His标签融合蛋白纯化常见问题解析
His蛋白纯化原理、方法和问题分析
组氨酸(His)标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。
IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。
HisTag_融合蛋白纯化(默克新版)
默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@
高纯度包涵体的制备 以下操作可用于任何 BugBuster®系列产品抽提的包涵体纯化。 1. 如可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。 2. 将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster（货号70584），BugBuster的量与当初重悬细胞糊的体积相同。
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一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
纯化条件的优化需考虑多个因素，包括 His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采 用一个较高的浓缩系数（concentration factor）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积 的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的 裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表 1。 例如，某蛋白表达水平约为 0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则 100ml 的培养物离心获得的菌体， 按浓缩 100 倍比例重悬于含变性剂的 1ml 裂解/结合缓冲液中。 在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用 50-100 倍浓缩。
产品使用说明书
His·Tag 融合蛋白纯化操作手册
采用 pET 系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到 20mg/100ml 培养物并不是困难的事。 在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周 质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后，首先进 行目的蛋白的细胞定位（请参考 pET 系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋 白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表 达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形 成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系，可以 通过选择不同表达载体和 E.coli 宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表 达的目的。His·Tag®融合蛋白，可以在天然条件或变性条件下用 NTA His·Bind 树脂或 IDA His·Bind 树脂进行纯化。
个人经验总结 His Taq镍柱纯化常见问题分析解决(FAQ)
镍柱纯化常见问题及分析1:通过His标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？（1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种入蛋白酶抑制剂改进。
（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。
（3）杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。
2:镍柱使用中出现棕色是怎么回事?(1)出现这样的情况，主要是缓冲液中DTT的影响，DTT会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免DTT的参与（一般的镍柱耐受小于5mM DTT,推荐缓冲液中不要超过2mM DTT）。
3:柱子堵了，怎么办？（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心。
（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，赶紧加入1-2mM DTT(上清样品处理要在冰浴中进行)，还不行加尿素变性，使其在变形环境下。
（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，或者导致蛋白析出或变性，料液比要在1/10-1/15之间较适宜。
4：纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂DTT。
