高密度培养
高密度培养
应用领域为生物制药，其代表为人生长激素。现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。基本信息
中文名高密度培养
发展基础基因工程菌生产多肽类药物
应用领域生物制药
代表人生长激素
技术介绍
现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌（尤其是 E.coli）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。例如，人生长激素、胰岛素、白细胞介素类和人干扰素等。
具体方法
（1）选取最佳培养基成分和各成分含量。
（2）补料，这是工程菌高密度培养的重要手段之一。
（3）提高溶解氧的浓度，提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。
（4）防止有害代谢产物的生成。
高密度培养过程中培养基成份及作用：
根据微生物对营养的要求，培养基包括水分、碳源、氮源、无机元素和生长素等五大类物质，此外还应有一定的酸碱度和渗透压。一般来讲，不同种类的微生物对培养基的要求是不同的，甚至同一种类的微生物在不同的生长阶段及使用目的时，对培养基的要求也不完全相同。有三种类型的培养基：合成培养基、复合培养基和半合成培养基。当营养物浓度可知并且在培养过程中可控制，合成培养基通常用于获得高细胞密度。在复合培养基中的营养物，比如蛋白胨和酵母粗提物，可以在成分和质量上有所变化，这使得用复合培养基的发酵可重复性低。然而。半合成或复合培养基有时对于促进产物形成是必需的，即在合成培养基中加入少量酵母粉、蛋白胨等，以及少量无机盐和氨基酸有助于菌体的生长及产物的形成。
碳源
Escherichiacoli可以利用葡萄糖、乙醇、甘油、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间适应，就能利用乳糖作为碳源。还原型的碳化合物常用于构建细胞和形成产物。除了葡萄糖，也可采用一些其他天然有机化合物做为碳源，用于生长和生产。培养基中的碳源浓度相当重要。如培养基中碳源含量超过5%，细菌的生长因细胞脱水而开始下降。使用不同的碳源对菌体生长及外源基因表达有影响。葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但甘油的菌体得率较小，而葡萄糖所产生的副产物较多。用甘露
糖作碳源时，不产生乙酸，但比生长率和呼吸强度较小。对tac启动子的表达系统，使用乳糖作碳源较有利，乳糖同时起诱导作用，葡萄糖对lac启动子有抑制作用，原因有：(1)降低胞内cAMP水平，(2)诱导物排外作用。采用流加措施，控制培养液中葡萄糖浓度在低水平，可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。
氮源
氮源的作用主要是提供氨基酸、蛋白质、核酸等合成所需的元素氮，氮源可分为有机氮源和无机氮源，有机氮源主要是一些含氮有机物的水解产物，含有丰富的氨基酸、小肽和其他营养物，其中的氨基酸和其它一些小分子有机物可被工程菌直接利用，而不需要再从糖代谢的中间代谢产物合成了，因而对工程菌的生长和外源蛋白的合成都有利，在工程菌培养中被广泛使用，但有机氮一般价格较高，而且，工程菌对有机氮源中各成分的利用是不均衡的，因而过量使用会使某些成分发生积累，产生抑制作用或影响后续纯化工作。常用的有机氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆等。无机氮源主要是一些含有氮的化合物，如氨水、铵盐等。无机氮源的优点是价格低廉且成分确定，易于按需补加。其中氨水在工程菌培养过程中还可同时起到调节pH的作用。
无机盐和维生素
工程菌培养基中所需的无机盐主要为磷酸盐、Mg、Fe、Ca和一些微量元素如S、Zn、Co、Cu、Mn、Ni等的盐类，其作用是提供菌体生长所需的各种元素，同时还有维持渗透压和控制pH的作用。大多数工程菌都能合成所需的各种维生素，可以在不含有维生素的培养基中生长，但在培养基中含适量的维生素往往对菌体的生长是有利的，而有些工程菌的宿主菌为维生素营养缺陷型，这些菌的培养基中必需含相应的维生素。酵母提取物、玉米浆等有机氮源中含有丰富的无机盐和维生素，因而当培养基中含有较高浓度的上述成分，且菌密度较低时，除加入20-100mmol/L的磷酸盐用于维持pH和渗透压外，不需另外补加无机盐和维生素。但当培养基中不含有机氮源或培养的菌密度较高时，则应考虑补加无机盐和维生素。
对一个合适的发酵培养基，上述各成分的量应以满足或略多于菌体生长和产物合成所需为度，不宜过多加入，以免产生抑制效应和浪费原料，另外各成分的配比也很重要，以利于菌体均衡利用各成分。表1.1为基本培养基中一些主要营养元素的得率系数，表1.2为一些营养成分产生抑制效应的浓度。但对每个工程菌，其发酵培养基最终应通过实验筛选。
任何发酵培养基的优化是一个高强度劳动的过程，需要实验大量的营养化合物种类及其浓度。工程菌高密度培养基设计原理如下：（1）使用基本培养基以便精确设计营养成分之间的定量关系，同时避免任何不利于细菌生长的营养限制性因素；（2）利用碳源限制的方法直接阻断细菌对数生长期间抑制性代谢产物的合成；（3）依据细菌细胞的元素组成确定培养基各成分的精确配比。培养基中的碳氮比（C/N）是相当重要的，如果碳氮比偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶；如果碳氮比偏大，菌体则会生长缓慢，产率下降。即使碳氮比合适，浓度的大小也会影响菌体的生长。
高密度培养
