分子生物学综合实验报告

分子生物学综合试验报告

综合实验Ⅰ.Southern杂交

（质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、

地高辛标记的Southern杂交）

一.实验目的

1.学习Southern杂交的原理及操作方法。

2.学习碱裂解法提取质粒的原理。

3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。

4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。

二.实验原理

利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。

PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。

地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。

三．实验准备

1.实验材料：

含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基

2.实验试剂：

Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M

Tris-HCl， M NaCl. pH=，封闭液：1%Blocking Reagent/ Tris-HCl，NaCl，显色缓冲液： Tris-HCl， NaCl，pH=， TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH ，2%，LB固体培养基（添加amp的终浓度为100μg/ml，添加arabinose为培养基的%），溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，TE缓冲液，无水乙醇和70%乙醇。

3.实验仪器：

微量移液器，离心管，DNA吸附柱，DNA收集管，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统，恒温水浴箱，PCR仪，培养皿，超净工作台，硝酸纤维素膜或尼龙膜。

四．试验方法

1.质粒的提取：

①培养细菌

将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24小时，然后从平板上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37℃培养12小时。

②提取步骤

●取 mL 过夜培养的菌液，加入离心管中，6000rpm离心1min，尽量吸除上清，重复两次

●向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL 溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

●向离心管中加入250μL 溶液P2，温和翻转多次使菌体充分裂解。

●向离心管中加入350μL 溶液P3，温和翻转多次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。

●将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3 中，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1Min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

●向吸附柱CP3 中加入600μL 漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

●重复操作步骤6。

●将吸附柱CP3 放入收集管中，12,000rpm离心2min。

●将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL 洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm离心1min 将质粒溶液收集到离心管中。

③琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA

2.聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA：

●按下表加入试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒DNA

●设置PCR 程序

●运行PCR 程序

●反应结束后，取20μl PCR 产物进行% 琼脂糖电泳分析

3.地高辛标记的Southern 杂交：

●将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中，贴壁放置（吸附有核酸的一面不要贴壁），赶走杂交膜和管壁间的气泡。

● 加入20ml Standard buffer ，65℃预杂交4-20小时。 ● 将制备的DNA 探针沸水浴加热10min ，迅速置冰浴5min 。全部加入杂交管。

●使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。

●杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20以备下次使用。这样至少可以保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃ 10分钟以变性探针。

● 取出杂交膜，用Wash Solution I 洗5分钟×3次。

● 保温冲洗：用 Wash Solution II 于68℃冲洗15分钟×2次。

94180s 9445s 325545s 7245s 72600s

cycles ?????????℃

℃℃

℃℃

NBT 显色检测法：

●经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。

●用干净的平皿，封闭液室温封闭至少60分钟。

●用封闭液1：2500—5000稀释 Anti-DIG-AP，例如2μl Anti-DIG-AP加至5-10ml封闭液中（根据染色情况而调整）。稀释液4℃可稳定12小时左右。

●加Anti-DIG-AP，37℃反应60分钟。

●用冲洗液洗15分钟×3次，每次100ml。

●按1：50配制底物显色液：例如100μl“BCIP/NTP储备液”加至5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。

●显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。

●加100ml底物显色液（100 cm2）。将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。显色过程中可以观察。一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12小时。应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位。

●当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液，在此情况下，颜色长期不退。还有一种选择时让膜干燥，颜色消褪。但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。

五.实验结果及分析

图1中，共有16个条带，说明大家都提取成功了，只是右边几个亮度比其他的低，说明提取的DNA含量低一些。图中有一些亮点，应该是胶上有杂质。

GFP质粒提取为8个人一组，所以上图共有四个条带，说明提取成功，而且亮度高，说明含量高。

上面图3中的第一张是班里的14个人的，后两张是另外14个人的，只是曝光时间不同。三张图中的所有条带整齐而且亮度高，表明大家的P38质粒的PCR扩增很成功。

在酶切点样中，右边第一个为Marker,第二个为质粒，第三个为酶切，后面几个为质粒的PCR。图中条带较整齐，有些亮度不够，可能是含量较低。酶切条带与Marker的条带基本一致，但亮度稍低，

含量较低，但总体来说酶切还是不错的。

显色后，可以看到有两个PCR位点和酶切位点，一个质粒，说明杂交结果很好。

综合实验二.RT-PCR

扩增目的基因cDNA

（植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析；植物RNA提取、定量及电泳分析；RT-PCR扩增目的基因cDNA）