（2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。
5：没能纯化到带His标签的蛋白，蛋白都流穿了（未挂柱）？（1）超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。
（2）样品或者是结合缓冲液不正确：策略：检测pH及样品和结合缓冲液的组成份（EDTA 等）。
确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及起始咪唑的浓度不是太高。
（3）组氨酸的标签没有完全的暴露策略：在变性条件下(用8M脲，6M盐酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT进行纯化。
蛋白纯化常见问题：His标签
蛋白纯化常见问题：His标签1、常用的His标签蛋白纯化填料，Ni Sepharose 6FF和Ni Sepharose HP有什么区别，应该如何选？答：HP：High Performance，高性能，填料平均颗粒大小约34 μm，颗粒细能带来高分辨率的分离纯化。
HP 纯化后峰更窄，样品浓度高，节省了浓缩步骤的时间，但会带来更高的反压，因此流速更慢。
FF：Fast Flow，快流速，填料平均颗粒大小约90 μm，较 HP 颗粒粗，流速快，具有良好的分辨率及轻松实现规模扩大的分离纯化，同样适用于重力流下的蛋白纯化和多孔板筛选。
2、HisTrap FF Crude 和 HisTrap excel 的特点是什么？应该如何选择？答：HisTrap FF Crude 的滤膜孔径更大，裂解液无需离心过滤处理，可以直接上样，适合样品不稳定或者比较粘稠容易造成柱子堵塞的料液。
例如如果纯化包涵体蛋白较多时，可以优先考虑FF Crude （预装柱）或 FF。
HisTrap excel 最大的特点是镍脱落极低，且能耐受100 mM EDTA，特别适合真核外泌蛋白（如培养基中含有螯合剂）。
无需脱镍，即可直接使用 NaOH 清洗，防止交叉污染且有更长的使用寿命。
3、 His 标签蛋白纯化实验中，常用的缓冲液成分是什么？答：建议缓冲溶液成分如下· 结合缓冲溶液：FF、 HP系列： 20mM磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl(避免非特异电荷吸附)，20-50mM 咪唑(提高浓度，可以增加纯度但会降低收率)， pH7.4 (可以根据实际情况调节pH)。
Talon 系列：20mM 磷酸钠缓冲溶液，500mM NaCl，10-20mM咪唑， pH7.4。
Excel 系列： 20mM 磷酸钠缓冲溶液， 500mM NaCl， pH7.4 (结合缓冲液中一般不添加咪唑，在wash缓冲液中可根据样品性质加入 0-30 mM 咪唑)· 洗脱缓冲溶液：20mM 磷酸钠缓冲溶液，500mM NaCl，500mM 咪唑，pH 7.44、纯化得到的组分中没有或很少目的 His 标签蛋白，怎么回事？答：若目的His 标签蛋白正常表达（使用抗His 标签的抗体进行WB 检测）且充分释放至上清中，确认蛋白是流穿还是未被洗脱：若 His 标签蛋白流穿：· 样品或结合缓冲液的条件不合适，注意螯合剂或强还原剂以及咪唑的浓度。
蛋白纯化试剂的原理及蛋白纯化实验问题分析
蛋白纯化试剂的原理及蛋白纯化实验问题分析蛋白纯化试剂盒主要是利用蛋白与亲和介质的亲和能力不同达到蛋白分离纯化的目的。
蛋白纯化试剂常见的蛋白标签有GST标签、HIS 标签等，本文主要介绍了蛋白纯化试剂盒的原理、His Tag 蛋白纯化方法试剂选择的方法、GST 标签融合蛋白纯化问题分析等。
蛋白抽提试剂盒和蛋白纯化试剂盒用途有什么不同?蛋白抽提试剂盒是从细菌、真菌、新鲜动植物组织或细胞蛋白、培养动植物组织将全细胞蛋白、核蛋白、胞浆蛋白、带化学修饰基团的天然蛋白(例如磷酸化蛋白)中的一种或两种以上作为目标从样品中分离收集的一套试剂。
用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等目的。
蛋白纯化试剂盒用于将连接有Flag标签GST HIS 标签的重组蛋白、包涵体蛋白、抗体从重组蛋白表达系统中高效浓缩分离出来。
主要原理是利用蛋白A或蛋白G与抗体的不变区有多个结合位点或Ni- Sepharose与HIS标签蛋白在不同缓冲液条件下亲和能力多得多差异分离目标蛋白。
将蛋白A与Sepharose共价交联制备的层析介质，可以用于纯化抗体。
抗体与蛋白A或蛋白G在高盐高pH值条件下结合，在低盐低pH值条件下解离。
蛋白纯化试剂盒广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。
GST常见问题解答集锦纯化方法的问题解决以下解决问题的指南指出了对于大多数纯化方法的普遍问题,对于特别的纯化方法的问题也有提及,这种情况下会指出相应的纯化方法.问题可能原因解决方法G S T 标签蛋白GST标签蛋白被机械裂解的方法在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件.裂解的条件不结合柱子或变性(比如超声).过分的裂解必须依照经验来决定. 结合非常弱会使标签蛋白变性,阻止其结合. GST标签蛋白在样品中有聚集, 在细胞裂解前加入DTT,在缓冲液中也加入DTT.1-20mM 导致沉淀标签蛋白的浓度过低的DTT会显著增加某些GST蛋白的结合. 浓缩样品.结合能力是浓度依赖的.低表达量的蛋白可能不会像高表达量蛋白那样有效地结合柱子.因此,浓缩样品会提高结合. 