淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT）
（一）原理：
四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：
MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原
（三）方法：
1、脾细胞制备：
（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；
（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；
（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；
（4）制备脾细胞悬液
①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。调整细胞浓度为
5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入
离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；
③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
注：①一般6～8周龄小鼠，根据品系不同，可得5～20×107细胞/只小鼠；
②手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。
2、淋巴细胞增殖反应：
将5 105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5％ CO2，37℃培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。37℃培养4-6小时。
4. 1000g离心10分钟弃上清，各孔内加入150μlDMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜。，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇100ul）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。
实验结果
将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。
转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。
注意事项
（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。
（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。
二、LAK/TIL细胞的制备与活性测定：
淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokine activated killer，LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，特别是在肿瘤免疫过继疗法中具有重要的应用前景，其制备及活性的检测对于评价机体的免疫状态具有重要的意义。以下主要介绍LAK/TIL制备的常规方法。
(一)主要试剂材料
1.试剂①IL-2；②RPMI-1640；③Ⅰ、Ⅳ型胶原酶，DNA酶；④四甲基偶氮盐；⑤酸化异丙醇：含0.04mo1/L HC1的异丙醇；⑥96孔细胞培养板。
2.肿瘤细胞系Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。所有细胞株均培养在含10%~20% NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20% NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml备用。
(二)外周血单个核细胞( PBMC )的制备及其LAK细胞的诱导
(1)肝素抗凝健康人静脉血通过Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，用含20% NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml。
(2)将上述细胞加人24孔培养板孔中，同时加人60ug PHA ，rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5 % CO2条件下培养，2~3d换液一次。吸弃1/2上清，加入含100U/ml的重组人IIr2 20% NCS-RPMI-1640培养液，继续培养3d，收集细胞，即为LAK。
(三)脾细胞的制备及其LAK细胞的体外诱导
将通过灌注去除红细胞后的正常人外伤摘除的脾脏，按常规方法制备成单个脾细胞悬液，经离心洗涤后，用含20 % NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml，加人rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5%CO2条件下培养，2~3d换液一次。
(四)TIL细胞的分离制备及其诱导
(1)无菌切取肿瘤组织，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中。
(2)将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10~ 20m1，同时加人0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4~6h。
(3)依次用80目和200目不锈钢网过滤。
(4)经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1 500r/min离心5~l0min。
(5)用含5 % NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加人试管底层，其上缓慢加人75%的淋巴细胞分层液(用
