甲醇营养型酵母表达系统

酵母发展和现状

酵母的发展和现状一、活性酵母在国民经济中的作用活性酵母: 是指以粮食、糖类等为原料，利用生物工程技术、发酵通风培养得到的、具有发酵活性的纯微生物制品。 1. 食用酵母食用酵母一般是指用发酵法生产的供人类食用或食品加工用的活性酵母制品。产品含有丰富的蛋白质、B 族维生素、脂肪、核酸、固醇和多种酶类等物质，同时又具有将糖类发酵产生酒精和CO2的特性。从酵母所含的蛋白质量来衡量，它高于大豆，为瘦猪肉、牛肉、鱼类鸡蛋的2 倍多。 2. 酵母抽提物酵母抽提物（yeast extract ) ，又称为酵母浸出物。它是将具有活性的酵母细胞经过加工得到，是酵母细胞内物质的浓缩物，产品本身已不具备发酵活性。国内酵母抽提物的商品名称有酵母精、酵母味素和酵母调味料等。 3. 药用酵母一般是将酵母制成酵母片或酵母粉供人摄取。如在酵母培养过程中加人微量元素制成硒酵母、铬酵母等特种酵母制品，用于补充不同人群微量元素的不足，以预防一些特殊病症的发生。如含硒酵母用于治疗克山病和大骨节病，并有一定的防止细胞衰老的作用；含铬酵母可用于治疗糖尿病等。 4 饲料酵母饲料酵母是将培养的酵母，或从酿酒过程中回收的废酵母经过干燥制成的粉末状或颗粒状产品，一般不具备发酵活性。它含有丰富的蛋白质（40 ％一48 % ）、B 族维生素、氨基酸等物质，广泛用作动物饲料的蛋白质补充剂。二、活性酵母发展史从酵母在人类历史的发展过程中的作用来看，可以分为3 个阶段: 1. 利用啤酒和酒精生产副产物―废酵母的阶段

1781 年，荷兰人用离心机将上面发酵啤酒中的酵母除去酒花苦味、采用螺旋压榨机压干的块状产品，第一次在市场销售。产品被称为压榨酵母（compressed yeast ）或面包鲜酵母，这是最早出现的商品酵母。 2. 形成专业化商品活性酵母生产的阶段从19 世纪末至20 世纪中期约50 年期间，压榨酵母的生产在欧洲得到了快速的发展，生产工艺和生产装备逐步完善，生产原料从粮食改为废糖蜜，使面包酵母的生产水平大幅度提高。 3 活性干酵母产业的发展最早出现的活性干酵母（active dry yeast , ADY ）起源于19 世纪上半世纪。 20 世纪60 年代末，荷兰Gist 公司首先开发成功并生产出发酵活性高、保质期长、可直接与面粉混合制成面团的干酵母，产品被称为高活性干酵母（high active dry yeast 或instant active dry yeast ) ，发酵活性一般可以保持在1 一2 年。三、酵母生长与生产 1 面包酵母的生长特性和要求面包酵母(顾名思义是制造面包用的)和酿造酵母(造酒用的)在酵母分类中都划分在一种，即Sacchromyces cerevisiae。酵母的自然的生境(habitat)大都是含糖丰富的，通气不良的中温场所。通常在花的蜜腺，水果，甘蔗表面等地方。它们以发酵的方式生活，即由糖产生乙醇和CO2，可以用下式表述： C6H12O6→2C2H5OH+2CO2 由于酵母菌体是活性干酵母的生产原材料，因此活性干酵母工厂必须对酵母菌体的生产倍加注意。酵母的耐干性或对制造活性干酵母时所施的烘干工艺的配套性和酵母细胞内所含的海藻糖的量呈正相关，因此菌种的选择至关重要，如中科院微生物所的X 8、美国ATCC的7752菌株都是可用的优良菌株，而且极易由商品自行分得。 2 酵母生长的动态由酵母的生长曲线(图19-1)可以看到酵母的细胞增殖主要是在对数期完成的。而且酵母的培养工艺要求接种到生产罐的酵母立即进入对数增殖状态，即在生产罐以前就完成了迟缓期。