标签蛋白可能改变了G S T 的构检测所使用的pGEX载体中GST的结合.准备带有所使用的象,因此降低了GST标签蛋白的pGEX的细胞超声裂解物,检测其与柱材的结合.如果结合结合能力. 的很好,则可能是标签蛋白改变了GST的构象,因此降低了GST标签蛋白的亲和力.可以通过降低结合的温度到4°C限制洗涤来改善结果. 平衡时间太短确认柱材至少用5倍柱体积的pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如PBS). GST标签蛋白在pH值低于6.5和高在净化好的样品上样前用pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如于8时结合效率低GSTrap柱:柱子需要清洗PBS). 根据标准的清洗步骤清洗柱子(见附录2).如果GSTrap柱已经用过几次了,可能需要换用新柱. Glutathione Sepharose柱材使用使用新的Glutathione Sepharose柱材(清洗过程请见附录次数过多样品上样过程中的流速过高2) 降低在上样时的流速.影响GST标签蛋白结合的一个重要参数就是流速.由于GST与谷胱甘肽相对慢的结合,在样品上样过程中保持低流速以获得最大结合能力很重要. 在KTAprime plus上的GSTrap 柱子堵住了:根据说明书清洁柱子,确认样品已经离心或柱:柱子或系统被堵住了,导致用0.45m的滤膜过滤过了. 高压力和无结合. 系统堵住了:将柱子换成一段管子.如果压力高于0.3MPa,根据手册清洗系统在KTAprime plus上的GSTrap 检测是否使用了正确的柱子. 柱:样品不结合检测流入管是否接入了正确的流入端口. 检测缓冲液的组成和pH值是否正确.检测样品是否已经被调节到适合结合缓冲液的条件.1G S T 标签蛋白洗脱缓冲液的体积不够不能被高效的洗脱洗脱的时间不够增加洗脱缓冲液的体积.有些情况下,尤其是柱上酶切有标签蛋白时,需要更大体积的缓冲液来洗脱标签蛋白. 通过降低洗脱过程中的流速来增加洗脱时间. 对于GSTrap柱,为了获得最好的结果,在样品上样时,用0.2到1ml/min的流速(1ml HiTrap柱),0.5到5ml/min的流速(5ml HiTrap柱).对于离心方法,降低洗脱过程中的离心速度.谷胱甘肽的浓度不够增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度:本方案中建议的10mM 浓度对于大多数应用来说足够了,但是也存在例外.尝试使用50mM Tris-HCl,20-40mM 还原型谷胱甘肽,pH8.0作为洗脱缓冲液.洗脱缓冲液的pH过低增加洗脱缓冲液的pH值:将pH增加到8-9会增强洗脱而不用提高洗脱所用谷胱甘肽的浓度.洗脱缓冲液的离子强度过低.增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.10.2M的氯化钠也会使结果变好.洗脱缓冲也中的谷胱甘肽被氧化使用新鲜的洗脱缓冲液. 了加入DTT.非特异的疏水相互作用导致蛋白向洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂.加入1%的TritonX-100 和柱材非特异的结合或聚集,从或2%的n-octylglucoside可以显著提高某些GST标签蛋白的而阻止了标签蛋白的溶解和洗洗脱. 脱. 电泳或蛋白质分子量为70 000 的蛋白与GST标分子量为70 000 的蛋白可能是大肠杆菌dnaK基因的产物. 免疫印迹检测签蛋白共纯化发现多条条带该蛋白参与大肠杆菌中蛋白质折叠.有报道这种相互作用可以通过上样前在50mM Tris-HCl,2mM ATP,10mM MgSO4,pH7.4中37°C温浴10分钟而破坏.或者把有标签蛋白通过A TP-agarose或相似的纯化介质或进行离子交换层析来除去. 标签蛋白被蛋白酶部分降解加入蛋白酶抑制剂.多条条带可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的结果.在裂解溶液中加入1mM PMSF可能会使结果变好.一种无毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF, Roche Biochemicals的商品名为Pefabloc SC.注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa前除去. Prescission Protease不是一种经典的丝氨酸蛋白酶.经GE Healthcare检测,它对很多蛋白酶抑制剂不敏感. PMSF有毒,有急性作用.如果可能的话使用Pefabloc SC.2在宿主细菌中的蛋白降解用一种蛋白酶缺失型宿主:多条带可能是在宿主细菌中蛋白酶切造成的.如果是这种情况,或许需要蛋白酶缺陷型菌株(比如lon-或ompT).大肠杆菌BL21随pGEX载体提供. 这种菌株是ompT和lon缺陷型菌株.在机械裂解过程中细胞破碎降低裂解时间:细胞裂解表面上是使悬浊液部分澄清,可以通过镜检检测.机械裂解前加入溶菌酶(0.1倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能会使结果变好.避免发泡,因为这可能使标签蛋白变性.过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST标签蛋白共纯化.