高密度培养 应用领域为生物制药，其代表为人生长激素。现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。基本信息 中文名高密度培养 发展基础基因工程菌生产多肽类药物 应用领域生物制药 代表人生长激素 技术介绍 现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌（尤其是 E.coli）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。例如，人生长激素、胰岛素、白细胞介素类和人干扰素等。 具体方法 （1）选取最佳培养基成分和各成分含量。 （2）补料，这是工程菌高密度培养的重要手段之一。 （3）提高溶解氧的浓度，提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。 （4）防止有害代谢产物的生成。 高密度培养过程中培养基成份及作用： 根据微生物对营养的要求，培养基包括水分、碳源、氮源、无机元素和生长素等五大类物质，此外还应有一定的酸碱度和渗透压。一般来讲，不同种类的微生物对培养基的要求是不同的，甚至同一种类的微生物在不同的生长阶段及使用目的时，对培养基的要求也不完全相同。有三种类型的培养基：合成培养基、复合培养基和半合成培养基。当营养物浓度可知并且在培养过程中可控制，合成培养基通常用于获得高细胞密度。在复合培养基中的营养物，比如蛋白胨和酵母粗提物，可以在成分和质量上有所变化，这使得用复合培养基的发酵可重复性低。然而。半合成或复合培养基有时对于促进产物形成是必需的，即在合成培养基中加入少量酵母粉、蛋白胨等，以及少量无机盐和氨基酸有助于菌体的生长及产物的形成。 碳源 Escherichiacoli可以利用葡萄糖、乙醇、甘油、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间适应，就能利用乳糖作为碳源。还原型的碳化合物常用于构建细胞和形成产物。除了葡萄糖，也可采用一些其他天然有机化合物做为碳源，用于生长和生产。培养基中的碳源浓度相当重要。如培养基中碳源含量超过5%，细菌的生长因细胞脱水而开始下降。使用不同的碳源对菌体生长及外源基因表达有影响。葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但甘油的菌体得率较小，而葡萄糖所产生的副产物较多。用甘露
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】 实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 1．实验目的 （1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。 （2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。 2．实验原理 重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。 工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。 补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。 高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。此外，还需要考虑通风速度和搅
用于摇瓶高密度培养的自诱导培养基
12/20/07 Recipes and stock solutions described in Protein Expression and Purification 41: 207-234 (2005) Protein Production by Auto-Induction in High-Density Shaking Cultures F. William Studier Biology Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY 11973 studier@https://www.360docs.net/doc/081850093.html, Abstract. Inducible expression systems in which T7 RNA polymerase transcribes coding sequences cloned under control of a T7lac promoter efficiently produce a wide variety of proteins in Escherichia coli. Investigation of factors that affect stability, growth and induction of T7 expression strains in shaking vessels led to the recognition that sporadic, unintended induction of expression in complex media, previously reported by others, is almost certainly caused by small amounts of lactose. Glucose prevents induction by lactose by well-studied mechanisms. Amino acids also inhibit induction by lactose during log-phase growth, and high rates of aeration inhibit induction at low lactose concentrations. These observations, and metabolic balancing of pH, allowed development of reliable non-inducing and auto-inducing media in which batch cultures grow to high densities. Expression strains grown to saturation in non-inducing media retain plasmids and remain fully viable for weeks in the refrigerator, making it easy to prepare many freezer stocks in parallel and use working stocks for an extended period. Auto-induction allows efficient screening of many clones in parallel for expression and solubility, as cultures have only to be inoculated and grown to saturation, and yields of