酵母菌的营养方式及细菌的作用

酵母菌的营养方式及细菌的作用酵母菌适用于酿造生产，通过发酵能使物体膨胀，酵母菌的营养方式也各不相同，除了在物体上起作用外，对身体也有好处，但是酵母菌要使用正确，不然也会引起危害。并且我们要了解酵母菌的作用，从而更好的运用此病菌，那么我们就一起来了解酵母菌的营养方式及细菌的作用。酵母菌的基本结构有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核，大液泡，没有叶绿体.因此不能进行光合作用，必须依靠现成的有机物维持生活，因此营养方式是异养腐生。保护肝脏酵母分为鲜酵母、干酵母两种，是一种可食用的、营养丰富的单细胞微生物，营养学上把它叫做“取之不尽的营养源”。除了蛋白质、碳水化合物、脂类以外，酵母还富含多种维生素、矿物质和酶类。有实验证明，每1公斤干酵母所含的蛋白质，相当于5公斤大米、2公斤大豆或2.5公斤猪肉的蛋白质含量。因此，馒头、面包中所含的营养成分比大饼、面条要高出3—4倍，蛋白质增加近2倍。发酵后的酵母还是一种很强的抗氧化物，可以保护肝脏，有一定的解毒作用。酵母里的硒、铬等矿物质能抗衰老、抗肿瘤、预防动脉硬化，并提高人体的免疫力。发酵后，面粉里一种影响钙、镁、铁等元素吸收的植酸可被分解，从而

提高人体对这些营养物质的吸收和利用。制品疏松酵母在面团发酵中产生大量的二氧化碳，并由于面筋网络组织的形成，而被留在网状组织内，使烘烤食品组织疏松多孔，体积增大。酵母还有增加面筋扩展的作用，使发酵时所产生的二氧化碳能保留在面团内，提高面团的持气能力。如用化学数疏松剂则无此作用。改善风味面团在发酵过程中，经历了一系列复杂的生物化学反应，产生了面包制品特有的发酵香味。同时，便形成了面包制品所特有的芳香，浓郁，诱人食欲的烘烤香味。增加营养因为酵母的主要成分是蛋白质，几乎占了酵母干物质的一半含量，而且人体必需氨基酸含量充足，尤其是谷物中较缺乏的赖氨酸含量较多。另一方面，含有大量的维生素B1，维生素B2及尼克酸。所以，酵母能提高发酵食品的营养价值。以上为大家介绍的就是酵母菌的营养方式及细菌的作用，当我们知道了酵母菌的营养方式后，就能有效的运用酵母菌，当然人们还要了解酵母菌的使用方式，在生活中才能更好的利用酵母菌，而使过程中必须注意卫生，不然会导致

酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统

1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。

酵母水的作用与功效

酵母水的作用与功效众所周知酵母是人类应用比较早的，也是应用最为广泛的微生物。在人类文明发展中酵母水充分发挥其应有的作用。可以说是人们经常利用它的发酵作用制造各种发面食品和酿酒。酵母是由工厂纯种培养菌培育而成的活酵母，含70%左右的水分叫压榨酵母，含10%左右水分的叫干酵母。酵母粉主要为面包制作或包子馒头以搭配中粉及高粉较多，主要作用是扩展面筋筋度及增加面团体积，做出来的成品口感较韧。酵母营养分析： 1.酵母粉富含维生素B群，素食者常缺乏的B1、B2、B12，在酵母粉中皆可提供完全的满足； 2.酵母菌加入面团内，在25～30度温度条件下，酵母便利用面团中存在的蔗糖、葡萄糖、果糖以及由面团本身的淀粉酶转化而成的麦芽糖进行生长，将一部分糖分解成二氧化碳和酒精，使面团立即膨胀发起，最后在馒头等食品中形成大量空泡，即疏松暄软又具有香气。酵母补充信息： 1.酵母只要没有异味就可以使用了，如果发臭就千万不能用； 2.含有较多油脂的面团不能用酵母发制； 3.市场上出售的鲜酵母一般要保存在10～25度之间； 4.干酵母应置于阴凉干燥处，注意防热、防潮，如果放在冰箱中，可以延长保存期。