分子伴侣可能被共纯化了包括额外的纯化步骤:多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成.这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠.这些包括,但不仅仅是:DnaK(分子量70 000)DnaJ(分子量37 000)GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)GroES(分子量10 000).一些从这些共纯化的蛋白中分离GST标签蛋白的方法已经发表.抗体和很多种大肠杆菌中的蛋白抗体和大肠杆菌蛋白交叉反应:取决于抗GST抗体的来源. 反应它可能包含一些抗体,这些抗体与标签蛋白样品中的大肠杆菌蛋白能够反应.通过和大肠杆菌的超声裂解物反应来除掉那些能够交叉反应的抗体.GE Healthcare的GST抗体已经和大肠杆菌蛋白进行过交叉吸附,并检测证明其在蛋白质免疫印迹中没有非特异条带. 目的蛋白酶切蛋白酶切发生在宿主细菌内后电泳检测发现多条条带检测条带何时出现:确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在.这些条带可能是在宿主细菌中降解的结果. 目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa 的切割位点,检查序列.细节请参见《GST基因融合系统手册》.His Tag 蛋白纯化方法之选择全攻略HisTag 蛋白纯化篇：用基因工程的方法来表达蛋白质，必须经过纯化才能实现最终目的。
his 纯化小方法
1）蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH，此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，避免沉淀。
2）蛋白不吸附：这是最常见的，通常的原因有1是标签不暴露，被折叠在蛋白的结构内，可以在变性的条件下去纯化，2可以选择作用力更强，配基密度更高的填料，通常镍琼脂糖凝胶作用力最强，如果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料，如镍NTA琼脂糖凝胶，填料的好坏可以看填料的颜色，颜色越深那配基密度越高，作用力也相应要强。
3样品的pH过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的pH要尽量一致，避免沉淀，通常再偏碱性条件下吸附更好。
3）难洗脱：如果穿透中目标蛋白明显减少，而洗脱又没有，取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白，可以用更强的洗脱条件如500mM咪唑，如果还不能洗脱，可以直接用500mM咪唑加到6M盐酸胍去洗脱。
4）电泳杂带多：因为这种亲和毕竟特异性要差点，原因在蛋白中带组氨酸，色氨酸，半胱氨酸等很常见，特别是蛋白折叠会导致几个这样的氨基酸残基临近，这样也会使它们和镍柱的作用力增加，因此可以用不同浓度的咪唑阶段洗脱，此外在咪唑洗脱前增加一步0.5M pH5的醋酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添加0.5%吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，这样可以电泳的杂带明显减少，但是如果用这样的方法还是杂带多，那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签，或者因为样品长时间保存导致水解等，总之纯化的好坏决定于每一个步骤，不仅仅是纯化的问题。
还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加，而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善，对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加1-2mM巯基乙醇避免，如果这样的情况下最好是选择镍NTA琼脂糖凝胶，因为它在还原剂下更稳定。
His标签融合蛋白纯化常见问题解析
His标签融合蛋白纯化常见问题解析（博进生物）1. 纯化原理His标签融合蛋白的纯化是借助于层析介质上的过渡金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）与His融合蛋白上的His标签的配位作用实现目标蛋白的分离。
组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子通过螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白可以特异性的吸附在螯合了Ni2+等过渡金属离子的层析介质上，而其他不含His标签的杂质蛋白则不能吸附或仅微弱吸附在介质上。
通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，可以将His标签融合蛋白从层析介质上解吸附下来，从而得到较高纯度的目标蛋白。
2. His标签蛋白纯化策略His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和过渡金属离子之间配位作用力的强弱，而影响配位作用力强弱的因素如下：2.1 标签长度及暴露程度最常用的His标签是6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，可控制在4-10个组氨酸的标签长度。
