SSR标记与扁穗牛鞭草农艺性状关联分析

摘要：利用ＳＳＲ引物对４４份外部形态差异较大的扁穗牛鞭草基因组进行扫描，结合农艺性状，进行性状与标记间的关联分析。结果表明，①扁穗牛鞭草群体的农艺性状存在较大变异，其中分蘖数变异最大，变异系数达３４．８％，其次是单株生物量、叶长和茎叶比，变异系数也达２０％以上。②扁穗牛鞭草农艺性状间存在显著的相关关系，单株生物量与叶宽、茎直径、茎长呈极显著正相关，茎叶比与节间长、茎长呈极显著正相关，与分蘖数呈极显著负相关。③通过单向分组资料的方差分析，从１８２条多态性条带中共检测到与扁穗牛鞭草８个农艺性状极显著相关的

ＳＳＲ标记１８个，其中，６个标记分别与２个以上性状关联。标记对性状变异的贡献率为１５．１％～３２．８％，ＳＧ５－１６０能解释３２．８％节间长表型变异，引物ＳＧ２５的４个标记对茎直径表型变异的总贡献率达９１．６％。该研究结果对早期发现优异种质，缩小筛选范围，降低筛选成本和工作量，加快扁穗牛鞭草育种进程有重要意义。

关键词：扁穗牛鞭草；ＳＳＲ标记；农艺性状；关联分析

中图分类号：Ｓ５４；Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）07－1494-05

ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｂｅｔ

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（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＸｉｃｈａｎｇＣｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉｃｈａｎｇ６１５０００，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ’ａｎ６２５０００，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｈｅｍａｒｔｈｒｉａｃｏｍｐｒｅｓｓａ；ＳＳＲｍａｒｋｅｒ；ａｇｒｏｎｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒ；ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ

扁穗牛鞭草（Ｈｅｍａｒｔｈｒｉａｃｏｍｐｒｅｓｓａ）为禾本科牛鞭草属多年生牧草，在我国主要分布在长江以南及河北、山东、陕西等地。扁穗牛鞭草生长期长、生长速度快、抗逆性强、产量高，是热带、亚热带建植人工草地和南方草山草坡改良的优良草种。目前对扁穗牛鞭草的遗传多样性［１－３］、生产性能［４］、繁殖特性［５］等方面进行了较为深入的研究，但对多基因控制的数量性状位点（ＱＴＬ）定位及与扁穗牛鞭草表型变异相关分子标记的研

究，尚未见报道。

关联分析是一种把候选基因的遗传变异与目标性状联系起来的技术，其理论依据是遗传标记与性状的连锁分析［６］。Ｖｉｒｋ等［７］对４０份具代表性的东南亚水稻种质进行ＲＡＰＤ标记与农艺性状间的关联分析，检测到与水稻的分蘖数、株高、开花期、穗长、叶长和粒宽相关的ＲＡＰＤ标记，其中ＯＰＣ－０８－３４０可以解释４９．８４％分蘖数变异。后来，在燕麦［８］、大麦［９－１１］、小麦［１２］、马铃薯［１３］、桑树［１４－１６］、杨树［１７，１８］等植物上，也找到一些与重要性状紧密相关的标记。但是，在牧草作物上，关联分析仅见于紫花苜蓿［１９，２０］和早熟禾［２１］。

扁穗牛鞭草结实率相当低，主要采用无性繁殖，关联分析无需构建专门的作图群体，为扁穗牛鞭草的ＱＴＬ定位提供了方向。扁穗牛鞭草主要采用传统育种方法，对表型进行选择，需要进行多年多点观测，耗时长效率低。本研究在扁穗牛鞭草表型研究的基础上，进行ＳＳＲ标记与农艺性状的关联分析，筛选与重要农艺性状紧密关联的ＳＳＲ分子标记，以期从分子水平解释扁穗牛鞭草遗传变异规律和机制，为筛选优异种质、加快育种进程奠定基础。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１扁穗牛鞭草材料采自四川、重庆、云南、贵州等地不同生境、野生状态下，外部形态差异明显的扁穗牛鞭草无性系４１份，及人工草地种植的国审品种“广益”、“重高”、“雅安”（表1），每个无性系取具２～３个节的茎段种植于直径为３０ｃｍ的塑料盆内，每盆１株，５个重复。