RPMI-1640配制)，然后缓慢加人上述肿瘤细胞悬液3~5ml。
(6)经1500~1800 r/min离心20min后，分别收集75%和100%淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞。
(7)用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心5~10min。肿瘤细胞加人冻存液后液氮冻存备用。TIL则用含20% NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5 ×106/ml。
(8)将上述细胞悬液接种于24孔培养板(1m1/孔)，同时分别加人IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb lug/m1，置37℃，5%CO2温箱培养3~4周，其间3~5d更换新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液。
(五)LAK细胞和TIL活性的测定
LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。但所用靶细胞为对NK 不敏感的肿瘤细胞，如Rajf ，Dandi或自体肿瘤细胞。常采用同位素法如51 Cr 释放试验、发光免疫测定法及MTT，比色法等。本节介绍MTT比色法。
(1)用含IL-2的20% NCS-RPMI-1640调整LAK细胞或TIL浓度至1.5×106/ml。
(2) LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1：1~20的比例分别取100ul接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。设不同浓度效应细胞200ul/孔单独培养，测定效应细胞的吸光度。同时将不同的白血病细胞株分别用20% NCS-RPMI-1640培养液调整至3 ×104一1×105/ml，取100ul 细胞悬液和100ul培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度。
(3)将上述接种好的细胞培养板置37℃，CO2温箱孵育20h，其余步骤同IL-2生物活性测定。
(4)细胞毒性百分率(%)按下列公式计算
ODE + T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值
ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值
ODT=相应浓度单独靶细胞的OD
三、小鼠造血干细胞/祖细胞免疫磁性分离操作步骤：
1) 取小鼠骨髓用BD染色液制成约2×108单细胞悬液
2) 阻断：加入Ms Fc BlockTM置冰上15min,0.25mg/106细胞
3) 加入Lineage Panel中biotin-mAb, 每种2ml/ 106细胞,冰上15min
4) IMag buffer洗涤, 加Streptavidin磁珠, 5ml/ 106细胞, 6-12℃ 30min
5) 放入磁场中8min, 将上清小心吸出、收集
6) 试管移出磁场, 加buffer重悬阳性片断, 反复吹吸后放入磁场8min
7) 小心吸出上清，一并收集
8) 重复上两步操作
收集的上清中即为通过阴性分离法得到的造血干/祖细胞
四、IL-2生物学活性检测（MTT）
（一）原理
白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。
（二）材料
（1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。
（2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4℃避光保存。
（3）IL-2标准品。
（4）PHA（200ug/ml）。
（三）方法
（1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：
①人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml
加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5% CO2孵育48小时。
③回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。
（2）IL-2生物活性测定
①CTLL-2细胞制备：取传代培养24～48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。
②加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100ul细胞+100ul培养液）。37℃，5% CO2孵育40小时。
③MTT掺入：轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5% CO2孵育2小时。
④测定：离心培养板，2000r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100ulDMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值（A）。
⑤计算：用标准品浓度和对应的净A570nm值（实验孔-阴性对照孔的A570nm值）绘制标准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。
（四）关键点
（1）CTLL-2细胞存活率应大于95%。
（2）因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，最好采用抗IL-4mAb吸附剂除去IL-4。
五、IL-8生物学活性检测
（一）原理
IL-8对中性粒细胞具有激活和趋化作用，通过检测中性粒细胞的迁移距离可以确定IL-8的生物学活性，即对中性粒细胞的趋化活性。
（二）材料
（1） 6%右旋糖酐生理盐水溶液。
（2）淋巴细胞分层液比重为1.077+（-）0.001。