酵母适合人群：一般人群均可食用，维生素B族缺乏者尤其适合食用。酵母做法指导：使用酵母发面时，可以加入少量食糖，作为酵母活化时的营养。酵母的配料是:天然酵母、乳化剂形状是小颗粒状的，估计因为过于细小象粉一样所以就叫酵母粉。经发酵后广泛用于生产面包、馒头、包子、花卷、饼中西餐面食等等。不可以直接泡水喝酵母有很高的营养价值，不仅含有较多蛋白质、B族维生素，还含有核酸和矿物质，同时，含有保健功能的活性物质。维生素B族可控制人体的代谢功能，保持正常的神经作用。维生素B2与维生素B6对皮肤是很重要的维生素。维生素B12有防止贫血的作用，且有促进肠内维生素合成的作用，所以对肠或肝功能不强的人有增强体力的效果。

酵母铬的功效

酵母铬： ①安琪酵母铬简介：天然血糖调控剂，在机体糖代谢和脂代谢中发挥特殊作用的人体必需微量元素-铬激活胰岛素活性，调节血糖，抑制糖转化为脂肪。主要功用：铬能增强胰岛素活性，控制血糖。能调节脂肪储存量，帮助减重。降低血中胆固醇和甘油三酯的含量，预防心血管病。最佳摄取量：100微克，若为治疗目的，则以200微克为宜。酿酒活性干酵母是最好的摄取方式。研究指出，每日200微克酵母铬，血糖平均可降低18％。每日补充200微克以上的酵母铬胆固醇会大为降低。②杭州双马生物工程有限公司产品规格:富铬酵母中有机铬Chromium(Cr)含量：大于0.25% 产品优点:本品符合国际标准，有机铬含量0.25-0.8%，其中蛋白质含量大于38%，已处于国内领先水平。铬是人体必需微量元素，是胰岛素辅助因子。 3.3 酵母铬的特点、功效及应用 3.3.1 酵母铬的优点： ①通过毒性试验证实酵母铬食用安全，无毒性。 ②酵母铬含有的生物活性铬的人体吸收率可高达10%-15%，其吸收率是甲基吡啶铬的311%，氯化铬的672%。 ③酵母铬本身富含蛋白质、糖类和B族维生素，除可作为铬源使用外，还同时提供其他有益营养。 ④酵母铬能进行大规模工业化生产，生产成本低。 3.3.2酵母铬的功效 ①降低糖尿病患者的血糖，也可以改善其低血糖反应，具有对血糖的双重调节作用，能有效控制糖尿病，消除葡萄糖耐量方面的异常现象。 ②能明显降胝血清胆固醇水平，减轻动脉硬化症状。 ③能纠正缺铬儿童和长期肠外营养患者的糖耐量异常。 ④能有效增加人体肌肉，减少脂肪。 ⑤在生长/肥育猪日粮中添加铬可显著提高胴体瘦肉率，提高饲料转化率，降低背脂厚度，还可以提高母猪的繁育性能和仔猪的成活率。 ⑥能增加蛋鸡的产蛋率，降低鸡蛋胆固醇，也可增加肉鸡生长速度，降低胸肌脂肪含量。 ⑦能改善动物内分泌，增强抗应激能力。 3.3.3酵母铬的应用范围： ①可作为补铬保健食品和药品的原料 ②可作为营养强化食品中铬营养素强化的原料 ③可用于畜牧养殖业，作为饲料中铬营养素强化的原料 ④其他需要强化铬营养素的产品