target protein are typically several-fold higher than obtained by conventional IPTG induction. Auto- inducing media have been developed for labeling proteins with selenomethionine, 15N or 13C, and for production of target proteins by arabinose induction of T7 RNA polymerase from the pBAD promoter in BL21-AI. Selenomethionine labeling was equally efficient in the commonly used methionine auxotroph B834(DE3) (found to be metE) or the prototroph BL21(DE3). overview 2-5 General Non-inducing agar plates and stabs for expression strains 6 Non-inducing media currently used routinely for growing stocks 7 Auto-inducing media currently used routinely 8 Media with arabinose for auto-induction from T7lac in BL21-AI 8 12, 9, 14 minimal media Auto-inducing Medium for rapid growth of high-density cultures to prepare plasmids 9 Auto-inducing media for labeling with SeMet 10 Auto-inducing media for labeling with 15N and 13C 11 Low-phosphate (25 mM) non-inducing and auto-inducing media 12 High-phosphate (100 mM) non-inducing and auto-inducing media 13-14 solutions 15-20 Stock
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养 定义一[1] 高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。单位：细胞干重/升（DCW/L）。凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养，，一般认为其上限值为150～200g （DWC/L），下限值为20～30g（DCW/L）。 定义二[2] 细胞高密度培养(high cell density culture，HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在细胞生物反应器中高密度生长，使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上，最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的，用于发酵生产生物制品的技术。 用途[1] 各种微生物（乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等）的生产中，改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，增加单位体积培养液中菌体的数量，提高生产效率，加速微生物制剂的商品化进程。 发展状况[2] 细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节，是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素，也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。随着市场需求的日益扩大，高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中，它不仅可以改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题，只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进，科学系统地运用，才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。 谷胱甘肽(GSH)的生产[3] 谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。本研究室[4～6]近来深入研究了影响面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产GSH的各种重要因素,目前仍在进行有关高菌种选育、发酵过程优化和产物提取的研究工作。构建具有高GSH合成活性的重组E.coli是近十年来GSH 生物合成研究中的一个新方向,其关键在于将分别编码GSHⅠ和GSHⅡ的基因gshⅠ和gshⅡ在宿主菌中高效表达。重组或非重组的S.cerevisiae相比,重组E.coli具有生长速度更快、产物提取更容易等优点。 Murata等[7,8]通过在细胞中扩增gshⅠ和gshⅡ成功地获得了具有较强GSH合成能力的重组E.coli,但没有深入研究高细胞密度培养技术。实际上,与其它胞内重组蛋白一样,GSH的体积生产率通常随着发酵液中的细胞密度增大而增加,故研究生产菌株的高密度培养方法,在保证GSH合成活性的前提下使反应器中工程菌的细胞密度尽可能高,不仅有利于提高生产率,也有利于后提取与纯化的进行。本文报道高密度培养重组大肠杆菌生产GSH的研究结果。 1 材料与方法 1.1 试剂 谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)、还原型辅酶Ⅱ (NADPH)、5′-三磷酸腺苷( ATP)和DTNB (5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid))均为Sigma公司产品。 GSH 和GSSG购自华美生物工程公司。酵母膏为Oxoid产品。葡萄糖购自无锡润生淀粉油脂公司。