（3） 2%琼脂糖：称取2g琼脂糖，加入到100ml蒸馏水中，煮沸溶解。
（4） 0.1%白明胶H ank’s液。
（5） DMEM培养液（2×浓缩），内含20%FCS和0.75mg/mlNa2CO3溶液。
（6）甲醇溶液、Wright-Giemsa染液。
（7）洁净载玻片。
（8）打孔器，直径为3mm。
（三）方法
（1）IL-8的诱生
①常规分离PBMC，洗涤后，调细胞浓度为5×106/ml。
②将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。
③加诱生剂LPS（20ug/ml），每孔0.5ml，37度，5% CO2孵育48h。
④离心收集细胞培养上清液，用HCl溶液调为酸性（PH4.0），经SephadxG-75柱分离，收集活性组分即为待测的IL-8粗品。
（2）IL-8的生物活性检测
①琼脂板的制备；取溶化后50度左右保温的2%琼脂糖与等体积50度水浴预温的DMEM培养液（2×浓缩），混合，取3ml加到洁净的载玻片上，铺成薄层，室温凝固后，放4度，进一步凝固30～60分钟，红打孔器打孔。
②中性粒细胞制备：常规分离人外周血中性粒细胞。
③加样：取10ul中性粒细胞悬液加入琼脂板各组中心孔，分别取10ul待检样品及阳性对照品加入样品孔，取10ulDMEM培养液加入对照孔；将玻片置于湿盒内，37度温育2小时。
④染色：用甲醇溶液固定30分钟，用瑞氏染液染片并干燥。
⑤检测：显微镜下分别测量细胞从中心孔向样品孔游走的距离（趋化游走距离）及向阳性对照孔的游走距离（自发游走距离），趋化活性以趋化指数表示。
趋化指数=趋化游走距离/自发游走距离
（四）关键点为确认待检样品中IL-8的特异性趋化效应，最好同时比较抗IL-8抗体与待测样品作用后的趋化结果
六、调节性T细胞（Treg）及其流式检测方法
Treg细胞概述
高效免疫抑制剂的发现及其联合应用使临床器官移植的急性排斥反应大大
降低，移植物的存活时间明显延长；器官移植成为挽救终末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途径。但是免疫抑制剂具有明显的毒副作用(如对重要脏器的损伤、降低抗肿瘤及抗感染免疫力等)及对治疗慢性排斥反应效果较差等问题，均限制了免疫抑制剂的长期应用。因此，相关生命科学工作者尝试通过诱导移植免疫耐受途径来避免免疫抑制剂的长期应用及克服移植免疫排斥反应。
在上个世纪九十年代中期，由Sakaguchi等首先证实了天然CD4 CD25 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)为一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周CD4+T细胞的5～10%。该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答／免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。
2、Treg细胞的来源
研究证实，天然的CD4 +CD25+Treg细胞来源于胸腺，小鼠出生后第3天切除胸腺，外周缺乏CD4+ CD25+Treg细胞，产生抗自身抗体并出现自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。而在第0天和第7天切除胸腺，并不表现自身免疫性疾病。这说明出生3d内是胸腺产生CD4+CD25+Treg细胞的关键时期，这时切除胸腺引起自身反应性CD4+T细胞的过度增殖。但是，出生第0天胸腺产生的自身反应性CD4+T细胞不足，出生第7天胸腺已经产生了足够的CD4+CD25+Treg细胞，所以这时切除胸腺，小鼠不出现自身免疫性疾病。Papiernik等证实，CD4+CD25+Treg 细胞产生于胸腺，然后迁移到外周发挥作用，CD4+CD25 胸腺细胞与外周的
CD4+CD25+Treg细胞一样，表现对经由TCR的抗原刺激呈低反应性，并且显示抑制其他T 细胞增殖的能力。CD4+CD25+ Treg细胞的产生需要TCR与胸腺皮质上皮细胞的MHC II类分子间的高亲和力作用，MHC II类分子缺陷的小鼠缺乏
CD4+CD25+Treg细胞。CD4+CD25+T细胞除了在胸腺产生以外，还可以在未成熟的树突状细胞、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低剂量抗原诱导下由外周CD4+CD25-细胞转变而来，该类细胞称为诱导的CD4+CD25+Treg细胞。
3、Treg细胞的常用的分子标记
①CD25：Treg细胞调节机体免疫系统平衡，增加免疫耐受。研究表明，多种T 细胞分子抗原参与Treg细胞的特异性功能效应。传统鉴定Treg细胞主要是通过CD4和CD25来标记。但随着研究的进一步深入，发觉只通过CD4+CD25+双阳性来定义的Treg细胞并不完全准确②FOXP3： FOX(forkhead box)是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子大家族，通常和细胞生长发育的调控有关。FOX 家族成员都有一个叉头样结构域，能与DNA结合。FOXP3是叉头样转录因子家族中的成员，2001年由Brunkow等首次报道。研究发现，它的表达及功能与调节性T细胞(regulatory T cells，TR细胞)密切相关。如果FOXP3基因发生突变，将影响TR细胞的发育成熟，导致IPEX综合征(immune dysregulation，polyendocrinop -athy，enteropathy，X linked syndrome)。 FOXP3主要表达于胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴器官和组织。在小鼠特异性表达于CD4+CD25+T细胞，而不表达于CD8+T细胞。在人类FOXP3不仅可表达于
CD4+CD25+T细胞，还可表达于CD8+CD28-T细胞。但在CD4+T细胞中的表达明显高于CD8+T细胞。目前，Foxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公认的Treg 细胞的最敏感的标志。
