首先需要将Rluc或者EYFP 融合到每个蛋白或者他们的辅蛋白上。在细胞中，融合蛋白共表达，然后和荧光素酶和其底物腔肠素反应，当能量供体Rluc，能量受体EYFP 之间距离比较近的时候(10-100?)，那么光将从Rluc(峰值480nm发射)传递到EYFP，形成它的激发，并且发射一个波长在530nm 的发射光，BRET 量化的程度以发射光530nm 和480nm 的比率表示。 实验流程 1、用于BRET的表达质粒构建； 2、融合蛋白表达检测； 3、BRET实验； 4、实验结果分析及提交实验报告 客户提供 1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克隆） 2、用于实验细胞（如果我公司细胞库有可不需提供） 公司提供 详细实验步骤、使用仪器、及结果分析等详细实验报告。 服务周期和价格 具体咨询本公司 荧光共振能量转移（FRET） 荧光共振能量转移-FRET（Fluorescent Resonance Energy Transfer） 指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。

（1）FRET发生条件： 能量匹配：供体分子的发射光谱可以被受体分子吸收并产生荧光信号。供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠（>30%）； 作用距离：供体分子与受体分子的作用距离为1-10nm； FRET效率公式：用于计算分子/基团间作用距离R 偶极-偶极作用：供体分子与受体分子作用时的向量必须满足一定条件。 （2）FRET的应用： 通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息（作用距离、作用方向、能量传递效率）。常用于解决如下问题：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合体；转录机制；转化途径；分子运动；蛋白折叠等生物学问题。 （3）FRET常见的供体-受体荧光分子对： 荧光蛋白类： 染料类：

荧光漂白恢复_荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点

ZHONGGUO YIXUEZHUANGBEI 于 淼① 高 建① [文章编号] 1672-8270(2009)06-0008-02 [中图分类号] R 197 [文献标识码] B Characteristics of application and technology on FRAP , FRET and FCS/Yu Miao , Gao Jian//China Medical Equipment,2009,6(6):8-9. [Abstract] Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), fluorescence resonance energy transfer (FRET) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) are three experimental techniques based on the fluorescence analysis that are commonly used to study molecular interaction. In this article, we will discuss and compare the application and technical specifications for FRAP , FRET and FCS.[Key words] FRAP; FRET; FCS; Fluorescence Analysis [First-author's address] Laboratory Center, China Medical University, Shenyang 110001, China. 荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点 [摘要] 荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)和荧光相关光谱(FCS)是三种以荧光为基础的检测技术，常用来研究分子间相互作用。对三种技术的特点做以比较和讨论。 [关键词] 荧光漂白恢复；荧光共振能量转移；荧光相关光谱；荧光检测 作者简介 于淼,女,(1980- )，硕士，助教。现就职于中国医科大学实验技术中心，主要从事激光扫描共聚焦显微镜工作。 FRAP：经荧光素标记的某一区域被光照射后，荧光物质的光化学结构被破坏，荧光强度下降，但随之此处荧光强度会逐渐恢复，荧光强度与恢复强弱及快慢代表周围分子扩散的速率或分子运动速度[1]。 FRET：受激态荧光素（供体）将其能量向另一个荧光素（受体）传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。测定FRET程度的参数，包括供体淬灭、受体发射、供体荧光寿命、供体荧光去极化等[2]。 FCS：是一种通过检测微区内（共焦体积）分子 的荧光信息（强度、波动、波长等）来分析样品特性的检测 技术，类似于传统的荧光分光光度计，主要用于液态样品的成份分析[3]。 以上三种技术的主要参数有： 扩散率：测量扩散的速率，通常表现在分子和分子络合物的扩散系数。 多组分扩散：用来检测和区别单个和多组分之间扩散的能力。 运动分量：检测能够自由扩散的组分。 ①中国医科大学实验技术中心 辽宁 沈阳 110001

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用

荧光共振能量转移技术的基本原理和应用 荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。 一、FRET技术基本原理 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开； ②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。

生物物理复习要点(20200422094548)

