ELISA方法检测鸡蛋中的氯霉素
ELISA方法检测鸡蛋中的抗生素
赵兰青，邓明镜，高阳
（北京科技大学，化学与生物工程学院，生技0901班，100083）
[摘要] 建立了以间接竞争酶联免疫吸附分析法为基础，经过包被抗原，加氯霉素标准品溶液和待测样品溶液后，再加抗体，然后加酶标记二抗和反应底物，最后加终止液后测量490nm下吸光度值等操作步骤后，测定了氯霉素浓度的检测下限为5ng/mL，定量范围为：5-50ng/mL。氯霉素浓度的对数值Log10（vtg）与结合率B/B0(%)的标准曲线方程为：y = -45.952x + 115.48，R2 = 0.9943，根据0-50 ng/mL相对应的曲线计算了未知样的浓度vtg S1=1.199ng/mL，vtg S2=386.1ng/mL，但是与实际浓度相差较大，且回收率异常。最后对实验结果和干扰因素进行了分析，以及对失败原因的探索，并进一步研究了实验条件的优化。
[关键词] 间接竞争ELISA方法氯霉素分光光度法
1引言
ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由瑞典的EngVall 和荷兰Van Weeman等人提出，1974年Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为吸附载体吸附抗体（抗原），再与相应的酶标记物结合，使ELISA操作更方便、易重复，灵敏度可高达ng至pg，因而成为生物化学，临床医学检验的常规测定方法之一；原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。因为其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在食品安全和卫生检测中得到了广泛的应用。
ELISA常用的测定方法主要有直接法和间接法两种：直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色；间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白（二抗），使与特异抗原抗体复合物的抗体作用，加入酶底物，显色。ELISA有许多改良方法，如夹心法、双抗夹心法、竞争法、酶—抗酶法和均质法等。常用方法大致可分为三类：（a）测定抗体的间接法；（b）测定抗原的双抗夹心法；（c）测定抗原的竞争法。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。
本实验旨在建立一种简单、快速、回收率高的氯霉素含量测定方法，改良优化其方法步骤，以节约实验室检测的费用及检测的时间，并进一步应用于食品安全检测。
2实验部分
2.1试剂与器材
2.1.1 试剂
抗体：鼠抗氯霉素（CAP）单克隆抗体
抗原：CAP-BSA
酶标记抗体（二抗）：HRP-羊抗鼠
样品：鸡蛋
缓冲液：
1）包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液（Na2CO3 0.159克，NaHCO30.294克，蒸馏水稀释至100mL）。
2）洗涤及稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBST溶液。（NaCl 8克，KH2PO4 0.2克，Na2HPO42.9克，Tween—20,0.5mL.蒸馏水加至1000mL）。
3）底物溶液：先配制pH5.0柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液。取0.1mol/L柠檬酸溶液24.3mL，加0.2mol/L(27.4g/L)NaHPO4溶液25.7mL，再加蒸馏水50mL，然后将80mg邻苯二胺溶解其中，再加30%H2O2 0.20mL即可应用，用时新鲜配制、避光。
4）终止液：2mol/LH2SO4。
2.1.2器材
聚苯乙烯微量反应板（96孔），可调式微量吸液器（200uL），八道可调式移液器，培养皿，小烧杯，隔水式恒温箱，酶联免疫检测仪
2.2实验步骤
2.2.1 包被抗原
用包被液将抗原稀释为2ug/mL，每孔加150uL，4℃冰箱放置16~18小时。
2.2.2 洗涤
倒尽板孔中液体，加200uL洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
2.2.3 封闭
用稀释液将BSA稀释成浓度为200ug/mL溶液，每孔加150uL，37℃放置1小时。
2.2.4 洗涤
倒尽板孔中液体，加200uL洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
2.2.5 加标准品
用稀释液将氯霉素标准品稀释成0.2ng/mL至100ng/mL溶液，每孔50微升。同时作稀释液对照。（因为4.7中加入50uL抗体，所以氯霉素被稀释为原浓度的1/2，即0.1ng/mL至50ng/mL）
2.2.6 加被测液
如下图所示，加入被测样，每孔50微升。
（注：数字表示加氯霉素的浓度ng/mL，S1和S2分别表示待测样1和待测样2，BLK表示空白对照）2.2.7 加抗体
向各孔中加入50uL抗体（用洗涤液稀释为200ng/mL）,37℃放置1小时。
2.2.8 洗涤
倒尽板孔中液体，加200uL洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
2.2.9 加二抗
将二抗用稀释液按1:5000稀释，每孔100微升，放置37℃1小时。
2.2.10 洗涤
倒尽板孔中液体，加200uL洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
2.2.11 加底物
邻苯二胺溶液加100微升，室温暗处10—15分钟。
2.2.12 加终止液
每孔加50微升H2SO4(2M)。
2.2.13 观察结果
用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
3结果与讨论
3.1标准曲线的绘制
3.1.1酶联免疫检测仪记录490nm下吸光度
3.1.2结合率B/B0(%)的计算
随机取5个空白的平均值（B5—F5），计算得平均值BLK=
（0.067+0.069+0.067+0.071+0.075）/5=0.0698;