③CD127：最近发现通过表达CD4， CD25和传导信号FoxP3来定义调节性T 细胞时，在一类特殊的细胞群体时会出现问题。我们发现IL-7受体（CD127）在外周血CD4+T的一个亚群中会下调表达。我们证实这些细胞FoxP3阳性，且这群细胞包括那些CD25弱阳性或阴性群体。联合使用CD4，CD25和CD127可得到高纯度的调节性T细胞，比以前的通过其他标志物来区分方法显著提高。这些细胞在功能抑制实验中可发挥高度抑制功能。实际上，通过CD4和CD127表达来区分的细胞数量（包括CD25+CD4+和CD25-CD4+）三倍于通过CD4+CD25hi区分的调节性T细胞亚群。最后，我们使用CD127定量检测I型糖尿病病人调节性T细胞，发现CD127可作为人调节性T细胞的标志物。
4、FOXP3流式检测方法
美国eBioscience公司是最早拥有FOXP3流式检测抗体的公司之一，公司通过不断改进和优化，建立了一套完美的针对FOXP3流式检测特殊的试剂和方案。（1）实验材料
实验设备
1)流式上样管
2)混匀振荡器
3)离心机
4)移液器、Tips
5)流式细胞仪
所需试剂
1)细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂（CD4、CD25或CD8等）
2)FOXP3荧光标记抗体
3)溶血素：（eBioscience目录号00-4333）用于裂解红细胞
淋巴细胞分离液：若样品为人的全血，建议先用分离液分离出单个核细胞后再做后续检测
5)固定剂和破膜剂：（eBioscience FOXP3检测专用试剂，目录号为00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，将其中的Fixation/Perme -abilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存时间不要超过一天）
6)其他试剂：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabil -ization Buffer（Cat.No 00-8333）等
（2）实验操作步骤
注：对于不同的FOXP3克隆号抗体，在操作上可能存在着一些细微的差别。具体实验时，请参考相应的抗体说明书上的操作步骤。此操作以人Foxp3 (clone PCH101, cat. XX-4776).为例。
1)在每个流式上样管中加入100ul准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个。
2)按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原（如CD4、CD8、CD25等）。
3)用预冷的Flow Cytometry Staining Buffer或预冷的PBS洗涤细胞。
4)旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液
（Fixation/Permeabilization），并再次旋涡混匀。
5)避光4℃孵育30-60分钟。
6)加入2ml Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。
7)重复第5步操作洗涤细胞。
8)[可选]加入稀释好的2%（2ul）的正常大鼠血清（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释）100ul，在避光4℃孵育15分钟
9)封闭液无需洗去，直接加入稀释好的荧光标记FOXP3抗体（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释）20ul，避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。
10)加入2ml Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。
11)重复上一步洗涤细胞。
12)用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。
MTT方法测定脾淋巴细胞转化(20070727)
MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验 1.实验步骤： 1.1.调整淋巴细胞浓度： a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min； b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将 脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研 钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料 离心管； c)离心1500rpm, 5min； d)用Hank’s液洗2次； e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀 后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡； f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。（假定4个大方格内总数为N，则 该细胞悬液的浓度为n=105*N） 1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。以 100μl/孔加入96孔细胞培养板中。（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。不同品种的动物也有一定的不同。 1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防 止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。 1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。每过24小时需取 出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。 