酵母表达体系

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts）分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，

一：分子克隆 1.设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml

酵母在生活中的应用

酵母在生活中的运用酵母与人类的伙伴关系，已经有几千年的历史。古代人类在几千年前就利用酵母来加工美味食品。如建造金字塔的劳工已使用酵母发酵制作面包，古代中国人应用酵母酿酒并形成了中国特有的酒文化。酵母帮助人类将面粉发酵，才有了全人类的主食——面包、馒头等。酵母将糖类物质转化成食用酒精，才有了美味的葡萄酒、威士忌、中国白酒；在人类遇到能源紧缺的今天，酵母正在将更多的糖类物质转化成燃料乙醇，使人类得以持续创造新文明。酵母把自己的内涵物质转化成人类青睐的鲜味剂——酵母抽提物，还把细胞壁分解成葡聚糖，奉献给人们食用和医用。酵母帮助养殖业增强动物机体免疫功能，促进人类食物安全和营养健康！在发现微量元素是人类不可或缺营养的今天，酵母将无机微量元素吸收体内，创造了安全、天然的生物态微量元素补充剂，帮助人类预防疾病、延年益寿。如酵母锌、酵母硒、酵母铬等。酵母是单细胞的微生物，其细胞组织结构与人体非常接近，是理想的天然营养源。酵母菌本身具有很高的营养价值，特别是含有较多蛋白质，很多B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物质。维生素B群可控制人体的代谢功能，保持正常的神经作用。维生素B2与维生素B6对皮肤是很重要的维生素。维生素B12有防止贫血的作用，且有促进肠内维生素合成的作用，所以对肠或肝功能不强的人有增强体力的效果。而酒酵母作为酵母中的一个分支——浑身是宝，无比神奇，是人类健康的小伙伴；经过现代生物技术加工的营养酵母也已经成为时尚的天然营养健康食品。中国发酵工业协会酵母分会理事长、高级工程师莫湘筠女士曾经建议，酵母对人体不仅没有任何副作用，反而可以提供必需的营养物质，是有益人类的生物膨松剂。消费者大可不必为它的安全性担心，轻信传言、走进误区。

酵素酵母的作用和吃法

酵素酵母的作用和吃法酵素是对我们人体有着不少好处的东西，可以帮助我们调节身体机能，保持内环境的平衡，那么大家知道酵素的作用和吃法是怎么样的吗，酵素的做法又是什么样的呢，酵素有哪些作用呢，下面的和大家一起来了解一下吧。 (一)酵素的作用随着我们年龄的增长，还有各种外界因素的干扰，我们人体中含有的酵素的含量也是在逐渐的下降之中，我们的身体中酵素流失的话就会导致身体的代谢的功能下降，也就会导致的疾病的产生。优蜜果酵素原液具有排出毒素的综合作用酵素比内科更令人满意，它会对引起发炎的细胞施展抗炎作用，并分解因发炎而产生的细菌。酵素具有细胞再生、细胞复活、解毒、血液净化及促进新陈代谢等作用。服用优蜜果酵素可以抑制炎症，再分解排出炎症所分泌出来的病毒，对结核的症状产生抗菌，并畅通血液循环及促进细胞之新生。对于女性妇科疾病来说，它的原因是比较多的，但是其中的一个主要因素就是患者有酸性的体质，在我们生活中，鱼肉等都是属于酸性的食物哦。酵素有减肥功效酵素有分解脂肪的作用

