细胞凋亡试验常用的方法

细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法）

（一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法：

用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。

次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。

培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。

用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率

抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。

（二）荧光法：

选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。

弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。

（三）DNA琼脂糖凝胶电泳法：

1、DNA提取：

用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。

分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。

于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。

冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。

吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。

吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。

再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。

加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。

2、琼脂糖凝胶电泳：

TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。

待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。

取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。

60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。

（四）透射电镜形态学观察法：

收集药物作用后最佳凋亡时期的凋亡肿瘤细胞，细胞总量大于10^6个，用PBS洗2遍后用3%戊二醛固定1h，PBS洗2次，再用1%锇酸固定1h，丙酮酸梯度脱水。

细胞用树脂包埋，并进行超薄切片，用醋酸钠-枸橼酸铅染色，透射电镜下观察凋亡的细胞形态，可见有染色质浓集，不均匀分布，考核周边形成有核膜包裹的断裂核碎片，呈新月形凋亡小体，并选择典型切片图像摄影。

（五）流式细胞仪检测法：

1、原理：

处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相其DNA含量分布在2n-4n之间，发生凋亡的细胞内与核内DNA裂解成许多小片断，用细胞膜通透法可使小分子量的DNA片断穿过薄膜而丢失，仅剩下大分子量DNA片断，这些失去部分DNA的细胞可形成一个DNA 含量小于2n的分布区，称“亚G1峰”，即AO峰（凋亡峰）。

2.特点：

经济简便，仅需单一染色。

可判断凋亡细胞发生于哪一周期。

可定量测定凋亡率，结果客观可信。

用同样本可同时进行“亚G1峰”测定及DNA凝胶电泳。

3、方法步骤：

收货不同剂量药物作用于各不同时期的肿瘤细胞，细胞总数应大于10^6个，用PBS洗2次，加入70%酒精固定，4℃存放。

染色前用PBS离心沉淀去除固定液，并用PBS洗1-2次，加入200ulRNA酶，37℃水浴30min。

每毫升细胞悬液中加入碘化丙锭（PI）染液100ul混匀，置4℃避光30min，用流式细胞仪进行细胞周期分析，低于G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。测定“亚G1峰”值和细胞凋亡率。

除上述常用的方法外，还可采用

ELISA法。其凋亡的断裂核可与抗组蛋白抗体及抗DNA抗体混合物反应后形成双抗体“夹心”结构，再经酶显色也可判断。

末端转移的酶标记技术，利用核裂解碎片含有3/-OH的末端，在末端转移酶作用下加入已标记的核苷酸，在3/-OH末端上合成一段含标记的尾巴，再经酶显色或用荧光抗体显示出来。