1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。 1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去 细胞培养液，纸巾吸干。加入DMSO，150ul/孔。充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解） 1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT） （一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。 （二）材料： MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原 （三）方法： 1、脾细胞制备： （1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； （2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏； （3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中； （4）制备脾细胞悬液 ①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。调整细胞浓度为 5 105/ml。 ②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入
T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项
淋巴增殖实验: 第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下 ⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀; (2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀; ⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次; (4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min; (5)悬于1mL DMEM 中; (6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的Con A,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d; (7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。 取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法 1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。 2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50μl含20μg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。向每孔中加入淋巴细胞悬液50μl，培养物总体积为100μl，细胞终浓度为 0.5×107/m1，Con A 终浓度为10μg/m1，设 3 重复孔。细胞置 40℃、％CO2、饱和湿度条件下培养 21h。每孔加 5mg/m1MTT 溶液10μl，继续培养3h 后，加入100μl DMSO溶液，置于37℃培养箱恒温作用 15min，取出后用酶联免疫检测仪检测，以空白对照孔调零，检测 590nm 波长下的吸光度值（A590nm），结果以 3 重复孔平均值表示。 3. 外周血液 B 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板中每孔加入50μl 含10μg/m1LPS 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液50μl，设 3 重复孔。每孔中
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征
淋转试验
淋巴细胞转化试验 （一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。 （二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原 （三）方法： 2、淋巴细胞增殖反应：将5×105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5％CO2，37℃培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。37℃培养4-6小时。 4. 1000g 离心10分钟弃上清，各孔内加入150μl DMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜。，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇100ul）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。 实验结果将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。 注意事项（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果
猪淋巴细胞转化实验