酵素有减肥功效酵素有分解脂肪的功能，对于肥胖的人服用一至三个月，能消除多余的脂肪，使人变得既结实又健康、精力充沛。要实施酵素减肥法，可实行酵素断食二十四小时，三餐除服用酵素以外不吃任何食物，如果饿了，就吃酵素，用量比平时加倍(每天三餐时间，也可多加一次服用)，一星期可实施二、三天断食，依个人需要可调整。酵素服用后多多饮水。恢复正常进食时，以吃八分饱为宜，避免吃含多脂肪或含高热能的食物。如此食用者会逐渐发现：自己体重减低，多余脂肪消失，而且容光焕发、体力充沛。酵素的分解作用酵素能够帮助我们分解我们身体中的酒精，通常来说，我们人体中的酒精含量超过百分之七或者是以上的话，就会导致我们出现酒精中毒的情况，这个时候服用酵素就能很快的帮助我们解酒。因为酵素的分解功能，把渗入血液中的酒精等异物分解，减少血液中的酒精成份，同时被分解的物质就化成尿、汗等排出体外，所以，酵素对解酒才有如此的特效。至于防酒醉的方法，是在喝酒半小时前服用适量的酵素原液。对于酒量大者根本不容易醉，对于酒量小的人，喝酵素是防止酒醉最安全的措施。

酵母表达系统使用心得

精心整理 Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会这个是来中心（ 1. 3. 4. 5. 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由

于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alphafactor（α-factor）用以的是系 PIC9K G418无 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微

镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等有的余的（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利； ⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；

酵母表达系统步骤

毕赤酵母表达系统步骤（参考Invitrogen公司说明书）：一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存 1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2挑取转化子，甘油保存。二、载体构建 1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。 2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3载体测序测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物三、线性化DNA 1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）；四、线性化DNA的去磷酸化处理线性化质粒43μl CIAP Buffer 5μl

CIAP酶2μl 四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱；五、感受态细胞的制备实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯； 1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d； 250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5； 41500g，4℃离心5min收集菌体； 540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀； 61500g，4℃,5min； 730ml无菌水重悬； 81500g，4℃,5min； 910ml 1M 山梨醇重悬； 101500g，4℃,5min； 11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)；六、电击转化 15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移

CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较

CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统（1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM 中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。（2）存在的问题在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．毕赤酵母细胞表达系统（1）特点自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l 以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲

酵母营养

酵母的营养价值酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae））与我们的生活日益密切相关，它除了在烘焙、酿造、发酵等传统行业发挥不可替代的作用外，目前直接食用营养酵母，以获取酵母的丰富、均衡的营养，发挥酵母的各种保健作用，正在欧美等发达国家和地区流行。随着我国居民营养知识的普及和对酵母的认识，食用酵母的营养价值将会逐渐被接受。食用酵母的主要营养成分包括：蛋白质及氨基酸、B族维生素、矿物质、多糖、其它活性成分如麦角固醇、谷胱甘肽等。一、食用酵母中蛋白质和氨基酸评价蛋白质的营养价值可分为化学法和生物法，前者主要分析蛋白质的含量和氨基酸组成。食用酵母含有丰富的蛋白质，其含量大约在40～60％，远远高于肉类、蛋和大豆等食物中蛋白质的含量[1][2]，见表1，表1：不同食物中蛋白质的含量表单位：g/100g

酵母含有人类和动物所需要的全部8种必需氨基酸，而且必需氨基酸的含量高于或接近联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）推荐氨基酸组成比例[1][3]。酵母蛋白质中氨基酸的记分（限制氨基酸）与谷类、豆类、奶粉的比较如表2。表2：不同食物蛋白的氨基酸记分酵母蛋白中氨基酸的比例构成符合FAO和WHO的推荐标准，是优势的蛋白来源，而且其蛋白含量远远高于其它的食物，是补充优质蛋白的最佳来源。从生物学上来分析食用酵母的蛋白质的营养价值主要是分析酵母蛋白的生物价、消化率和净蛋白质利用率。生物价是指被吸收的蛋白质中，供给机体生长和维持生命的那部分蛋白质的比例。消化率是指摄入总蛋白中被机体吸收的部分。净蛋白质利用率是指生物价和消化率的乘积，该值是衡量蛋白质的品质的尺度，表3列出不同蛋白的营养价值。

2020年毕赤酵母表达系统资料整理

作者：非成败作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 毕赤酵母表达系统 Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts 表型。AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换