高密度住宅大有可为
引言 追溯高层高密度住宅的起源不难发现住宅建筑的高密度化已经成为一个重要问题和今后建设的趋势。高层高密度住宅的出现是人类美好愿望、社会需求、科技进步和经济发展的完美结合。高层高密度住宅的设计及应用必将大有作为。 一、高密度住宅的现实背景 由于城市化速度的不断提升,大量人口不断地流入城市,使城市规模不断扩大,城市空间不得不持续增加,以容纳新增加的居民和提供他们需要的活动场所。扩大城市空间容量,如果让城市向它周围无限制伸展,把原来的近郊地区城市化,就会侵占宝贵的农田。因此,高密度发展的模式是处于高速城市化进程中城市空间现实的、理智的选择。发挥有限的城市土地资源的潜能,作最高效率的利用,是实践科学发展观,建设节约型城市的关键。然而对于任何选择,高密度发展的城市都必须采取一些措施,以实现美好环境和城市景观,最大限度地避免其不利影响。 二、高层高密度住宅的发展历程 （一）国外高层高密度住宅发展历程 19世纪末～20世纪初，西欧工业革命蓬勃兴起，科学技术日新月异。在此大背景下，建筑技术和建筑材料发展迅速，为高层高密度建筑的出现奠定了基础：西方的工业革命不仅促进了科学技术的发展，更推动了近现代社会城市化的进程，乡村人口向城市的迁移，对城市的经济社会发展起到了巨大的推动作用，同时城市人口的大量聚集又加剧了城市住房紧张，并带来一系列城市问题，诸如用地紧张、卫生条件恶化、城市绿地缺乏等。城市居民住房需求日益增大，城市用地日渐匮乏，城市面貌要求改善更新，必然导致城市住宅向高空发展或向郊外扩展。20世纪初叶，欧美国家正处于城市化初期，由于交通不便，大量的产业工人居住在工厂附近以及市区低层高密度的住宅区内，通风较差、卫生条件恶劣、绿化空间稀少，损害了城市的公共安全和城市形象。为了应对这种情况，高层高密度住宅有效提高单位面积土地上的居住人口，成为西方国家解决城市发展矛盾的一种普遍选择。 （二）中国高层高密度住宅发展历程 我国高层高密度住宅的发展同样也遵循城市发展的规律，经历了一个渐进式发展的过程，并与我国社会、经济、科技的发展密切相关。早在20世纪30年代，上海作为远东最繁华的城市之一，率先接触到西方建筑思潮，并在城市建设中有所反映。当时一些外国资本家和民族资本家兴建了中国最早的一批高层高密度住宅.20世纪90年代随着城市土地资源的紧张，地价迅速上升，为了在有限的土地上降低单位住宅面积的综合开发成本，建设高层高密度住宅的需求也不断增大。近年来随着国内的经济飞速的发展，城市人口急骤增长，致使城市不断扩大，城市的土地资源有限，从而令建筑的空间更加密集，以来满足新增的人口居住和正常的活动。使高层高密度住宅的迅速发展起来。高密度住宅作为一种特定的建筑形态,为解决我国城市人口居住问题起了积极作用,同时也满足了居民居住空间多样性的需求。 三、高层高密度住宅的特点 （一）发展高层高密度住宅面临的问题 高层住宅是多层住宅建筑向上层空间的变化延伸，其中最主要的特点就是高，并由此对居民生活、城市环境产生了深刻的影响，在发展过程中也面临一系列的问题，有些属于住宅建设的共有问
高密度细胞库建立和灌注培养
一种新的细胞扩大方法 使用高密度细胞库，一次性生物反应器和灌注技术 by Benjamin Wright, Mike Bruninghaus, Mike Vrabel, Jason Walther, Neha Shah, Seul-A Bae,Timothy Johnson, Jin Yin, Weichang Zhou, and Konstantin Konstantinov 一个典型的细胞培养过程从细胞解冻复苏开始，随后通过连续传代培养对细胞进行扩增，可选用的培养设备包括摇瓶、细胞培养转瓶、WAVE波浪袋生物反应器和机械搅拌生物反应器等（1）。当细胞培养体积和细胞密度达到预定标准时，细胞将转入到生物反应器中继续生长并表达产物。这种方法目前还面临着一些挑战。 摇瓶和转瓶是细胞放大培养初期使用的主要设备，这两种设备都需要在超净工作台中手动操作，这种情况下容易出现污染，而且易受操作者失误影响。此外，传统的细胞库保存细胞时，冻存管内细胞数量较少，细胞在放大过程中耗时较长。生产用生物反应器体积非常大，需要许多中间型号的培养设备来将种子细胞按比例放大，这将导致需要更长的放大培养时间，并使情况变得更加复杂。生物反应器接种活细胞密度通常低于× 106cell/mL,接种细胞后需要培养生长5-10天。在细胞生长期内，由于细胞密度达不到标准不能表达产物或产物含量低，这段时间不能产生实用价值。 有研究表明，建立高密度细胞库可以减少细胞放大的步骤并提高细胞放大成功率。Tao et al.等人建立了高密度细胞库，每冻存管中活细胞量达到× 108个，细胞复苏后直接接种到20L的WAVE 波浪袋生物反应器中（2）。这项研究表明，使用高密度细胞库可以减少中间摇瓶放大步骤并且节约9天的细胞扩大培养时间。Heidemann et al. 等人使用高密度细胞库配合几种不同大小的一次性生物反应器对细胞进行放大培养，减少了60–70%的培养时间（3）。 一次性生物反应器相比不锈钢生物反应器具有许多优点，例如灵活性大大增强，节省安装、清洗和灭菌时间，减少资本投资等（4-6）.GE公司的一次性WAVE波浪生物反应器常常用于种子细胞的扩大培养，该种反应器可以大大减少污染风险（通常不需要在层流罩下工作），而且不需要安装、清洗和灭菌等操作（7）。 目前工业化生产中，细胞灌注培养越来越受到人们关注。一些公司已经成功的将细胞灌注培
乳酸菌发酵剂高密度培养的研究