2012年生物物理复习要点 第一章生物物理绪论 1. 生物物理的定义、研究内容和研究手段； 2. 生物物理的研究方法； 3. 为什么学多年来“生物物理学”的确切定义一直是该学科领域认 为不易回答的问题？ 4. 在17-19世纪生物物理发展的早期，主要涉及哪些方面的零散研究？那时为什么没能出现生物物理这门学科？ 5. 为什么说X射线及其X射线衍射定律的发现是生物物理迅速发展的先决条件？ 6. 1934年薛定谔（Schrodinger）在其系列演讲“生命是什么？--活细胞的物理观”中，倡导用物理学的观点和方法研讨生命的奥秘。他在 报告中提出了三个重要观点是什么？ 7. 近几十年来生物物理的发展和现状说明了什么观点？ 8. 生物物理仪器与实验技术包括哪几个方面？并列举各类中代表设备。 9. 生物物理研究内容是如何分类的？不同分类中包含哪些内容？ 10. 说明鸟为什么会飞的主要原因？ 第二章生物物理的量子力学基础 1. 掌握概念：热辐射、平衡热辐射、单色辐射强度、绝对黑体、光 电效应、光量子、发射光谱、吸收光谱、德布罗意假设、德布罗波、 海森伯测不准关系、 2. 基尔霍夫定律的内容； 3. 什么是普朗克能量量子化假设？ 4. 光电效应表现出哪四个实验规律？光电效应中经典物理理论的困 难是什么？ 5. 研究原子结构规律有哪两条途径？原子核式结构的缺陷是什么？ 玻尔原子理论有哪三个基本假设？玻尔原子理论有何重要意义？ 6. 解释光的波粒二象性；波动性和粒子性的具体体现；

7. 质量为m的粒子，以速度v运动时，不但具有粒子的性质，也具有波动的性质；波动性和粒子性的联系式即德布罗意关系式是什么？ 8. 如何从从德布罗意波导出氢原子玻尔理论中角动量量子化条件？ 9. 1923年戴维逊物质波验证实验内容；1927年汤姆孙电子衍射实验内容； 10. 德布罗意波为概率波的含义是什么？ 11. 无数实验证明了实物粒子都具有波动性，如何描述其运动规律 呢？ 12. 薛定谔方程是如何建立的？ 13. 解释波函数物理意义； 14. 如何从测不准关系说明原子光谱宽度？ 第三章生物分子的相互作用 1. 分子的性质有哪些因素决定？ 2. 构型和构象的概念和区别；什么是分子构造？ 3. 化学键按成键时电子运动状态的不同可分为几种类型？分子间弱 相互作用有哪些？ 4. 离子键的定义和特点； 5. 共价键的定义和特点；用测不准关系说明共价键形成的要点； 6. 阐述价键理论的要点； 7. 什么是杂化轨道？sp、sp2和sp3的含义； 8. 分子轨道理论的主要内容； 9. s-s原子轨道和p-p原子轨道的含义； 10. 分子轨道：轨道、σ键和σ电子；π轨道、π键和π电子的含义； 11. 诱导偶极子的概念；电相互作用有哪些类型？ 12. 分子间存在的范德华力有三种来源，即色散力(London力)、诱导力(Debye力)和取向力(Keesom力) ，它们的作用机制是什么？ 13. 范德华力的特点、作用范围、受影响的主要因素对分子构成的物 质性质的影响； 14. 氢键的概念和特征；形成氢键必须具备的条件； 15. 什么是孤对电子？