氯霉素浓度为0时，其浓度的吸光度值OD0=（0.886+0.877）/2=0.8815;
同理，其浓度为0.1-50ng/mL时，吸光度的平均值分别为：
OD0.1=0.863
OD0.5=0.8685
OD1=0.8525
OD5=0.735
OD10=0.6505
OD50=0.3685
根据结合率B/B0(%)=（OD-Blank）/（OD0-Blank）×100，分别计算出结合率为：
B/B0(%)—0.1=97.72
B/B0(%)—0.5=98.40
B/B0(%)—1=96.43
B/B0(%)—5=81.95
B/B0(%)—10=71.54
B/B0(%)—50=36.80
3.1.3标准曲线的制作与优化
因为在溶液中，抗原与抗体结合率更倾向于与浓度的对数值呈线性关系，故绘制标准曲线时，应以浓度的对数值为横坐标。由以上数据得浓度的对数值Log10（vtg）与结合率B/B0(%)的关系如下表：
我国关于样品检测下限的定义为：即相对于空白可检测的最小样品含量，也就是样品最低检测浓度。定义样品检测下限为三倍空白标准偏差，即3σ空。本实验中，可以依据标准曲线的线性程度判断检测下限。绘制标准曲线时，若横坐标从Log10（0.1）开始，将其绘成曲线图，添加趋势线和显示公式，如下：
曲线1方程为：y = -22.131x + 88.208 ，R2 = 0.8097。当Log 10（vtg ）<0时，其B/B 0(%)几乎全部接近于100，且数值随Log 10（vtg ）的变化不成线性，若横坐标从Log 10（0.5
）或Log 10（1）开始，其线性程度也不理想，说明0.1,0.5,1未达到检测下限。
曲线2方程：y = -30.153x + 95.7 曲线3： y = -35.082x + 101.48
R2 = 0.9243
R2 = 0.947
进一步优化，取后三个点作标准曲线，添加趋势线和显示公式：
经过对个别点的取舍，曲线的线性程度提高，标准曲线（曲线4）方程：y = -45.952x + 115.48，R2 = 0.9943 。但是定量计算的范围变窄（5-50ng/mL），即只能检测在此范围内浓度的氯霉素样品。若结合率>81.95或<36.80，该标准曲线的参考价值不大。
3.2待测样品中氯霉素含量的计算
根据表2，待测样品1吸光度的平均值
OD S1=(0.896+0.844+0.872)/3=0.871;
OD S2=(0.154+0.15+0.166)/3=0.157。
所以相对应的结合率为：
B/B0(%)—S1=( OD S1-Blank）/（OD0-Blank）×100
=(0.871-0.0698)/( 0.8815-0.0698) ×100=98.71 ;
B/B0(%)—S2=( OD S2-Blank）/（OD0-Blank）×100=
=(0.157-0.0698)/( 0.8815-0.0698) ×100=10.74 。
但是两个样品的结合率均在精确定量范围之外，为保证浓度最终结果的可靠性和科学性，根据曲线3的方程，计算得：
Log10（vtg S1）=0.07896 vtg S1=1.199ng/mL
Log10（vtg S2）=2.587 vtg S2=386.1ng/mL
事实上，S1浓度vtgs1=0 ng/mL，不在定量范围之内；S2浓度vtgs2=22 ng/mL，在定量范围内。显然偏差太大，这可能是由于稀释过程中没有规范操作等原因引起的。所以计算而出的浓度值参考价值不大。
3.3回收率的计算
已知加入氯霉素浓度d=22ng/mL（S1浓度vtgs1=0 ng/mL，S2浓度vtgs2=22 ng/mL），回收率%=（S2-S1）/d*100%=1750.0%，回收率异常。正常的回收率应在80%-120%之间，回收率偏差太大，已经超出了正常偶然误差的范围，所以实验中一定有纰漏。计算出得回收率意义不大。
3.4实验结果及误差分析
本实验中测出氯霉素的检测下限为5 ng/mL，其定量范围为：5-50ng/mL。此范围内的标准曲线方程：y = -45.952x + 115.48，R2 = 0.9943 。但是总体数据较差，不能计算出待测样的浓度，而且回收率异常，造成实验失败的影响因素：
①配置氯霉素标准溶液时，由于稀释操作在微升水平上，浓度值易形成浮动而
不准确，进而引起误差；
②实验中倾倒洗涤液时，动作不迅速，造成了相邻孔的交叉污染；
③实验过程中数据处理易受到环境等客观因素的干扰，或是由于人为引起偶然误差的负面影响。
④实验中可能由于实验者用手触摸了聚苯乙烯微量反应板正面，因此部分孔中可能含有汗液等成分，干扰了吸光度值的最后测定。
3.5影响ELISA测定结果的因素
3.5.1 抗原
在ELISA中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对实验结果都有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。
3.5.2 固相载体
可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖酐、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。国产聚苯乙烯微量反应板目前已大量应用于ELISA测定，并且获得了满意的结果。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。
3.5.3 非特异性反应干扰的排除
除了设置稀释液空白、阳性和阴性参比血清等对照外，可采用包埋、封闭等预处理，如在洗涤液和稀释中加入牛血清白蛋白、明胶或吐温—20等，以减少非特异性反应的发生。高选择性的单克隆抗体代替多克隆抗体也是提高ELISA特异性的另一有效途径。
3.5.4酶和底物的选择
用于ELISA标记的酶，主要有辣根过氧化氢酶（HRP）、碱性磷酸酯酶（AP）、葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶等，而以HRP用得较多。酶底物本身要求无色，反应后能稳定呈色。一般HRP常采用邻苯二胺（产物橘黄色，可稳定呈色数小时）或邻联甲苯胺作酶底物；AP常用对硝基苯磷酸盐作酶底物。
3.6实验条件的优化
3.6.1 酶的底物的优化
HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HCL为水溶性。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA 试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD 后即可作为底物应用液。
3.6.2洗涤液的优化
洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
3.6.3 洗涤过程
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作主要为浸泡式，过程如下：
a.吸干或甩干孔内反应液；
b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；
c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；
d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；
e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
3.6.4 温育
在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。
ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。
4参考文献
[1] 时国庆，生物化学实验讲义，2008.12，36-45
[2] 赵瑞琦，酶联免疫吸附测定法（ELISA)在抗生素残留检测中的应用，大连普瑞康生物技术有限公司
[3] 艾妍，畜禽肉中残留抗生素的测定，2011.3
致谢
本文完成过程中，时国庆老师、钟广蓉老师、邓明镜等同学给予了很大的帮助，在此致以衷心的感谢。
常用细胞凋亡检测方法(图)
常用细胞凋亡检测方法（图） 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-16 13:41 文章来源：丁香通 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数：951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法
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ELISA检测方法有哪些？ 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图： 直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。 间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。 夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法： 双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，
蜂蜜中的氯霉素的测定
蜂蜜中的氯霉素的测定方法：SPE 基质：蜂制品 应用编 号： 101238 化合物：氯霉素 固定相：ProElut PLS 色谱柱/ 前处理小 柱： ProElut PLS 60mg / 3ml 50/pkg 商品编 号： 68003 样品前处理：1、提取 称取10 g 蜂蜜于50 mL 离心管中，加入10 mL 水，于涡旋混合器上混合3 min，待样品完全溶解后加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000rpm 下离心5 min，上层溶液转入100 mL 烧瓶中。下层溶液再加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000 rpm 下离心5 min，合并两次上层液于同一烧瓶中，减压浓缩至干，用3×1 mL 20% 的甲醇水溶液溶解残渣，待净化。 2、净化 a 活化：依次用3 mL 甲醇和3 mL 水活化ProElut PLS 60 mg/3 mL (Cat.#68003)，流出液弃去； b 上样：将待净化的样品液加入柱中，流出液弃去； c 淋洗：用3 mL 20% 甲醇水溶液淋洗，淋洗液弃去，并将PLS 柱抽干； d 洗脱：用3 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液； e 重新溶解：在40 oC 下用氮气将洗脱液吹至近干，然后用1 mL 40% 甲醇水溶液定容，供HPLC 分析 色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18(2) 250 x 4.6 mm ID, 5 μm (Cat. #99603) HPLC应用101320 作者：迪马科技 文章出 处： P109 关键字：蜂蜜，氯霉素，SPE，ProElut PLS 摘要：适用于蜂蜜中氯霉素的测定。
图例： 1. 氯霉素
细胞凋亡试验常用的方法
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
HIV实验室ELISA检测方法
人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法） 1 试剂信息 试剂厂家：北京万泰生物药业股份有限公司 2 样本要求 2.1 本试剂使用样品为人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。 2.2 不能检测含悬浮纤维蛋白或聚集物，重度溶血的样品。 2.3 样品中应无微生物，可在2-8℃储存1周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。 2.4 使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。 3 检测步骤 3.1 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。 3.2 编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照1型、2型各1孔、空白对照1孔。 