文章编号:1000-9973(2004)05-0017-05 乳酸菌发酵剂高密度培养的研究 熊晓辉,于修 ,熊强,陆利霞 (南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京 210009) 摘要:研究了乳酸菌生长繁殖的环境条件(温度、接种量、起始pH 等)和培养基组成(氮源、碳源、缓冲盐等),优化确定了乳酸菌发酵剂的适宜培养条件为:起始pH 值为6.5,培养温度为37 ,培养基配比为麦芽糖 乳糖(1 1)2%、牛肉膏1.0%、缓冲盐A0.5%、NaCl0.25%、M gSO 40.1%,接种量4%,进一步探索了半连续法进行高密度培养,结合优化的培养条件,可使乳酸菌的液体发酵活菌密度至1.1 1012CFU/mL 。 关键词:乳酸菌;发酵剂;高密度培养中图分类号:TS201.5 文献标识码:A High cell density culture of lactic acid bacteria starter XIONG Xiao hui,Y U Xiu jian,XIO NG Qiang,LU Li Xia (College of Life Science and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China) Abstract:This paper studied on the high cell density culture of L actobacillus sp p .,and discussed the effects of cultural condition (temperature,inoculation capacity and initial pH)and media composition.The optimal culturing conditions were developed ,follow ing:1%maltose,1%lactose,1.0%beef ex tract,0.5%buffer salt A,0.25%sodium chloride,0.1%m agnesium sulfate,pH6.5,4%inoculation capacity.T hen high cell density culture w as explored w ith one semi-continuous w ay and obtained the cells population over 1.1 1012CFU/mL for 16hours based on the optimal condition.Key words:Lactic acid bacteria;starter;hig h cell density culture 乳酸菌是生产发酵乳制品、泡菜、干酪、发酵香肠等传统发酵食品,赋予其特殊质地、风味和口感的重要微生物菌群,而这些传统食品的专用发酵剂的生产和研制将对实现其工业化生产、缩短产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用,也是传统食品的发展方向[1,2]。浓缩发酵剂[1,3,4](特别是冻 干发酵剂)具有活力高、体积小、携带使用方便的特点,可直接用于发酵制品生产,省去扩大培养的复杂操作过程,从而简化产品生产工艺,有利于保持产品质量的稳定,防止菌种的退化和污染。 乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的培养[1,4]。高密 收稿日期:2004-02-25 基金项目:国家862自然科学基金资助项目(2002AA8041) 第5期2004年5月 中国调味品 CHINA CONDIMENT No.5M ay.2004
细胞培养-培养基类型
常用培养基及基本特性 1、RPMI-1640 Medium RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 2、Minimum Essential Medium（MEM） 也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。 3、DMEM-高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。 4、DMEM-低糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。 5、DMEM/F12 DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基（DME/F12medium），作为开发无血清
配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12（1：1）中加入15mMHEPES缓冲液。 6、McCoy’s 5A McCoy’s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。 7、Iscove’s Modified Dulbecco Medium (IMDM) Guilber 和Iscove将Dulbecco’Medium 改良为Iscove’s Medium，用于培养红细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞，LPS刺激的B细胞，骨髓造血细胞，T细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM为营养非常丰富的培养液，因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。 8、M-199 Medium 1950年，Morgan成功研制出具有确定化学成分的细胞培养液，即M-199，主要用于鸡胚成纤维细胞培养。此培养液必须辅以血清才能支持长期培养。M-199可用于培养多种种属来源的细胞，并能培养转染的细胞。
细胞培养常用培养基讲解学习
细胞培养常用培养基
细胞培养常用培养基 高博，苏州大学医学部药学院药理学系 1、R PMI-1640 Medium RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培 养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤 细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 2、M inimum Essential Medium （MEM） 也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha —般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。 3、D MEM-高糖（标准型） 是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养，更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。 4、D MEM-低糖（标准型） 是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。