生物发光和化学发光在生物技术中的应用

生物发光和化学发光在生物技术中的应用 最近的一些分子生物学进展使得一些生物技术工具极大提高了生物发光和化学发光的检测和快速应用。这些发展方便了体外和体内持续检测生物过程（如基因表达，蛋白质－蛋白质相互间作用和疾病的进程），可应用于临床、诊断、和药物开发等。而且，结合发光酶或某些在基因水平有生物特异结合位点的发光蛋白发展了超敏感和选择性的生物分析工具，如重组细胞生物传感器，免疫分析和核酸杂交系统。发光分析信号的高度可侦测性使得它非常适合于微小化的生物分析装置（如微矩阵，微流设备和高密度的微孔板）以用于小量样品体积的基因和蛋白的高通量筛选。 自从20多年前，Marlene DeLuca’s第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因（luc基因）的转基因烟草以来，生物发光的应用进入了一个新时代。生物发光和化学发光（BL/CL）的主要特点就在于发光信号的高度可测性，可以用PMT（光电倍增管）和CCD成像系统来检测极少量的光子信号。BL是属于CL范畴之内，CL反应的特点是高光子产生效率，BL为05-0.8 ，CL为0.1-0.001。因此BL/CL的检测极限可以达到10－18到10－21摩尔，这显然要比其它的光学技术强的多。 BL/CL已经发展出了很多具体的分析方法来诊断目前微摩尔或纳摩尔级的生物样本。通过BL/CL结合酶反应，如氧化酶、脱氢酶和激酶等，就可以达到如此的检测灵敏度。然而，以发光技术为基础的分析主要还仅仅停留在作为一个诊断工具。如果BL/CL的潜能能够得到开发，那么许多稀有的微量样品也可以通过一个便宜、可靠甚至是点对点的方式进行测量。分子生物学和生物技术持续地进展产生了一些新的BL/CL试剂，包括重组和突变酶及相关基因，可以作为报告剂或探针。这些工具的获得，再加上新的CL高效底物，促进了革新性的生物分析技术的出现，用于许多靶标的超敏感检测。 新的BL/CL生物技术工具 新的BL/CL报告基因 报告基因技术代表了分子生物学最近主要的进展之一。报告基因是一段DNA序列，编码一个很容易被侦测到的蛋白或酶。它们可以人工引入到一个细胞内来监测基因的表达，以得到整体细胞生物传感器或细胞定位的作用。报告基因技术应用到研发BL/CL全细胞生物传感器的原理如图1a。 目前，细菌荧光素酶基因（如陆上的Photorhabdus luminescens和海洋中Vibrio harveyi细菌的lux基因），真核的来自于萤火虫Photinus pyralis和海参Renilla reniformis的luc和ruc基因是广泛应用的BL报告基因。此外，一些新的基因cDNAs也已克隆和表达。有意思的是一些新的基因，如那些能够发射红光和绿光的Phrixothrix hirtus荧光素酶，各种突变的发不同波长光的萤火虫荧光素酶。不同的荧光素酶的特性如表1。此外最近克隆和纯化的重组辣根过氧化物酶（HRP）成为一个新的生物技术工具，在不久的将来有较大的期待。实际上，高效的HRP的底物已经商业化。HRP是与CL检测组合应用最广泛的酶之一。 双报告基因系统 在多重发光测试中，信号是同时产生，测试是独立进行。可以测试不同的发光动力学反应或不同的发射光波。可选择的是，反应也可以按顺序被促发，如商业化的Promega公司提供的Renilla和Firefly荧光素酶双报告基因试剂。双报告系统的原理如Figure 1b. 双重分析的BL/CL分析采用连续的闪烁型（Flash）发光形式，如发光蛋白水母蛋白和acridinium-9-carboxamide标记。这种方法可以在一个反应管里定量两个分析物和测试两个发

关于最全生物医学光子学复习题答案

生物医学光子学复习题 以下答案为本人根据上课PPT与自己理解所写，无法保证答案的完全正确，如果发现错误希望可以修改后上传，方便大家 1.Biophoton a)生物体的超弱发光有哪些基本特性？它与哪些生命活动相关？为什么利用 生物体的超弱发光能够用于疾病的诊断？ 答：生物体超弱发光基本特性（1）普遍性，即所有生物组织样品中都有。 （2）发光强度弱，每秒的强度为1e-7W。（3）谱特征，连续分布无特征峰。 （4）高敏感，对生物组织内部和外部。（5）来源于生物分子的能级跃迁。 相关的生命活动：细胞分裂，细胞死亡，光合作用，氧化作用，解毒过程，肿瘤发生 因为其反映了细胞内与细胞间的信息传递，功能调节等重要的生命活动， 因此可以 b)为何生物的超弱发光? 它与哪些生命活动相关？ 答：生物分子在代谢等相关生命活动中产生能级跃迁，退激发光。 c)为何“代谢发光”或者“相干机制” 答：代谢发光机制：由于呼吸链上固有的“能力学缺陷”而引起了偶发的 电子泄露，产生了氧化自由基，然后在反应中的激发态分子退激发光。主 要与生物的有氧呼吸有关。相干机制：产生于一个高度相干的电磁场，从 而诱发或自发发光。DNA被认为是生物体内一个主要的相干源，主要与生 物的细胞分裂有关。

