T4 连接酶

1、PCR产物回收时不够纯，产物中有抑制连接酶活性的物质，建议回收PCR产物时不要用玻璃奶，用柱子；

2、1700bp的PCR片段自身形成二级结构而影响连接，建议在建立连接体系时先不加连接酶，先将PCR产物和载体的混合物在45℃变性10分钟，迅速取出置于冰浴再加连接酶，16℃连接8小时以上；

3、PCR产物和载体比例不合适，建议尽量多加PCR产物；

4、连接酶效率不高，建议采用TaKaRa连接专用的的Solution Ⅰ，效率很高，经常在筛选平板上长满了白斑；

5、PCR片段3末端未加上A是一个可能的原因，建议先对PCR产物进行加A处理。

以上建议不知对spliner兄有无帮助。