5、D MEM/F12 DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种 微量元素，和DMEM 以1：1结合，称为DMEM/F12培养基(DME/F12 medium)，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和 DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12 (1：1)中加入15 mM HEPES缓冲液。 6、M cCoy s 5A McCoy s 5A Medium主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种(如骨 髓、皮肤、肺和脾脏等)的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养 外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长 支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。 7、Iscove ' s Modified Dulbecco Medium (IMDM) Guilber 和Iscove将Dulbecco ' Mediu改良为Iscove ' s Medium用于培养红 细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠 和HEPES。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞，LPS 刺激的B细胞，骨髓造血细胞，T细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM为营养非常丰富的培养液，因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养 高密度培养的定义： 高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。 一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。 而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌 高密度培养的优势: 提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等 高密度培养主要限制因素: 固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。 高密度培养的培养基： 高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。 高密度培养的温度： 培养温度随菌种、培养基成分和细胞生长阶段的不同而不同，温度不仅影响发酵液的理化性质，还对外源蛋白的表达和活性有很大的影响。细胞密度较高时，呼吸作用释放大量热量导致发酵液的温度升高，因此发酵设备需要快速有效的降温散热系统。温度还可作为高密度发酵的调控手段。 高密度培养的的温度调控: 目前主要的控温策略是手动调节冷却水的流量.针对不同的发酵过程，罐温控制方式也不相同。大致分为两类（据发酵过程中最适温度是否变化）:定值控制,程序设定控制（例如：自适应PID等） 高密度培养的pH: 发酵体系pH值是发酵液成分与细胞代谢综合作用的结果。C源消耗而产生的有机酸，CO2的溶解，补料的流加，次级代谢产物的积累，菌体自溶裂
细胞培养 细胞传代培养
细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 2. 材料： 2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽 回温。 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤： 3.1. 附着型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉旧培养液。 3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。 3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 oC 作用数分钟，于倒 立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清 之新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。) 3.1. 4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数 次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常 培养条件培养。 3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的 培养瓶中，以正常培养条件培养。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可 能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基 稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。
常见的细胞培养方式