d)针对超微弱发光的检测，有哪些测量技术，分别说明其测量原理。 答：单光子计数技术，主要通过光电倍增管来检测生物发光强度时域的信号。 二维或三维单光子成像检测技术，主要有微通道板像增强器为主的图像探测系统。具有二维光子检测能力，可同时获得时域和空间的信息。光谱分辨和时间分辨的功能检测系统。 e)超弱发光有哪些应用？ 超弱发光的医学应用 ?? 反映体内生理状态 ?? 荷瘤前后（病变－－正常） ?? 心博停止前和心博停止后 ?? 疾病诊断及愈合评价 ?? 血液的超弱发光 ?? 尿液 ?? 在法医上的应用 用于死亡时间的推测 ?? 临床死亡（心跳停止）后 ?? 生物学死亡（细胞性死亡） ?? 推断损伤时间、形状、程度及伤口愈合时 间 ?? 损伤与恢复程度与超弱发光有依赖性 生物超弱发光在农业上的应用

单分子荧光共振能量转移技术

研究生光谱 技术与应用课程 作业 河南大学 单分子荧光共振能量转移技术 学生：郭爱宇 学号：104753120870 学院：物理与电子学院 年级专业：2012级光学工程 课程名称：光谱技术及应用

指导老师：郭立俊教授

单分子荧光共振能量转移技术 摘要：单分子荧光共振能量转移技术(single molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensemble averages)，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。 关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团 1 引言 光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。在单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS）探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而单分子探测可对体系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。2002年美国第46届生物物理年会表明单分子仍是生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等[1]。由此可见，单分子荧光技术具有重要的地位。 标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度(molecular freedom of motion)及在化学和静电环境下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光偏振的各向异性（single molecule fluorescence polarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动(rotational motions)。另一个是单分子对荧光共振能量转移(single pair

非酶的化学发光共振能量的转移

