第三章天然产物的提取与分离

第三章天然产物的提取与分离

第一节 类胡萝卜素的提取

一、实验目的

1. 初步了解天然化合物的提取方法。

2. 掌握薄层色谱（TLC）的原理、用途及使用方法。

二、实验原理

番茄和胡萝卜中都含有番茄红素和 β-胡萝卜素，这些都属于类胡萝卜素。它们的分子结构如下。

β-胡萝卜素分子结构

利用类胡萝卜素在乙醇及石油醚中的溶解性，使番茄红素的红色素和 β-胡萝卜素的黄色素得以富集。然后利用薄层色谱使混合物分离。

三、器材及试剂

器材：50 mL（或 100 mL）圆底烧瓶，250 mL 烧杯，球形冷凝管，长颈漏斗，50 mL 锥形瓶，空心塞，20 mL 量筒，2B 铅笔，厚约 2.5 mm、100 mm×30 mm 的载玻片 3 片，150 mL 广口瓶，60 mm×60 mm 载玻片，长方形滤纸，2B 铅笔，直尺。

试剂：番茄酱，95% 的乙醇，石油醚，饱和食盐水，无水硫酸镁，硅胶 G（GF254），0.5% 的羧甲基纤维素钠水溶液，丙酮。

四、实验内容

1．提取

在 50 mL（或 100 mL）圆底烧瓶中称取 4 g 克番茄酱，加入 10 mL 95% 的乙醇，水浴加热回流 3～5 min。冷却后过滤（普通过滤），将滤纸和滤渣转移到烧瓶，再加 10 mL 的石油醚（60～90 ?C）加热回流 3 min，过滤，合并两次的滤液，加 5 mL 饱和食盐水[1]摇匀，分出有机层，加无水硫酸镁干燥。

2．薄层层析

（1）制板。将 5 g 硅胶 G（GF254）在搅拌下慢慢加入到 12 mL 0.5% 的羧甲基纤维素钠水溶液中，调成糊状，然后将其倒在洁净的玻璃片上，用手轻轻振动，使涂层均匀平整，晾干。标准：无纹路，无团粒，看不到玻璃片上薄的涂料点。

（2）活化。薄层板经自然晾干后，再放入烘箱活化，进一步除去水分。

（3）点样。用铅笔（最好用 2B 铅笔）在层析板上距末端 1 cm 处轻轻画一横线[2]，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样。若颜色浅，可重复点样，需前次样点挥发干后进行。样点直径不应超过 2 mm，否则易拖尾影响测定。样点间距在 1～1.5 cm 为宜，太近易重叠。

（4）展开。缸内壁贴一片环绕缸内 4/5 周长的滤纸，倒入展开剂，液面高度约 5 mm。滤纸下面浸入展开剂（丙酮与石油醚混合液）中，盖好瓶盖，使层析缸被展开剂饱和 5～10 min。待样点干燥后，将层析板点样一端放入层析缸中，样点不得浸泡在展开剂中，再盖好瓶盖[3]。待展开剂上升至前沿约 1 cm 处取出，迅速在展开剂最前沿处画一横线。晾干，量出展开剂和样点移动的距离。

（5）计算比移值 R f。对于一种化合物，当展开条件相同时 R f 值是一个常数。R f 可用作定性分析的依据。

本实验约需 5 h。

五、注释

[1] 食盐水防止乳浊液生成。

[2] 画点样起点线时应尽量避免划破硅胶，且起点线离边缘的距离要大于展开瓶中的展开剂高度，以避免样点浸入展开剂。

[3] 开始展开后，则不能再移动展开瓶。

六、思考题

1. 一根毛细管能否点多个样品？为什么？

2. 展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响？

3. 如何利用 R f 值来鉴定化合物？

4. 为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？

第二节 菠菜色素的提取和色素分离

一、实验目的

1. 了解薄层色谱的一般原理和意义，学习薄层色谱的操作方法。

2. 掌握天然色素的提取方法。

3. 巩固液体有机化合物的干燥、抽滤、蒸馏等基本操作。

二、实验原理

绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。其结构如下。

叶绿素中 a 的含量通常是 b 的 3 倍。尽管叶绿素分子含有一个极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。

胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯，它有三种异构体，即 α-、β-和 γ-异构体，其中 β-异构体含量最多，也最重要。生长期较长的绿色植物中，β-异构体的含量多达 90%。β-异构体具有维生素 A 的生理活性，其结构是两分子维生素 A 在链端失去两分子水结合而成的。在生物体内，β-体受酶催化即形成维生素 A。目前 β-体已可进行工业生产，可作为维生素 A 使用，也可作为食品工业中的色素。