3.3 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照100μL。 3.4 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.5 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 3.6 加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。 3.7 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.8 洗板：操作同步骤5。 3.9 显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37±1℃避光显色30±1分钟。 3.10 测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。 4 参考值 临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照A均值+0.12. 5 检验结果的解释 5.1 阴性对照孔A值≦0.10，阳性对照A值≧0.80，否则试验无效。 5.2 若有1孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复试验。
5.3 阴性判定：样品A值<临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阴性。 5.4 阳性判定：样品A值≧临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阳性。（注意：初试阳性应重新取样双孔复试。复试阳性者应按《全国艾滋病检测技术规范》送HIV确证实验室进行确证实验。）
水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法(KJ201905)
附件5 水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法 （KJ201905） 1 范围 本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。 2 原理 本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。 3 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 正己烷。 3.1.2 丙酮。 3.1.3 乙酸乙酯。 3.1.4乙腈 3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。 3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。 3.1.7 氯化钠 3.1.8 复溶液：称取0.12 g磷酸二氢钠(3.1.5)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16 g (3.1.6)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A 2.8 mL、溶液B 7.2 mL、氯化钠(3.1.7)0.85 g，用水溶解并稀释至100 mL，得磷酸盐缓冲液，即为复溶液。。 3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。 3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。 3.2 标准物质 氯霉素标准物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%。
(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项
(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项的全部内容。
常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法. 细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ～1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1）。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro—apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations)的空泡结构(图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 图2
ELISA检测
ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体 在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。 因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下： 1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。 2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。 3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。 4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。 5．加入酶底物，温育显色测定 本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调
亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方 法 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、 DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规
律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
ELISA检测方法
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
食品中氯霉素残留快速检测技术研究进展_张威
食品中氯霉素残留快速检测技术研究进展 张威，赵晓娟*，陈海光 （仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225） 摘要：氯霉素类抗生素残留引起的食品安全问题已引起人们的普遍关注。简述动物源性食品中氯霉素类抗生素残留状况，综述2004年以来氯霉素类抗生素残留常用检测技术的开发应用情况，重点介绍免疫速测、传感器等快速检测技术的最新研究进展及应用，最后对氯霉素类抗生素残留检测技术的发展趋势进行讨论。关键词：食品安全；氯霉素；残留；快速检测 Research Progress in Fast Detection Techniques of Chloramphenicol Residues in Food ZHANG Wei ，ZHAO Xiao-juan *， CHEN Hai-guang （College of Light Industry and Food Sciences ，Zhongkai University of Agriculture and Engineering ，Guangzhou 510225，Guangdong ，China ） Abstract ：Food safety issues caused by the chloramphenicol （CAPs ）residues have brought about increasing concern.In this paper ，the conditions of CAPs residues of animal derived food are introduced.The development and application of detection techniques of CAPs residues was summarized since 2004.In particular ，the fast detection techniques ，such as immunity analysis methods and sensors ，are focused.Finally ，the development trend of detection techniques of CAPs residues is discussed.Key words ：food safety ；chloramphenicol ；residues ；fast detection 基金项目： 国家自然科学基金项目（21005091）；广东省教育厅科技创新项目（2012KJCX0068）；广州市食品安全检测技术重点实验室（[2011]233-44） 作者简介：张威（1986—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品安全。*通信作者：赵晓娟（1980—），女，副教授，博士。 食品研究与开发 F ood Research And Development 2014年2月 第35卷第4期 DOI ：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.030 氯霉素类抗生素 （Chloramphenicols ，CAPs ），是一类包括氯霉素（Chloramphenicol ，CAP ）以及一系列氯霉素衍生物的广谱高效抗菌性药物。1947年，Ehrlich 等[1]首次从委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuela ）中分离得到CAP 。1948年，CAP 的结构被确定并成为第一种完全由人工合成的抗生素[2]。目前，我国常见的药用氯霉素类抗生素有氯霉素、甲砜霉素（Thiampheni －col ）和氟甲砜霉素（Florfenicol ）等。该类抗生素主要通过转换抗生素自身和改变微生物代谢机制[3]对多种病原菌起到较强抑制作用，因而广泛用于动物各种细菌性传染疾病的治疗，对各类家禽、家畜、水产品及蜂蜜制品各种传染性疾病的控制和治疗起重要作用[4]。 医学研究表明，肉、蛋和奶等动物源性食品中的CAPs 残留对人体有严重的副作用，长期微量摄入会使一些致病菌产生耐药性，并且引起机体正常菌群失调，使人们容易感染各种疾病。此外，CAPs 对人的骨髓细胞、肝细胞具有毒性作用，尤其是会引起与计量和疗程无关的不可逆再生障碍性贫血[5]。因此，许多国家已出台了关于氯霉素类药物禁用的相关法律法规和政策。例如，欧美仅允许氯霉素用于非食用动物；我国农业部2002年发布《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》，规定禁止在所有动物源性食品中使用氯霉素。但由于CAPs 价格低廉、抑菌效果好，目前仍被少数厂家违规使用，既对人类的健康造成极大威胁，也大大挫伤了人们对食品安全的信心。食品安全事件的频发和保障食品安全涉及到很多层面，但是无疑分析检测技术是保障食品安全的重要技术支撑，从监督层面对保证食品质量安全、保障人民身体健康等方面起到积极的促进作用。氯霉素类抗生素残留的检测技术主要有微生物检测技术、色谱检测技术、光谱分析技术和免疫速测法等快速检测技术。 专题论述 113
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
氯霉素试剂盒检测方法