非酶的化学发光共振能量的转移法：选择性好、灵敏度高的检测银离子的一种有效的方法 一种灵敏的非酶的化学发光的方法被用来检测银离子。这种测定基于化学发光共振能转移在鲁米诺和荧光素与三元络合物（荧光素、邻二氮杂菲和银离子）的形成之间。含有银离子的标准溶液范围集中在1.0×10-7M和2.5×10-4M之间，用所提议的方法测定，观察到标准曲线是在这个范围内是线性的，相关系数是0.9993。这种测定对银离子的极限被估计是5.0×10-8M。所提方法的优点是与其它方法相比，它具有高选择性和低检出限。 1．介绍 CRET法涉及到从化学发光给体到荧光团受体的非辐射能量转移。因为没有外部光源在CRET方法中被用来激发，所以由外部光源激发的非特定的信号是最小化的。最近，Ren和他的工作伙伴报告了在化学发光作为给体和量子点作为受体的CRET法。Zhang及其它人为腺嘌呤核苷三磷酸盐在癌细胞中呈现开发了一种以化学发光共振能量的转移法为基础的测定。Willer 和他的工作伙伴证明了CRET法在检测适体衬底络合物、汞离子和DNA这三种物质方面的应用。Bi及其他人为了选择性好、灵敏度高的检测DNA和蛋白质，基于CRET 系统开发了一种氧化石墨烯平台。这些研究表明，CRET系统是一种检测生物分子的强大的技术。然而，许多以前的CRET工作报道，用辣根过氧化酶催化H2O2氧化Luminol产生化学发光的反应的方法已经被使用。不幸的是，涉及到的外源酶限制了CRET系统的通用性。在大多数的案例中，由于酶的催化，使得测定变得复杂，例如，在研究中干扰生物的相互作用。 银是一种商业重要性的金属。银化合物和含银产品在工业和医药方面的使用增加已经导致银在环境样品中含量的增加。银离子已经展现出对水生生物很高的毒性，因此，水溶液中银离子的检测对环境监测和生物医药科学非常重要。贡献了许多努力在银离子的传感器系统的设计上，包括肽涂层硫化镉量子点系统，基于氧化石墨烯的荧光的DNA传感器，电致化学发光生物传感器，比率荧光传感器，纳米自身催化传感器，核酸功能化，硒化镉/硫化锌量子点系统。虽然以前的工作对银离子传感已经有了很好的贡献，但是还是有很大愿望用新的工艺去提高测定的选择性和灵敏度。 在这项工作中，非酶的化学发光方法被开发用于银离子的测定。这种测定基于CRET 在鲁米诺和荧光素之间与三元络合物（荧光素、邻二氮杂菲和银离子）的形成之间。使用这种方法，银离子能被特定检测到，较低的检测限和较宽的线性动态范围是可以实现的。检测银离子的最佳条件通过调查和定量检测废水中的银离子来证明。 2．实验 2.1. 仪器和试剂 化学发光（CL）光谱通过LS-55荧光光谱仪。鲁米诺购自Fluka。荧光素来自Sigma。AgNO3,K3和苯酚由上海试剂厂提供。在这项工作中所有其它使用到的化学药品均为分析级。水是用Milli-Q加185的装备从微孔纯化，并用于整个工作。 2.2. CL测量 把500μL、0.01M的鲁米诺溶液加入到5.0mL的标准烧瓶中，然后加入500μL、0.01M 的荧光素溶液和500μL、0.01M苯酚溶液和50μL不同浓度的银离子溶液。用PH为8.8的硼酸盐标记体积，溶液维持在室温5分钟。把一个1.0mL体积的合成混合物加到1cm长