猪淋巴细胞转化实验 1.采集抗凝血每个10ml注射器吸入100ul肝素钠抗凝剂（20mg/ml），每个样品无菌采血5-8ml。（保存在4°环境，从猪场回来最好放在冰盒中） 2、淋巴细胞分离，采集的肝素抗凝外周血液（肝素用量20U/mL），可采用以下方法进行分离。 （1）Ficoll-Comray （聚蔗糖——泛影钠）分离淋巴细胞法： 用10毫升的试管，加入4毫升淋巴细胞分离液（比重介于1.0-1.090之间），在这种分层液的界面上，轻轻加入4毫升左右肝素化的血液，千万不要打乱两液间的液面。然后用1500rpm，离心15分钟。此时即可见到液体分为四层。最下层是红细胞和粒细胞，分层液在它的上层，最上层是血浆层。淋巴细胞在血浆层和分层液之间，淋巴细胞多时，可呈现一层乳白层。用移液器直接插入淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞1.5mlEP管中，充分混匀，2000rpm离心10分钟，弃去上清，即获得纯淋巴细胞，可加入适量HanK’S液进行计数，应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。 （2）红细胞裂解法 用10毫升的试管加入8ml的Tris-MH4C1红细胞裂解液，然后加入2-4ml抗凝血，室温放置20min（每各5min上下缓慢摇匀一次），后1500rpm离心10min，弃掉上清，用HanK’S液混悬细胞进行计数（如果红细胞很多，可以再用5ml裂解液裂解一次）。应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。 3.流式细胞仪检测CD3/CD4/CD8步骤 待血液样品和灌注液样品都计数完毕后，吸取一定体积含有106的细胞悬液，1500rmp离心 3min，弃掉上清液，加入用PBS混匀的含有CD3/CD4/CD8混合抗体的反应液80ul，混匀后4℃反应30min。 待反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入0.5ml含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。 加入0.5ml含有4%多聚甲醛的PBS，4℃反应30min。 反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入0.5ml含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。 （最多4℃再用不含胎牛血清的PBS液洗涤一次，最后用200ulPBS液重悬细胞进行上机检测。 放置过夜） 4.MTT实验步骤 1）接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul. 2:培养细胞：每个样品设置10个重复孔，其中5个孔加入10ul ConA(孔中终浓度5ug/ml),另外5个孔加入10ul培养液，同一般培养条件，培养68h，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS
淋巴细胞功能测定
免疫学技术原理与应用 PAIT-12 淋巴细胞功能测定 孙汭 中国科技大学生命科学学院 免疫学研究所
PMIT-12 淋巴细胞功能测定 一、常用的淋巴细胞功能测定 二、T淋巴细胞功能测定 三、B淋巴细胞功能测定 四、NK细胞细胞毒试验 一、常用的淋巴细胞功能测定 1、淋巴细胞增殖试验 ① 3H-TdR掺入法 原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细胞DNA合成大量增多。此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside, 3H-TdR), 使3H-TdR掺入新合成的DNA中，经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 的3H-TdR掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。 ② MTT比色法 原理：MTT（（3-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝色的甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。甲攒经异丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD值，可反映细胞增殖水平。 2、细胞毒试验 ①51Cr释放法 原理：用放射性核素51Cr（Na251-CrO4，鉻酸钠）标记靶细胞，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合。然后将51Cr标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后，若待检细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞释放出来。51Cr的释放量与效应细胞的活性成正相关。即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离51Cr越多，用γ计数仪测定上清中51Cr的放射活性（cpm）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。 （一）、用51Cr铬酸钠标记靶细胞 1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。 2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。 3．离心200×g 10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。 （二）、4小时51Cr释放实验 1．在96孔圆底细胞培养板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。
混合淋巴细胞培养试验
混合淋巴细胞培养试验 文章目录*一、混合淋巴细胞培养试验的基本信息1. 定义2. 专科分类3. 检查分类4. 适用性别5. 是否空腹*二、混合淋巴细胞培养试验的正常值和临床意义1. 正常值2. 临床意义*三、混合淋巴细胞培养试验的检查过程及注意事项1. 检查过程2. 注意事项*四、混合淋巴细胞培养试验的相关疾病和症状1. 相关疾病2. 相关症状*五、混合淋巴细胞培养试验的不适宜人群和不良反应1. 不适宜人群2. 不良反应 混合淋巴细胞培养试验的基本信息 1、定义混合淋巴细胞培养试验(mixedlymphocyteculture,MLC)是一种测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容程度的试验方法,常用于器官移植前的组织配型。混合淋巴细胞培养将供者与受者的淋巴细胞做双向混合培养,或者灭活供者的淋巴细胞做向混合培养,细胞反应的程度与供-受者相容的程度呈负相关的试验。 2、专科分类生长发育检查 3、检查分类免疫检查 4、适用性别男女均适用