１．１．２试剂近缘植物高粱的ＳＳＲ引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；植物ＤＮＡ提取试剂盒、Ｔａｑ酶、１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ购自天根生化科技（北京）有限公司；其他化学试剂购自成都博瑞克生物技术有限公司。

１．２方法

１．２．１ＳＳＲ分子标记取幼嫩扁穗牛鞭草叶片，按植物ＤＮＡ提取试剂盒步骤提取ＤＮＡ。用０．８％的琼脂糖凝胶检测ＤＮＡ质量。从５０对ＳＳＲ引物中筛选出条带清晰、多态性好的１０对引物（表２）进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ体系及程序按照ＷＡＮＧ的方法［２２］。用６％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离检测，照相观察并记录结果。

１．２．２农艺性状测定测定单株生物量、茎叶比、分蘖数、叶长、叶宽、节间长、节直径、茎长，其中单株生物量、茎叶比、分蘖数为５次重复结果，其他为１５次重复结果。

１．３数据统计分析

对扩增条带进行统计，在相同的迁移位置，有带记为“１”，无带记为“０”，仅记录清晰强带和重复性好的弱带。根据标记带型的有无将群体划分为２个亚群体：组１和组０，对农艺性状进行单因素方差分析和相关分析［２３］，分析软件为ＳＰＳＳ１５．０。用组间方差与总方差的比值求得标记产生的性状变异占性状总变异的百分率，即标记对该性状变异的贡献率［１８］。

２结果与分析

２．１农艺性状的表型变异

研究结果表明，所选择扁穗牛鞭草群体的农艺性状存在较大变异（表3），其中分蘖数变异最大，变异系数达３４．８％，其次是单株生物量、叶长和茎叶比，变异系数也达２０％以上，叶宽、节间长、茎直径、茎长也存在不同程度的变异，变异系数分别为14.4%、17.3%、16.3%、16.2%。扁穗牛鞭草叶片最长为２８．９ｃｍ，最短为１０．４ｃｍ；叶片宽度最大值为０．９７６ｃｍ，最小值为０．４７５ｃｍ；节间最长为１０．１ｃｍ，最短为５．１ｃｍ；茎直径最大为０．５７１ｃｍ，最小为０．２７８ｃｍ；茎最长为１２４．２cｍ，茎最短为６３．１cｍ；单株分蘖数最多达２２７．３个，最少达４５．３个；单株生物量最高达９１３．３６ｇ，最少仅为２８１．３４ｇ；

茎叶比最高为５．１，最低为２．３。

２．２农艺性状表型相关

对农艺性状进行相关分析，结果表明，扁穗牛鞭草的农艺性状间均存在显著或极显著相关。对牧草育种来说，单株生物量和茎叶比是最重要的两个指标。从表４可知，扁穗牛鞭草单株生物量与叶宽、茎直径、茎长呈极显著正相关，茎叶比与节间长、茎长呈极显著正相关，与分蘖数呈极显著负相关。利用单株生物量和茎叶比与形态指标的相关关系，可对扁穗牛鞭草种质进行初步筛选，选择符合育种目标的种质作为进一步育种的材料。

２．３ＳＳＲ标记与性状的关联分析

采用１０对ＳＳＲ引物，共扩增出２２０条清晰、重复性好的条带，片段大小为５０～４００ｂｐ，其中多态性条带为１８２条，多态率为８２．７％，如ＳＧ５引物对的扩增结果，见图１。标记位点与数量性状的关联分析采用单向分组资料的方差分析方法，即根据标记带型的有无将群体划分为两个亚群体――组１和组０，然后进行单因素方差分析，获得与数量性状相关联的标记位点。通过单向分组资料的方差分析（表5），共检测到与扁穗牛鞭草农艺性状极显著相关的ＳＳＲ标记１８个，其中有６个标记分别与２个以上性状关联，分别是ＳＧ５－１６０（叶长、节间长、茎长）、ＳＧ１５－１２７（叶宽、节间长、茎直径）、ＳＧ２