酶标免疫分析定量检测氯霉素残留试剂盒。德国R-Biopharm公司制造(中文翻译件仅供参考,以试剂盒内附的英文原件为准.) 简介 RIDASCREEN Chloramphenicol（产品编号R1501） 竞争酶标免疫法定量测定牛奶，肉类及鸡蛋中的氯霉素残留。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔包括标准试验，如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。 检测下限: 尿液中50ppt 虾及鱼肉50ppt 牛奶中：150 ppt 肉类中: 100ppt 1. 用途 RIDASCREEN chloramphenicol竞争酶标免疫法定量测定牛奶，尿液，虾肉，鱼肉，肉类及鸡蛋中的氯霉素残留。 2.概要（略） 3.测定原理 测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔IgG（氯霉素抗体）的羊抗体。加入氯霉素抗体，氯霉素酶标记物，标准或样品溶液。游离氯霉素与氯霉素酶标记物竞争氯霉素抗体，同时氯霉素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量（选择参比波长≥600nm）。吸光度值与样品中的氯霉素浓度成反比。 4.提供的试剂 每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下： 1 X 96孔板（12条X 8孔）包被有抗兔IgG的羊抗体 6 X 浓缩标准液, 300ul/瓶, 为氯霉素溶液 0ppt，500ppt, 1500ppt, 4500ppt, 13500ppt, 40500ppt 1 X 过氧化物酶标记的氯霉素浓缩液…..……..红色帽 1 X 氯霉素抗体浓缩液…………………………..黑色帽 1 X 基质(7ml);含有过氧化尿素…….……….…..绿色帽 1 X 发色剂(7ml);四甲基联苯胺…….….…….….蓝色帽 1 X 反应停止液(14ml)1M硫酸....….……….…..黄色帽 1 X 缓冲液1(100ml)用于标准，酶标记物，抗体，样品 及缓冲液2稀释用 1X 缓冲液2（1ml），测定牛奶样品时的标准稀释用缓冲液 5.需要的材料但盒中不提供 设备
细胞凋亡的检测(含图片) 陈英玉
细胞凋亡的检测 细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
食品中农药残留检测实验方法步骤(精)
实验一粮食、水果和蔬菜中有机磷农药测定的气相色谱法 Experiment 1 Determination of Organophosphorus Pesticide Residues in Foodstuff, Fruits and Vegetables by Gas Chromatographic Method 1. 方法原理 样品中有机磷农药残留在加入无水硫酸钠后，用有乙酸乙酯提取、过滤、浓缩、定容，用气相色谱氮磷检测器(NPD或火焰光度检测器(FPD检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。 2. 方法适用范围 本法规定了粮食(大米、小麦、玉米、水果(苹果、梨、桃等、蔬莱(黄瓜、大白菜、西红柿等中速灭磷(mevinphos、甲拌磷(phorate、二嗪磷(diazinon、异稻瘟净(iprobenfos、甲基对硫磷(parathionmethyl、杀螟硫磷(fenitrothion、溴硫磷(bromophos 、水胺硫磷(isocarbophos、稻丰散(phenthoate、杀扑磷(methidathion等多组分残留量的测定。 3. 仪器与试剂 3.1 试剂 无水硫酸钠：分析纯，650℃灼烧4h ，冷却后贮于密闭容器中备有。丙酮：分析纯，重蒸馏。 乙酸乙酯：分析纯，重蒸馏。 所需有机磷农药标准溶液：纯度≥98.0%。 3.2 仪器与设备 气相色谱仪：配FPD 或NPD 高速组织捣碎机
微量注射器：5μL ，10μL 。 梨形瓶：200mL 具塞刻度试管：10mL 。 鸡心瓶：100mL 。 4. 样品处理步骤 4.1 提取和净化 称取试样25.0g 置于组织捣碎机中，加入25.0g 无水硫酸钠和50.0mL 乙酸乙酯，高速匀浆3min ，提取液经铺有无水硫酸钠的漏斗过滤，残渣用10mL 乙酸乙酯洗涤2次，合并滤液于梨形瓶中，用旋转蒸发器在45℃水浴减压浓缩后定容至5.0mL ，采用GC 测定。在分流/不分流进样口的玻璃衬管中填入0.5cm 高的石英棉，进样70次后，更换石英棉。 4.2 测定 4.2.1 色谱条件 (1 色谱柱：BP-10石英毛细管柱(25m×0.22mm×0.35μm (2 色谱柱温度：60(2min→10/min→200(0.2min →2/min→250℃℃℃℃℃ (3 进样口温度：270℃ (4 检测器温度：270℃ (5 载气和尾吹气：N2≥99.99%，0.5mL/min，尾吹气：35mL/min (6 氢气(FPD：40mL/min；空气(FPD：120mL/min (7 进样方式：不分流进样
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡的检测方法 一、细胞凋亡概念： 细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。 细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。 二、细胞凋亡的检测方法： 1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法) 在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。 荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合，用于识别凋亡细胞。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子 2. Caspase-3活性的检测: 半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3正常以酶原（32KDa ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa ）和两个小亚基（12KDa ）组成， 图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做阴性对照（左图）。使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。