标签越长，蛋白与过渡金属离子的结合力越强。
过渡金属离子只能与蛋白表面的组氨酸集合，所以His标签暴露的程度越高，结合能力越强。
2.2 过渡金属离子半径常用于螯合His标签蛋白的过渡金属离子有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等，金属离子的半径越小，与His标签蛋白的结合能力就越强。
上述金属离子与His标签蛋白结合能力的强弱顺序为Cu2+ >Zn2+ >Ni2+ >Co2+2.3 缓冲液条件His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用受缓冲液的pH值影响。
在中性或弱碱性（pH 7-8）环境下的螯合作用力要强于酸性环境下的作用力。
His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用还受缓冲液种类的影响。
通常磷酸盐缓冲液中的螯合作用力强于Tris-HCl缓冲液中的作用力。
由于咪唑可以和His标签蛋白竞争过渡金属离子，所以缓冲液中咪唑浓度的升高可减弱上述螯合作用力。
His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦（二）
His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦（二）His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦（二）GE Healthcare产品专家：查业、朱燕His标签的纯化方式是最常用的亲和层析的方法之一，镍离子作为纯化His融合蛋白的首选金属离子，镍填料的具体使用方法也成为用户比较关心的问题。
继His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦第一期収表后，应用户的需求，我们现推出第二期，内容如下：1.使用几次以后发现镍柱的载量下降，挂柱效率降低，如何处理？HisTrap或Ni填料怎么进行有效的再生或清洗？答：如果镍柱的载量下降或者挂柱效率降低，可能是由于逐渐积累的沉淀、变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法彻底清洗所致。
建议可以采用不同的清洗方法来提高载量：1）较温和的清洗方法为了去除沉淀或变性物质，可以尝试用2倍柱体积的6M盐酸胍或8M尿素洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤；为去除疏水结合的物质，可以尝试2倍柱体积1%的Triton X-100洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤。
若改变不明显，可以选择下面更强烈的清洗方法。
2) 更强烈的清洗方法首先用5－10倍柱体积的脱镍缓冲液（20 mM 磷酸钠, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH7.4）洗涤，迚行脱镍操作，然后用5－10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，最后用5－10倍柱体积的双蒸水冲洗；随后迚行清洗操作，去除离子型杂蛋白，可以用5倍柱体积的1.5M NaCl溶液，然后10倍柱体积的双蒸水冲洗；去除沉淀或变性蛋白，可以用1M氢氧化钠溶液，结合1－2小时，然后用10倍柱体积的平衡缓冲液和10倍柱体积的双蒸水迚行冲洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5－10倍柱体积的30%异丙醇溶液清洗，然后10倍柱体积的双蒸水洗涤；最后迚行生镍操作，用0.1M硫酸镍上柱，随后5倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液迚行洗涤，如需保存，保存在20%乙醇溶液即可。
2.通过组氨酸标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？答：可能原因1），蛋白酶部分降解目的蛋白，可通过加入蛋白酶抑制剂改迚；可能原因2），杂蛋白对金属离子有高亲和力，可用分步洗脱或咪唑浓度线性梯度洗脱来确定在结合和洗涤过程中最优的咪唑浓度。
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His标签融合蛋白纯化常见问题解析（博进生物）
1. 纯化原理
His标签融合蛋白的纯化是借助于层析介质上的过渡金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）与His融合蛋白上的His标签的配位作用实现目标蛋白的分离。
组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子通过螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白可以特异性的吸附在螯合了Ni2+等过渡金属离子的层析介质上，而其他不含His标签的杂质蛋白则不能吸附或仅微弱吸附在介质上。
通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，可以将His标签融合蛋白从层析介质上解吸附下来，从而得到较高纯度的目标蛋白。
2. His标签蛋白纯化策略