荧光共振能量转移动态检测蛋白质相互作用的研究进展

＊［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３０９７１０８１；３０８７０９３２； ８１０７０９６１）；山东省自然科学基金资助项目（Ｎｏ． ＺＲ２０１１ＣＭ０２７；ＺＲ２００９ＤＺ００４）；山东省泰山学者专 项基金 △［通信作者］陈京，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｃｈｅｎ＠ｗａｒｗｉｃｋ．ａｃ．ｕｋＪ　Ｊｉｎｉｎｇ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１２，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－９７６０．２０１２．０１．０２０·综述·荧光共振能量转移动态检测蛋白质相互作用的研究进展 王　宏１　蔡　欣１　白　波２　陈　京２Δ （１泰山医学院基础医学院，山东泰安２７１０１６；２济宁医学院神经生物学研究所，山东济宁２７２０６７） 摘　要　荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）技术是近１０年来出现的一种新的检测蛋白质－蛋白质相互作用的技术。它的最大优势是能从“时间、空间、动态、连续”对活细胞中蛋白质之间的相互作用进行检测，该技术不但可以与其他技术结合来研究细胞膜上蛋白质之间的相互作用；而且还可用于分析细胞膜－细胞质－细胞核中所发生的信号转导途径。资料显示，ＦＲＥＴ技术所发挥作用是最近出现的几种技术所无法企及的，这对于疾病发病机制的研究及新的药物靶点的发现具有深远意义。 关键词　荧光共振能量转移；蛋白质－蛋白质相互作用；信号转导 中图分类号：Ｑ２７４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－９７６０（２０１２）０２－０６０－０４ 机体细胞中种类繁多的蛋白质各具不同的生理功能，从而使细胞对胞外信号做出不同的生物学反应。蛋白质的功能作用经常受不同条件下与不同配体间相互作用的调节。蛋白质之间的相互作用能够整合来自不同信号通路的信号并协调细胞内部的调节机制［１］。因此，研究蛋白质之间相互作用能够给这些研究提供新的见解。在过去的２０年中，已经开发了很多用于探测蛋白质相互作用的技术和方法，这些技术一般分为两部分，１）体外方法，例如免疫共沉淀、ｆａｒ－ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ、ＧＳＴ融合蛋白沉降技术等；２）体内方法，例如酵母双杂交系统，但是这些方法都具有一定的局限性。一方面，基于机械的、离心力高的或去垢剂的细胞裂解，上述方法都可能会改变蛋白质－蛋白质相互作用的自然状态；另一方面，上述技术无法提供活细胞内的特定蛋白间相互作用的时空信息［２］。近年来研究开发的荧光共振能量转移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎ－ｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）却能克服以上缺点，可以在活细胞中实时动态观测蛋白质之间的相互作用。更重要的是，ＦＲＥＴ还可以与其他技术结合［３］，如生物发光共振能量转移（ＢＲＥＴ）、蛋白互补技术（ＰＣＡｓ）等，既能研究两个蛋白之间的相互作用，还能用来研究３个或更多蛋白之间的相互作用，甚至是对信号网络的研究。本文就ＦＲＥＴ、ＦＲＥＴ与其他一些技术的结合及其应用做一简要综述。１　荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）技术的原理 ＦＲＥＴ理论描述的是两个荧光团之间的能量转移（图１）。在能量传输过程中，其中的一个荧光团作为能量供体（Ｄ），另一荧光团作为能量受体（Ａ）。以适当的激发光照射Ｄ，将会产生振荡偶极子，如果Ｄ的基态和Ａ的第一激发态的振动能量差相当，或者Ｄ的发射光谱与Ａ的吸收光谱能有效重叠时，当Ｄ与Ａ靠近时，或者说Ｄ与Ａ的偶极子之间的距离足够近时即能产生共振，通过偶极－偶极耦合作用将能量从Ｄ向Ａ转移，即发生非放射能量共振转移；Ａ接受能量从而发射出特异性荧光。在此共振能量转移过程当中，Ｄ特异性荧光的衰减或者Ａ特异性荧光的增强即可被检测到，从而实现ＦＲＥＴ检测［４］。 ＦＲＥＴ中两个常用的荧光蛋白为青色荧光蛋白（ｃｙａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＦＰ）和黄色荧光蛋白（ｙｅｌｌｏｗ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＹＦＰ）。ＦＲＥＴ具有广泛的应用前景，在蛋白质、ＤＮＡ等复合物的研究方面发挥重要作用。Ｋｈａｎ等［５］用ＦＲＥＴ检测出溶血磷脂胆碱能够通过迅速磷酸化和内化来快速激活Ｇ２Ａ，Ｇ２Ａ的活化能促使Ｇαｉ－１和Ｇαｑ／１１和Ｇβγ的释放，Ｇαｉ－１和Ｇαｑ／１１会使胞质内的Ｃａ２＋浓度升高及Ｇ２Ａ的激活促使ＧＲＫ６和β－ａｒ－ｒｅｓｔｉｎ的循环利用；而Ｇβγ能够与激活的Ｈｃｋ相互作用。Ｋａｚｕｔｏｓｈｉ　Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等［６］构建了一对融合的锌指结构蛋白，它们是一种具有Ｎ端二聚化序列和Ｃ端ＧＦＰ突变体的荧光传感蛋白。他们分别在锌指结构的末端标记ＧＦＰ的突变体ＣＦＰ和ＹＦＰ，将这一对锌指结构蛋白混合，并且加入特异 ０６