叶黄素是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。故本实验采用甲醇-石油醚的

混合溶剂提取以上三种色素，然后利用薄层色谱使各组分分离。

三、器材及试剂

器材：剪刀，研钵，抽滤装置，7 cm 滤纸，直形冷凝管，50 mL 圆底烧瓶，蒸馏头，温度计套管，100 ?C温度计，25 mL、50 mL 锥形瓶，真空尾接管，空心塞，20 mL 量筒，长方形滤纸，2B 铅笔，直尺，厚约 2.5 mm、100 mm×30 mm的载玻片 3 片，150 mL 广口瓶，60 mm×60 mm 载玻片。

试剂：新鲜菠菜叶，石油醚，甲醇，无水硫酸钠，无水乙醇，丙酮，硅胶 G，0.5% 的羧甲基纤维素钠水溶液，体积比为 8∶2 的石油醚-丙酮混合液。

四、实验内容

1．菠菜色素的提取

方法一：将菠菜叶洗净，甩去叶面上的水珠，摊在通风橱中抽风干燥至叶面无水迹。称取 20 g，用剪刀剪碎，置于研钵中，加入 20 mL 甲醇，研磨 5 分钟，转入布氏漏斗中抽滤，保留滤液。

将布氏漏斗中的糊状物放回研钵，加入体积比为 3∶2 的石油醚-甲醇（不溶，故要分开量取）混合液 20 mL，研磨，抽滤。用另一份 20 mL 混合液重复操作，抽干。合并三次的滤液，转入分液漏斗，每次用 10 mL 水洗涤两次，弃去水-醇层，将石油醚层用无水硫酸钠（约 5 g）干燥后滤入蒸馏瓶中，水浴加热蒸馏至剩约 1 mL残液。

方法二：将菠菜叶洗净，甩去叶面上的水珠，摊在通风橱中抽风干燥至叶面无水迹。称取 5 g，用剪刀剪碎，置于研钵中，用 30 mL 体积比为 3∶2 的石油醚-乙醇混合液分 3次研磨，抽滤。合并三次的滤液，转入分液漏斗，每次用 10 mL 水洗涤两次，弃去水-醇层，将石油醚层用 2 g 无水硫酸钠干燥后滤入蒸馏瓶中，水浴加热蒸馏至剩约 1 mL 残液。

方法三：将菠菜叶洗净，甩去叶面上的水珠，摊在通风橱中抽风干燥至叶面无水迹。称取 5 g，用剪刀剪碎，置于研钵中，先用 10 mL 丙酮研磨菠菜叶，再用 10 mL 石油醚研磨，过滤，合并两次的滤液，用 2 g 无水硫酸钠除去水分，提取液避光保存。

2．薄层层析

取四块显微载玻片，用硅胶 G 经 0.5% 羧甲基纤维素钠调制后制板，晾干后在 110 ?C 活化 1 h。点样[1]，用体积比为 8∶2 的石油醚-丙酮混合液作展开剂[2]后计算各样点的 R f 值[3]。

各样点的 R f 值因薄层厚度及活化程度不同而略有差异。大致次序为，第一色带β-胡萝卜素（橙黄色，R f≈0.75）；第二色带叶黄素（黄色，R f≈0.7）；第三色带叶绿素 a （蓝绿色，R f≈0.67）；第四色带叶绿素 b（黄绿色，R f≈0.50）[4]。

本实验约需 7 h。

五、注释

[1] 画点样起点线时应尽量避免划破硅胶，且起点线离边缘的距离要大于展开瓶中

的展开剂高度，以避免样点浸入展开剂。

[2] 展开剂也可选用体积比为 1∶1 的石油醚-乙酸乙酯。

[3] 开始展开后，则不能再移动展开瓶。

[4] 实践证明：方法一和方法二中被醇洗去了姜黄素。方法三中还有姜黄素的色班。

六、思考题

1. 试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在薄层板上移动最快？

2. 展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响？

3. 如何利用R f值来鉴定化合物？

第三节 从橙皮中提取柠檬烯

一、实验目的

1. 初步了解天然化合物的提取方法。

2. 掌握水蒸气蒸馏的原理、用途及操作。

二、实验原理

工业上常用水蒸气蒸馏的方法从植物组织中获取挥发性成分。这些挥发性成分的混合物统称精油，大都具有令人愉快的香味。从柠檬、橙子和柚子等水果的果皮中提取的精油 90% 以上是柠檬烯。

它是一种单环萜，分子中有一个手性中心。其 S-(－)-异构体存在于松针油、薄荷油中；R-(＋) 异构体存在于柠檬油、橙皮油中；外消旋体存在于香茅油中。本实验是先用水蒸气蒸馏法把柠檬烯从橙皮中提取出来，再用二氯甲烷萃取，蒸去二氯甲烷以获得精油，然后测定其折光率和比旋光度。