六、常见细胞的培养方式 1885年，W Roux尝试使组织离体培养，被认为是组织细胞培养技术的萌芽；1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术(Cell culture technology)的诞生。细胞培养是指从体内组织取出细胞膜，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。目前细胞培养方式主要 包括以下三种： 6.1 贴壁培养 贴壁培养主要适用于贴壁依赖性细胞．此类需要相互依赖，需贴附于不起化学作用的物质(玻璃或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持，并最终在附着面生长至单层，铺满平面时便会发生接触抑制．大多数 动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一类型，他们需要附着于适量正电荷的 固体或半固体的表面胜仗。 6.2 悬浮培养 来源于血液、淋巴组织的细胞，及许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞等属于悬浮培养型细胞，细胞为非贴壁依赖性细胞，无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖．悬浮培养是大 规模细胞培养的理想方式，可采用类似于微生物的方法进行悬浮培养。 6.3 固定化培养 动物细胞较微生物脆弱，易受剪切力等的影响，而细胞固定化技术可较好的保护细胞免受机械力及环境变 化的影响，提高细胞的耐受力，促使细胞高密度培养，提高目的产物的产率。在传统的固定化酶技术中， 常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。但在动物细胞培养中，一般使用较温和的固 定方法，如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化等，具有剪切力低、传递效果好和抗污染能力强、细胞生长密 度高、产物易于收集和分离纯化等特点． 由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而 对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。 6.3.1 吸附 6.3.1.1 多孔陶瓷 KC.Biologicals公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。通道长30cm，截面积是长方形，约为1mm2，壁厚0.12mm，可提供4.25m2 的生长表面积。这种结构的生物反应器，既可用于培养悬浮生长的细胞，又 可用于培养贴壁依赖性细胞。 6.3.1.2 微载体 传统的贴壁依赖性细胞的培养通过静止或转瓶等培养来获得，操作繁复，且耗费空间及人力．1967年，VanWezel首次提出了“微载体”培养系统，经过几十年的研究改进，微载体培养技术现已广泛应用于动 物细胞的培养，是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法，兼具有平板培养和悬浮培养的有点；能够 使得细胞处在相对均一的环境，温度、pH、CO2等均等得到很好的控制。较传统的单层细胞培养，大大增
塑造高品质城市公共空间 提升城市魅力
塑造高品质城市公共空间提升城市魅力 【摘要】城市公共空间的活力要素包括“空间与尺度”、“可达性与易达性”、“混合使用与密度”、“环境质量”、“公共设施”、“街道家具”和“公共文化活动”。在规划设计中将各要素合理安排，处理好各要素之间的关系，来最大限度的满足使用者的需求，从而提高城市魅力。 【关键词】城市公共空间的活力要素城市魅力 城市公共空间是体现城市风貌与特色的重要场所，是城市的魅力所在。它不但为城市居民日常生活和社会活动提供了开放的空间环境，而且在城市的演变发展过程中扮演着重要的角色，记录着城市历史与文脉的积淀。本文就以城市公共空间的活力要素为切入点，通过几个典型案例来分析和研究高品质的城市公共空间如何提升城市魅力。 成功的公共空间是以富有活力为特点，并处于不断自我完善和强化的进程中的。要使空间变得富有活力，就必须在一个具有吸引力和安全的环境中提供人们需要的东西，即如何在公共空间中营建和应用“空间与尺度”、“可达性与易达性”、“混合使用与密度”、“环境质量”、“公共设施”、“街道家具”和“公共文化活动”等要素。 1．空间与尺度 公共空间首先是一个“空间”的概念。空间是物质存在的客观形式，由长、宽、高等量度和范围表现出来，是物质存在广延性和扩张性的表现。但形成具有实质意义的公共空间应该是具有地域文化和内涵的，并赋予空间涵构意义的“场所”。 “场所”概念常强调“归属感”和与场地的情感联系。荷兰建筑师奥尔多?范?伊克(Aldo Van Eyck)在他著名的场所描述中强调：“不管空间和时间的意义是什么，场所的事件只会有更多意义。这是因为在人的意念中，空间表现为场所，时间表现为事件。”然而在当前营建场所感的规划设计中，场所的形态意义常常被过分渲染，甚至超越了更为重要的人之活动及空间的功能意义。
布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化
56 2019, V ol.40, No.08食品科学※生物工程 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化 刘开放，席志文，黄林娜，惠丰立* （南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳 473061） 摘?要：为实现布拉酵母高密度培养，对其高密度发酵培养基和发酵工艺进行优化。采用Plackett-Burman试验筛选培养基中的显著因素，并进行中心组合设计。通过人工神经网络（artificial neural network，ANN）和响应面试验建立菌体布拉酵母产量与培养基之间的关系模型，利用遗传算法（genetic algorithm，GA）进行全局寻优。结果表明，ANN模型有较好的数据拟合能力和预测能力，更适合处理复杂的非线性问题。GA优化获得最佳培养基组合：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米浆17.32 g/L、硝酸钾14 g/L、酵母营养盐1.5 g/L、磷酸二氢钾0.6 g/L、硫酸镁0.8 g/L。利用该培养基进行摇瓶培养，菌体布拉酵母产量可达到8.21 g/L，比优化前提高1.39 倍。在此基础上利用1 L发酵罐培养确定最佳发酵工艺：温度30 ℃、接种量10%、pH 5.0、溶氧40%。利用50 L发酵罐进行扩大培养，流加葡萄糖和蛋白胨控制发酵液中葡萄糖3 g/L、氨氮0.06 g/L，菌体布拉酵母产量达到51.21 g/L。 