５－１５７（叶长、叶宽、茎直径）、ＳＧ７－２２０（分蘖数、单株生物量）、ＳＧ２５－１３６（叶宽和茎直径）、ＳＧ２６－１６７（节间长、茎长）。单个性状关联的标记在１～７个之间，茎直径和单株分蘖数关联的标记最多，分别为７个和６个；其次，叶宽、节间长、茎长、叶长关联的标记分别是４个、３个、３个和２个，单株生物量和茎叶比关联的标记均为１个。每个标记对性状变异的贡献率为１５．１％～３２．８％，ＳＧ５－１６０能解释３２．８％节间长表型变异，引物ＳＧ２５的ＳＧ２５－１５７、ＳＧ２５－１３６、ＳＧ２５－１２５和ＳＧ２５－１１８４个标记对茎直径表型变异的总贡献率达９１．６％。

３结论与讨论

目前，对多基因控制的数量性状位点（ＱＴＬ）的研究均是利用两个具有多态性的种源（或家系）构建分离群体进行研究，但是这种人工创造的作图群体所含的优良目标基因有限，构建群体耗时，效率低［６］，而且对于无性繁殖的扁穗牛鞭草等植物，几乎不可能得到这样的分离群体。本研究采用野生扁穗牛鞭草无性系进行分子标记与数量性状间的关联分析，不仅避免了单一分离群体不易获得的局限性，而且由于野生扁穗牛鞭草无性系来源广泛、遗传背景复杂，可能聚集较多的性状基因，从而有望全面而系统地揭示出与扁穗牛鞭草农艺性状相关的ＱＴＬ。本研究中，某些标记同

时与多个性状相关联，如ＳＧ５－１６０与叶长、节间长、茎长关联，ＳＧ１５－１２７与叶宽、节间长、茎直径关联，且各农艺性状间也彼此相关。性状的相互关联可能是由于控制该性状的ＱＴＬ相互连锁或是某个ＱＴＬ的一因多效造

成的，同一标记与多个相关性状的关联可能是数量性状间在遗传上相关造成的［２４］。

连锁不平衡（Ｌｉｎｋａｇｅｄｉｓｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ，ＬＤ）程度决定关联分析的精度和所需标记的数量、密度。通常异花授粉植物重组率高，ＬＤ衰减较快，需要较多的标记；而自花授粉植物，特别是闭花授粉植物，ＤＮＡ多态性偏低，重组率低，ＬＤ衰减距离大，关联分析所需要的标记少［２５］。本研究从２２０个ＳＳＲ标记中找到１８个标记与农艺性状极显著相关，这与扁穗牛鞭草依靠无性繁殖、ＬＤ衰减慢、ＬＤ程度较高、所采用的ＳＳＲ标记可能覆盖了大部分基因组有关。

农艺性状是受多基因控制的数量性状，且各性状间均有一定的关联，通过常规育种技术对农艺性状进行改良往往效果不显著，且周期长。在ＤＮＡ水平上利用分子标记辅助选择育种对农艺性状、抗性等重要性状进行早期选择是很有前景的领域。本研究采用ＳＳＲ分子标记对扁穗牛鞭草材料进行扫描，发现１８个与扁穗牛鞭草农艺性状关联的标记，其中ＳＧ５－１６０对节间长变异的贡献率达３２．８％，引

物ＳＧ２５的４个标记（ＳＧ２５－１５７、ＳＧ２５－１３６、ＳＧ２５－１２５和ＳＧ２５－１１８）对茎直径表型变异的总贡献率达９１．６％。利用与主要农艺性状关联的标记可对大量扁穗牛鞭草种质进行筛选，可在早期发现优异种质，降低成本和工作量，这在扁穗牛鞭草新品种培育中有重要意义。

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