柠檬烯

三、器材及试剂

器材：剪刀或粉碎机，250 mL 圆底烧瓶，80 cm 长的玻璃管，三通管，T 形管，弹簧夹，玻璃弯管，温度计套管（2 个），250 mL 三口烧瓶，空心塞，蒸馏头，直形冷凝管，真空尾接管，100 mL 锥形瓶，100 mL分液漏斗，10 mL 量筒，50 mL 锥形瓶，50 mL

圆底烧瓶（2 个），250 mL 烧杯，100 ?C 温度计，循环水式真空泵，末端拉成毛细管的玻璃管，克氏蒸馏头，安全瓶。

试剂：新鲜橙子皮，二氯甲烷，无水硫酸钠。

四、实验内容

将 2～3 个橙子皮[1]剪成细碎的碎片，投入 250 mL 三口烧瓶中，加入约 30 mL 水，按照图 2-16 安装水蒸气蒸馏装置[2]。松开弹簧夹，加热水蒸气发生器至水沸腾，T 形管的支管口有大量水蒸气冒出时夹紧弹簧夹，打开冷凝水，水蒸气蒸馏即开始进行，可观察到在馏出液的水面上有一层很薄的油层。当馏出液收集约 60～70 mL 时，松开弹簧夹，然后停止加热。

将馏出液加入分液漏斗中，每次用 10 mL 二氯甲烷萃取3次。合并萃取液，置于干燥的 50 mL 锥瓶中，加入适量无水硫酸钠干燥半小时以上。将干燥好的溶液滤入 50 mL 蒸馏瓶中，用水浴加热蒸馏。当二氯甲烷基本蒸完后改用水泵减压蒸馏以除去残留的二氯甲烷。最后瓶中只留下少量橙黄色液体即为橙油。测定橙油的折光率和比旋光度[3]。

纯粹的柠檬烯：b.p.＝176 ?C ；0D n ＝1.472 7；20D []α＝＋125.6?。

本实验约需 5 h 。

五、注 释

[1] 橙皮最好是新鲜的。如果没有，干的亦可，但效果较差。

[2] 也可用 500 mL 单口烧瓶加入 250 mL 水，进行直接水蒸气蒸馏。

[3] 测旋光度可将几个人所得柠檬烯合并起来，用 95% 乙醇配成 5% 溶液进行测定，用纯柠檬烯的同样浓度的溶液进行比较。

六、思考题

1. 为什么要将橙皮剪碎？

2. 实验中应注意哪些问题？

第四节 从槐花米中提取芦丁

一、实验目的

1. 学习黄酮苷类化合物的提取方法。

2. 掌握趁热过滤及重结晶等基体操作。

二、实验原理

芦丁又称芸香苷，有调节毛细血管壁的渗透性的作用，临床上用作毛细血管止血药，作为高血压症的辅助治疗药物。

芦丁存在于槐花米和荞麦叶中，槐花米是槐系豆科槐属植物的花蕾，含芦丁量高达 12%～16%，荞麦叶中含 8%，芦丁是黄酮类植物的一种成分，黄酮类植物成分是存在于植物界并具有以下基本结构的一类化合物：

黄酮骨架

就黄色色素而言，它们的分子中都有一个酮式羰基，又显黄色，所以称为黄酮。

黄酮的中草药成分几乎都带有一个以上羟基，还可能有甲氧基、烃基、烃氧基等其他取代基，3、5、7、3'、4' 等几个位置上有羟基或甲氧基的机会最多，6、8、1'、2' 等位置上有取代基的成分比较少见。由于黄酮类化合物结构中的羟基较多，大多数情况下是一元苷，也有二元苷。芦丁是黄酮苷，其结构如下：

芦丁（Rutin）

三、器材及试剂

器材：研钵，50 mL 烧杯（2 个），抽滤装置，7 cm、11 cm 滤纸，pH 试纸，热滤漏斗，无颈漏斗，表面皿，玻璃棒。

试剂：槐花米，饱和石灰水，15% 盐酸。

四、实验内容

称取 3 g 槐花米于研钵中研成粉状，置于 50 mL 烧杯中，加入 30 mL 饱和石灰水溶液[1]，加热至沸，并不断搅拌，煮沸一刻钟后，抽滤，滤渣再用 20 mL 饱和石灰水溶液煮沸 10 min，合并滤液用 15% 盐酸中和，调节 pH 值为 3～4，放置 1～2 小时，使沉淀，抽滤，水洗，得芦丁粗产物。

将得到的芦丁粗品置于 50 mL 烧杯中，加入 30 mL 水，加热至沸，并不断搅拌，并慢慢加入 10 mL 饱和石灰水溶液，调节 pH 值为 8～9，等沉淀溶解后，趁热过滤，滤液置于 50 mL 烧杯中，用 15% 盐酸调 pH 值为 4～5[2]，静置 30 min，芦丁以浅黄色结晶析