一．实验目的

1.掌握植物基因组DNA提取方法及注意事项，大分子量DNA分子的酶切分析。

2.掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。

3.学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

二．实验原理

CTAB可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。

RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。

逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（dT）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5，和3，端经改造

可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

三．实验准备

1.实验材料：

普通小麦幼苗

2.实验试剂：

Ttizol Reagent，氯仿，点样缓冲液Loading buffer（10×），DEPC处理的ddH2O，溴乙啶(EB)，异丙醇，RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，MMLV反转录酶，RNA抑制剂（RNasin），引物（P1、P2），Taq酶及10×PCR缓冲溶液， DNA 抽提液，.氯仿：异戊醇（24：1），70% 乙醇，EcoRⅠ酶，HindIII酶，Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）

3.实验仪器：

微量移液器，研钵，灌装液氮，台式离心机，电泳仪，凝胶成像系统，PCR仪，恒温水浴锅

四．实验步骤

的分离与纯化：

●称取小麦叶片400mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到离心管中。

●加入1 ml Trizol Reagent，室温放置5min。

●加入氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。

●冷冻离心12 000 rpm×15min。

●将上清液转移到另一个离心管中，加预冷异丙醇,混匀，-20℃放置20min。

●冷冻离心12 000 rpm×10min，弃上清。

●加入 70%乙醇于RNA沉淀中并悬浮沉淀，10000 rpm×2min，挥发除去乙醇。

●加入30 μl DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。

●电泳检测

：

①RNA的反转录

●在PCR管中依次加入

RNA模板 5μl

引物 1μL

DEPC·H2O 6μL

混合后，70℃水浴5 min（破坏二级结构），迅速冰浴5min。

●在管中依次加入(反应体系为20 μL)：

5×RT buffer 4μL

RNasin 1μL

10mM dNTP 2μL

M-MΜLV反转录酶 1 μL

置于 42℃水浴，1h。

●70℃保温5min（使酶失活）。

②PCR 扩增DNA

●在灭菌的 PCR 管中，依次加入

cDNA 2μl

引物FW1 1μl

引物AW2 1μl

2 x Taq Mix 10μl

●加ddH2O 补足20μl ，混匀。设置PCR 程序：

③PCR 产物的鉴定 取10μl PCR 产物进行琼脂糖电泳分析。

3.基因组DNA 提取及鉴定：

①基因组DNA 的提取

●取左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入离心管中，加入700μl 抽提液（65℃预热）混匀，加8 ul RNase 室温静置2min 。放入65℃水浴中，裂解30分钟，期间温和混匀几次。

●取出裂解好的DNA ，加入700μl 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（12000rpm ，10分钟）。

94180s 9445s 325545s 7245s 72600s

cycles ?????????℃

℃℃

℃℃

●取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。

●将析出的DNA 离心，12000rpm，10分钟。

●去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗两次，挥发除去乙醇，溶于50μl TE或水中。

②gDNA PCR

反应体系：

2×mix15μL

FW 1μL

AW 1μL

gDNA 2μL

ddH2O 11μL

共计 30μL

③gDNA 酶切

反应体系：

gDNA 30μl

EcoRⅠ 1μl

10× EcoRⅠBuffer 5μl

ddH2O 19μl

共计 55μl

④琼脂糖凝胶电泳检测并分析

●琼脂糖凝胶的制备:

称取琼脂糖加入40ml ×TBE缓冲液中，于微波炉中加热熔解。冷却至65℃时加入2μl EB，混匀。

●胶板制备:

将凝胶槽洗净擦干，在一端插好梳子。然后倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入× TBE缓冲液），拔掉梳子。

●加样:

每个样品中加入1/10体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中。

●电泳观察:

接通电源，电压为80V，电泳1小时左右，当溴酚蓝到达下沿1--2㎝处时，停止电泳。

●观察及照相:

将胶板拿出，用自来水冲洗。在紫外灯下观察结果。

五．实验结果及分析

理论上，未降解的总的RNA电泳时，在凝胶中会出现18S和28S 对应的条带。但是在上图中，许多组都有5条带，而且有拖尾，说明有基因组DNA的污染。有些组没有出现条带或亮度不够，说明RNA被降解了，可能是在操作过程中，受到环境中的RNA酶的污染，所以在实验操作中应戴手套，严格对实验材料和电泳系统中的RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，要尽量减少电泳时间。

图7上为RT-PCR,下为基因组PCR，而且基因组PCR的条带亮度要高一些，说明基因组片段要比反转录得到的片段更大一些。原因是由mRNA反转录得到的片段不含有内含子，而基因组中含有大量的内含子。