关键词：布拉酵母；神经网络；遗传算法；增殖培养基；高密度培养 Optimization of High Cell Density Fermentation of Saccharomyces boulardii for Enhanced Biomass Production LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, HUI Fengli* (College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China) Abstract: For high cell density cultivation of Saccharomyces boulardii, we attempted to optimize medium composition and culture conditions. Plackett-Burman design was used to recognize the signi?cant medium components. Subsequently, response surface methodology and arti?cial neural network (ANN) based on central composite design (CCD) were applied to model the relationship between dry biomass production and medium composition. The optimization of medium composition was carried out using genetic algorithm (GA). The results showed that the ANN model, more suitable for complex and nonlinear modeling, had better goodness of ?t and prediction performance. The optimal medium composition was obtained as follows (g/L): glucose 40.52, peptone 36.8, corn steep liquor 17.32, KNO3 14, yeast nutrients 1.5, KH2PO4 0.6 and MgSO4 0.8 shake ?ask cultivation using the optimized medium gave a dry biomass yield of 8.21 g/L, which was 2.39 folds higher than that obtained from the original medium. Based on these results, we determined the optimal high cell density culture conditions for S. boulardii cultivated in a 1-L fermentor as follows: temperature 30 ℃, 10% inoculum, pH 5.0 and 40% dissolved oxygen. Furthermore, we scaled up the culture process in a 50-L fermentor with the addition of glucose and peptone to maintain the glucose concentration at 3 g/L and the ammonia nitrogen concentration at 0.06 g/L. The dry biomass yield of S. boulardii reached 51.21 g/L in the large scale experiment. Keywords: Saccharomyces boulardii; neural network; genetic algorithm; enrichment medium; high cell density fermentation DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323 中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2019）08-0056-07引文格式： 刘开放, 席志文, 黄林娜, 等. 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化[J]. 食品科学, 2019, 40(8): 56-62. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323. https://www.360docs.net/doc/081850093.html, LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, et al. Optimization of high cell density fermentation of Saccharomyces boulardii for enhanced biomass production[J]. Food Science, 2019, 40(8): 56-62. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-20180424-323. https://www.360docs.net/doc/081850093.html, 收稿日期：2018-04-24 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31570021） 第一作者简介：刘开放（1993—）（ORCID: 0000-0002-2575-893X），男，硕士，研究方向为发酵工程。 E-mail: liukaifang126@https://www.360docs.net/doc/081850093.html, *通信作者简介：惠丰立（1965—）（ORCID: 0000-0001-6542-1525），男，教授，硕士，研究方向为食品微生物与发酵工程。 E-mail: hui?@https://www.360docs.net/doc/081850093.html,