出，抽滤，水洗，烘干得芦丁纯品。

本实验约需 4 h。

五、注释

[1] 加入饱和石灰水溶液既可以达到碱溶解提取芦丁的目的，又可以除去槐花米中大量多糖粘液质。也可直接加入 150 mL 水和 1 g Ca(OH)2 粉末，而不必配成饱和溶液，第二次溶解时只需加 100 mL 水。

[2] pH 值过低会使芦丁形成盐而增加了水溶性，降低收率。

六、思考题

1. 为什么可用碱法从槐花米中提取芦丁？

2. 怎样鉴别芦丁？

第五节 从茶叶中提取咖啡因

一、实验目的

1. 学习生物碱的提取原理和方法，了解咖啡因的性质。

2. 掌握索氏（Soxhlet）提取器的使用，掌握升华操作。

二、实验原理

咖啡因具有刺激心脏、兴奋大脑神经和利尿等作用，因此可用作中枢神经兴奋药。它也是复方阿司匹林等药物的组分之一。

咖啡碱是杂环化合物嘌呤的衍生物，是一种生物碱，它的化学名称是 1, 3, 7-三甲基-2，6-二氧嘌呤。其构造式为：

含结晶水的咖啡碱为白色针状结晶粉末，味苦。能溶于水、乙醇、丙酮、氯仿等，微溶于石油醚。在 100 ?C 时失去结晶水，开始升华。120 ?C 时升华相当显著，178 ?C 以上升华很快。无水咖啡碱的熔点为 234.5 ?C。

茶叶中含有咖啡因，占 1%～5%，少量的茶碱和可可豆碱，另外还含有 11%～12% 的丹宁酸（鞣酸）、0.6% 的色素、纤维素、蛋白质等。为了提取茶叶中的咖啡因，可用适当的溶剂（如氯仿、乙醇、苯等）在索氏提取器中连续萃取，然后蒸去溶剂，即得粗咖啡因。粗咖啡因中还含有其他一些生物碱和杂质（如单宁酸）等，可利用升华法进一

步提纯。咖啡因是弱碱性化合物，能与酸成盐。其水杨酸盐衍生物的熔点为 137 ?C，可借此进一步验证其结构。

三、器材及试剂

器材：索氏提取器，滤纸，100 mL 圆底烧瓶，蒸馏头，温度计套管，100 ?C 温度计，直形冷凝管，真空尾接管，100 mL 锥形瓶，蒸发皿，玻璃棒，水浴锅，11 cm 滤纸，托盘天平，棉花，玻璃漏斗，不锈钢刮匙，大头针。

试剂：95% 乙醇，沸石，茶叶末，生石灰。

四、实验内容

称取 6 g 茶叶末[1]放入索氏提取器（见图 2-18）的滤纸筒[2]中，在 100 mL 圆底烧瓶中加入 60 mL 95% 乙醇，水浴加热回流提取，直到提取液颜色较浅时为止（约2.5 h），待冷凝液刚刚虹吸下去时，立即停止加热。冷却后改用蒸馏装置进行蒸馏，待蒸出大部分乙醇溶液时停止蒸馏。把剩余的液体倒入蒸发皿中，加入 2～3 g 生石灰[3]，搅成浆状，在蒸气浴上蒸干成粉状，除尽乙醇。然后移至石棉网上用酒精灯小火加热，焙炒片刻，去除水分[4]。冷却后，在蒸发皿上盖一张刺有许多小孔且孔刺向上的滤纸，再在滤纸上罩一大小合适的玻璃漏斗，漏斗颈部塞一小团疏松的棉花。用酒精灯小火加热，适当控制温度[5]，使升华速度放慢，当发现有棕色烟雾时，即升华完毕，停止加热。冷却片刻后，揭开漏斗和滤纸，将附在上面的咖啡碱刮下，若残渣为绿色，则可再次用大火加热升华直至棕色为止。合并几次升华的咖啡碱测其熔点。

本实验约需 4 h。

五、注释

[1] 红茶中咖啡因含量高于绿茶，实验可选择红茶。

[2] 滤纸筒的大小要紧贴器壁，既取放方便，其高度又能超过虹吸管；滤纸包茶叶时要严密，纸套上面要折成凹形。

[3] 生石灰起中和作用，以除去茶叶中丹宁等酸性物质。

[4] 如水分未能除净，将会在下一步加热升华开始时在漏斗内出现水珠。若遇此情况，则用滤纸迅速擦干漏斗内的水珠并继续升华。

[5] 升华操作是实验成败的关键。在升华过程中始终都必须严格控制温度，温度太高会使产物分解、炭化，导致产品不纯和损失。

六、思考题

1. 本实验中使用生石灰的作用有哪些？

2. 除可用乙醇萃取咖啡因外，还可采用哪些溶剂萃取？

3. 用升华法提纯固体有什么优点和局限性？