5、是否空腹非空腹 混合淋巴细胞培养试验的正常值和临床意义 1、正常值形态计数法: 转化率10%;同位素计数法:比较cpm 得出P0.05。 2、临床意义混合淋巴细胞培养试验为与供-受者相容的程度呈负相关的试验。异常结果:肾移植时,活体供肾者的转化率应10%;尸体供肾者的转化率应为10%。只能在同一批实验中选用低反应配组。淋巴细胞转化率10%者为不同两个体间的组织是相容的。淋巴细胞混合培养试验用以检测患者的免疫状态。T淋巴细胞数减少时,转化率也降低。可作为器官和骨髓移植的配型方法之一,用来选择合适的供体。如转化率高为供受者分歧用。转化率低,移植后的成功率高。 混合淋巴细胞培养试验的检查过程及注意事项 1、检查过程供体淋巴细胞的制备: 新鲜外周静脉血按1∶1比例加在装有比重为1.077的淋巴细胞分离液的离心管中,轻稳加在液面上。 2000 r/min离心20 min,吸取中间雾状淋巴细胞层。生理盐水洗涤2次。台盼蓝染色,计数板计数。调整细胞密度为2×109/L,分成3管,各自离
T淋巴细胞转化试验
T淋巴细胞转化试验 （T lynrphocyte transformation test） 正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中，受到特异性抗原或有丝分裂原（植物血凝素或刀豆素等）刺激，细胞的代谢和形态可发生一系列变化。主要表现为电荷的改变，细胞内蛋白质和核酸合成增加，及以细胞形态可转化为淋巴母细胞。为此，在体外利用各种刺激剂激发淋巴细胞，根据其转化程度可测定T淋巴细胞的应答功能。这类方法称为淋巴细胞转化试验（lymphocyte leansformstoin test）简称淋转试验，在临床上现已作为测定人体细胞免疫功能的指标之一。细胞免疫缺陷时，这种转化功能也降低。目前最常用植物血凝素（PHA）作为分裂原来检测淋巴细胞转化功能，称PHA刺激淋巴细胞转化试验。 体外引起T淋巴细胞转化的刺激物种类颇多，大致有以下几类： （1）非特异抗原刺激物，如从豆类中提了的植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）等，通称为促有丝分裂素（mitogen）。 （2）特异性抗原刺激物，如结核菌纯化蛋白衍生物（purifeg protein derivative 简称PPD）等。 （3）组织抗原和抗血清，如同种白细胞，抗淋巴细胞血清等。 上述各种刺激物中以PHA应用最广，在体外淋巴细胞培养中，可使正常人外周血液中T淋巴细胞几乎均起转化，其所引起的淋巴细胞转化率大大超过特异性抗原的作用。但这种反应与机体是否致敏无关，因此是属于非特异性的淋转试验。特异性抗原仅能使相应抗原致敏的淋巴细胞发生转化，转化率一般在5-30%左右。虽然T淋巴细胞对非特异性和特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，所发生的分裂和增殖反应却是相同的。因此根据PHA激活T淋巴细胞分列增殖反应的程度，可以推测T淋巴细胞识别特特异性抗原后的增植反应。从而利用PHA 刺激淋巴细胞转化试验一项非常特异性体外免疫学检测指标，在一定程度上可作为刺激原，因此一般称为PHA 淋巴细胞转化试验。 PHA淋转试验有形态计数法和同位素计数法两种，前者测定转化的淋巴母细胞百分率，后者测定放射性同位素标记的DNA前身掺入细胞合成DNA的量。 形态计数法的优点是不需要特殊设备，便于一般实验室采用，但判读结果主观因素影响较大，而且有相当数量的中等大小的淋巴细胞难于分类。此外，在培养过程中单核细胞相对增大，形成似转化的淋巴细胞，容易造成误计。加上此法的测定效率低，重现性较差，有被同位素掺入法取代的趋向，但要了解被激活淋巴细胞的比例和形态改变，则仍需应用形态观察法。 淋巴细胞转化试验的操作方法主要有两种： 1、形态学方法：加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数； 2、3H—胸腺嘧啶核苷掺入法：加分裂原共同培养结束前一定时间，加3H标记的胸腺嘧啶核苷，培养后测定镊入细胞内的放射性物质的相对数量，以间接了发转化程度。 形态学方法比较简单易行，不需特殊设备，但重复性和客观性较差；3H掺入法结果客观，准确性好，重复性好，但需要一定设备条件。 PHA淋转试验形态学检查法 一、目的： 1、了解本技术的原理。 2、掌握操作方法。 3、学会分辨几类细胞形态学上的特点。 二、原理： 将人外周血液或分离的白细胞和PHA混合进行体外培养数日后取培养细胞作涂片染色镜检，可见大部分淋巴细胞转化为体积较大的淋巴母细胞，细胞核内生成核仁，并有部分细胞发生分裂现象。由于PHA只激发T淋巴细胞转化，为此计数200个淋巴细胞，可计算出转化细胞的百分离，即得淋巴细胞转化率（简称转化率）。 在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60-80%，50-60%则偏低，50%下则降低。 三、试验材料： 1、PHA溶液：PHA有粗制品两种。粗制品是含多糖的蛋白质成分，各为PHA-M。精制品为纯蛋白成分，名为PHA—P。国内虽有少数精制的PHA产品，但仍有待试剂标准化。 目前国内在临床检验中作淋转试验所用PHA一般均为粗制品，没有质量标准。原料来源不同，制备条件差异均可影响产品的活力。即使属于同一单位供应，各批产品的活力亦不相同。虽可参照说明书而决定其用量，按下述正式试验方法检测同一标本。如PHA加入量过多，对细胞有毒性；加入量少，不足以刺激淋巴细胞转化，一般最适浓度为50-200Ug/mL。 PHA粗制品亦可按下法自制：将广东红花云豆（Phaseolus Vulgaris）研磨成粉末，取10g粉末加生理盐水100ml，放置4℃冰箱浸泡48小时，每隔数小时稍加搅拌。取出后用滤纸过滤或在4℃离心（2，500转/分）30