His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和过渡金属离子之间配位作用力的强弱，而影响配位作用力强弱的因素如下：
2.1 标签长度及暴露程度
最常用的His标签是6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，可控制在4-10个组氨酸的标签长度。
标签越长，蛋白与过渡金属离子的结合力越强。
过渡金属离子只能与蛋白表面的组氨酸集合，所以His标签暴露的程度越高，结合能力越强。
2.2 过渡金属离子半径
常用于螯合His标签蛋白的过渡金属离子有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等，金属离子的半径越小，与His标签蛋白的结合能力就越强。
上述金属离子与His标签蛋白结合能力的强弱顺序为Cu2+ >Zn2+ >Ni2+ >Co2+
2.3 缓冲液条件
His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用受缓冲液的pH值影响。
在中性或弱碱性（pH 7-8）环境下的螯合作用力要强于酸性环境下的作用力。
His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用还受缓冲液种类的影响。
通常磷酸盐缓冲液中的螯合作用力强于Tris-HCl缓冲液中的作用力。
由于咪唑可以和His标签蛋白竞争过渡金属离子，所以缓冲液中咪唑浓度的升高可减弱上述螯合作用力。
对于一些容易氧化的蛋白，往往需要在缓冲液中添加DTT或巯基乙醇等还原剂，这类还原剂会降低上述螯合作用力。
此外，还有一些与Ni2+等过渡金属离子存在高强度作用力的螯合试剂（如EDTA、柠檬酸等）会抑制上述螯合作用力，甚至是脱掉过渡金属离子，应谨慎使用。
2.4 结合时间
一定范围内，His标签蛋白与过渡金属离子的接触时间延长，结合能力亦会增强。
3. His标签蛋白纯化常见问题解析
3.1 蛋白不挂柱
His标签融合蛋白不挂柱是由于蛋白和层析介质之间的螯合作用力不足导致的。
根据上述几点的影响因素，亲，您找到原因了么？
3.1.1 His标签是否丢失
大肠杆菌表达外源蛋白过程中，常出现序列丢失的现象，若是标签丢失，蛋白自然就无法挂柱了。
可采用Western-Blot方法通过His抗体检测目标蛋白是否存在His标签。
3.1.2 His标签是否暴露在融合蛋白表面
在蛋白中加入适量的尿素或者盐酸胍等变性剂，若此时蛋白可以挂柱，说明蛋白表达过程中His标签可能暴露不充分，这个时候可以尝试在缓冲液中加入变性剂进行纯化。
若因蛋白本身原因不能添加变性剂，则只能尝试上游条件的修改，要么增加His标签长度，提高标签暴露的几率，要么修改His标签的位置。
3.1.3 更换过渡金属离子
如果选择用的是Ni2+或Co2+，换成Cu2+或Zn2+则就有可能挂柱了（亲，只是有可能哦）。
3.1.4 缓冲液选择是否正确
如果缓冲液中需要添加巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）等还原剂，则需要选择具有NTA配基的螯合介质（常规条件下选择IDA配基的螯合介质即可）。
如果缓冲液中含有EDTA等具有强螯合作用的试剂，应在纯化前去掉。
此外，适当提高缓冲液pH值、降低缓冲液中的盐浓度或者更换成磷酸盐缓冲液都可能提高His标签蛋白的挂柱能力。
3.1.5 提高接触时间
适当降低流速，提高蛋白与螯合介质的接触时间，可以提高目标蛋白的挂柱能力。
3.2 His标签蛋白挂柱后洗脱不下来
前述的蛋白无法挂柱是因为结合能力不足导致的，那么蛋白挂柱后洗脱不下来是因为洗脱条件太温和而无法破坏蛋白与过渡金属离子的螯合作用。
3.2.1 洗脱强度不够
可适当增加洗脱液中咪唑的浓度或者降低pH值。
3.2.2 蛋白和层析介质之间存在非特异性吸附
可以尝试在洗脱液中添加去垢剂（如0.2%的TritionX-100）。
3.2.3 蛋白是否沉淀在层析介质内部
可以尝试降低上样量或通过咪唑梯度洗脱的方式来避免蛋白沉淀。
3.2.4 改变缓冲液条件
降低缓冲液pH、提高咪唑浓度、提高盐浓度或者换成Tris-HCl缓冲液都有可能解决目标蛋白洗脱不下来的问题。
3.2.5 更换过渡金属离子
如果用的是Ni2+，可以尝试换成Co2+，降低目标蛋白与过渡金属离子的螯合作用。
如果上述方法均无法解决问题，只能从上游重新进行载体构建，尝试减少His标签中组氨酸的数量，或者更换其他的标签。
3.3 洗脱后的His标签蛋白纯度不够
只要蛋白中存在裸露的组氨酸，就存在过渡金属离子与蛋白之间的螯合作用。
因此，如何抑制含有裸露组氨酸的杂质蛋白与介质之间的结合是提高目标蛋白纯度的关键。
3.3.1 优化过渡金属离子种类
纯度不够的主要原因是宿主细胞蛋白中的一些含有组氨酸的杂蛋白吸附在鏊合介质上。
因此，可以采用螯合能力弱的Co2+作为过渡金属离子，使得含有组氨酸的杂蛋白无法吸附在介质上，从而提高目标蛋白的纯度。
3.3.2 优化上样和洗脱条件
寻找最优的上样和洗脱条件，抑制杂蛋白的吸附（如增加上样缓冲液中咪唑的浓度），将杂蛋白和目标蛋白尽可能的分开。
3.3.3 双标签纯化
在进行上游构建时，给目标蛋白加双重标签，通过两步亲和层析，提高目标蛋白的纯度。
3.3.4 多步纯化
在金属螯合层析之后，根据蛋白分子量大小和带电荷情况，加一步凝胶过滤层析或者离子交换层析，尝试将目标蛋白与杂质进一步分离开来，提高目标蛋白纯度。
注：上述内容部分取自于GE公司宣传资料。