宽场_共振能量转移全内反射荧光的显微技术及其应用_张少华

*[基金项目] 国家自然科学基金重点项目(30430270) [作者单位] 1华中科技大学同济医学院病理生理学系,邮政编码 武汉430030; 2 湖北省黄石理工学院医学院; 通讯作者:王建枝, E -mail:W angjz@https://www.360docs.net/doc/c518490088.html, 本文2004-10-26收到,2005-01-20修回,2005-03-20接受宽场-共振能量转移-全内反射荧光的显微技术及其应用 * 张少华1 曹福元1 胡茂琼2 综述 王建枝1 审校 [中图分类号] Q6-33 [文献标识码] A [文章编号] 1005-1740(2005)02-0067-03 1 590年世界上第一台光学显微镜诞生,在随后的几百 年间,显微科学取得迅猛发展。人们逐渐地改进了成像质量,而且各种新的光学显微镜也应运而生。生命 科学中大量的事实表明细胞的动力学特征是起源于单个蛋白质分子的聚合和相互作用,对它的研究变得尤为重要。但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响,存在分辨极限[1]。光学显微镜空间分辨极限约250nm 。从应用的角度,传统的光学显微术无法满足更高的分辨率要求。还都需要破碎细胞或对细胞造成损伤,无法做到在活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。而基于强度的影像技术例如荧光共振能量转移(FRET )方法(宽场,共聚焦,双光子),使得研究活细胞内的这些相互作用变得容易了[2]。使许多复杂的研究例如蛋白质功能和加工、基因表达和第二信使传递、胞内信号传导等研究成为可能。显微荧光成像技术可在溶液,细胞悬液,多细胞,单细胞,细胞膜,细胞器等不同层次提供示踪、定性、定量等研究,例如对生物大分子间的相互作用、距离、动力学特性等。本文就基于常规宽场荧光显微技术、荧光共振能量转移显微技术和全内反射荧光显微技术的荧光显微光学实验平台分别进行了介绍和对比评估。1 宽场荧光显微技术 1.1 宽场荧光(Wide F ield Fluorescence,WFF )显微原理 宽场荧光显微术,是整个目标被激发光曝光,贯穿整个样本(焦面和焦外)的发射光被高数值孔径(N A)物镜收集。是荧光显微技术中最简单和最广泛应用的荧光光学平台。1.2 WF F 显微的技术要求 激发光源,常见的有汞灯和氙灯,汞氙复合电弧灯。汞灯的光谱中有丰富的紫外成分,并在某些特定的波长激发能 量存在峰值,因此,可以配合特定的荧光染料得到非常好的信噪比。但也正是由于汞灯光谱特性不平坦,限制了其在定量测量方面的应用,而主要用于形态学观察。对于做定量动态测量的应用,一般选择光谱特性相对平坦的氙灯。在双波长测量Ca 2+,M n 2+等离子浓度的应用中,一般选择氙灯做激发光源。而汞氙复合电弧灯结合了汞灯和氙灯的优点,可以用于定性形态学观察和定量测量复合电弧灯。利用光栅或滤镜可以选择性地得到某个特定波长的激发光,激发光通过聚光器光路和显微镜物镜光路照射到样品平面,激发出样品中荧光生色团的荧光。 显微镜和荧光物镜,在荧光显微技术中,对显微镜透射光照明设备的要求并不高。但对于物镜,则要求很高,需要满足两个基本要求:1)物镜的激发光频段通透性尽可能要好,以便让足够多的激发光达到样本平面。2)物镜的数值孔径尽可能高,由于荧光非常微弱,高数值孔径的物镜可以提高收集效率 [3] 。 检测设备,在宽场荧光显微技术中,一般使用科研级的电荷耦合器件(Charged Coupled Dev ice,CCD)(图像传感器)作为检测设备,要求低暗电流,高光电转换效率(Q E),低读出噪音,高分辨率。在特别弱的荧光检测应用,例如单分子荧光检测中,由于信号极其微弱,需要使用有EM (电子增益)的CCD,将信号在CCD 芯片内部先进行放大,提高信噪比,然后再由读出电路转换出去。这样可以获取极其微弱的荧光信号。在单分子动态成像(曝光时间短)应用中,可以获取有效的动力学信息[3]。1.3 WFF 显微技术的应用 宽场荧光显微技术,在形态学研究、定性鉴定、定量测量等方面都有广泛的应用。利用合适的荧光染料,例如Fura -2,Indo -2,可以研究细胞内钙信号的动力学特性。使用Fura -2染料时,选择双波长(340nm/380nm)激发,单波长(510nm)检测模式;而使用Indo -1染料时,则选择单波长(K )激发,双波长(K )检测模式。可以测量细胞内Ca 2+浓度信号的变化以及细胞间的Ca 2+浓度分布信号,例如与分泌的耦联、钙振荡等等。如果选择荧光蛋白作为荧光标记物,则可以实现宽场荧光共振能量转移(Wide F ield F RET )测量[4]。 微循环学杂志,2005,15(2):67~69 o C 2005 C HINES E JOUR NAL OF MIC ROC IR C ULA TION