食品中的酵母及应用

食品制造中的酵母及其应用酵母菌与人们的生活有着十分密切的关系，几千年来劳动人民利用酵母菌制作出许多营养丰富、味美的食品和饮料。目前，酵母菌在食品工业中占有极其重要的地位。利用酵母菌生产的食品种类很多，下面仅介绍几种主要产品。 2.1 面包面包是产小麦国家的主食，几乎世界各国都有生产。它是以面粉为主要原料，以酵母菌、糖、油脂和鸡蛋为辅料生产的发酵食品，其营养丰富，组织蓬松，易于消化吸收，食用方便，深受消费者喜爱。 2.1.1 酵母 1) 酵母菌种 1 酵母是生产面包必不可少的生物松软剂。面包酵母是一种单细胞生物，属真菌类，学名为啤酒酵母。面包酵母有圆形、椭圆形等多种形态。以椭圆形的用于生产较好。酵母为兼性厌氧性微生物，在有氧及无氧条件下都可以进行发酵。酵母生长与发酵的最适温度为26~30℃，最适pH为5.0~5.8。酵母耐高温的能力不及耐低温的能力，60℃以上会很快死亡，而-60℃下仍具有活力。生产上应用的酵母主要有鲜酵母、活性干酵母及即发干酵母。鲜酵母是酵母菌种在培养基中经扩大培养和繁殖、分离、压榨而制成。鲜酵母发酵力较低，发酵速度慢，不易贮存运输，0~5℃可保存二个月，其使用受到一定限制。活性干酵母是鲜酵母经低温干燥而制成的颗粒酵母，发酵活力及发酵速度都比较快，且易于贮存运输，使用较为普遍。即发干酵母又称速效干酵母，是活性干酵母的换代用品，使用方便，一般无需活化处理，可直接生产。目前，我国市场上的活性干酵母有中外合资企业生产的梅山牌、安琪牌、牌

等产品，另外还有进口法国、荷兰、德国的产品。在选购时应注意产品的生产日期、包装是否密封，且必须注意选购适合配方要求的酵母如耐高糖与低糖的酵母。只有酵母质量有保障才能生产出高质量的面包。对于贮存时间过长的酵母在生产前要对其活力进行测定。 2) 酵母菌在面包制作中的作用体积大、组织松软。酵母在发酵时利用原料中的葡萄糖、果糖、麦芽糖等糖类及a-淀粉酶对面粉中淀粉进行转化后的糖类进行发酵作用，产生CO2，使面团体积膨大，结构疏松，呈海绵状结构；改善面包的风味。发酵后的面包与其他各类主食品相比，其风味自有特异之处。产品中有发酵制品的香味，这种香气的构成极其复杂。增加面包的营养价值。在面团制作过程中，酵母中的各种酶对面团中的各种有机物发生的生化反应，将高分子的结构复杂的物质变成结构简单的、相对分子质量较低能为人体直接吸收的中间生成物和单分子有机物，如淀粉中的一部分变成麦芽糖和葡萄糖，蛋白质水解成胨、肽和氨基酸等生成物。这对人体消化吸收非常有利，提高了谷物的生理价值。酵母本身蛋白质含量甚高，且含有多种维生素，使面包的营养价值增高。 2.1.2 生产面包的主要原辅料 1) 面粉面粉的质量通常表现在面筋的量和质上。质量好的面粉，面筋延伸性大、弹性好，做出的面包体积大而膨松；反之面筋延伸性小、弹性差，调制的面团板结，不易起发。所以生产中常将面筋量大质差和量小质优的面粉搭配使用，以互相弥补不足。

综述(酵母菌在食品工业中的应用)

酵母菌在食品工业中的应用 *** （*******************************）摘要：乳酸菌是应用于食品工业的重要菌种，本文阐述了乳酸菌的基本特征和分类，综述了酵母菌在面包制作，酒工业发酵中的应用，并对酵母菌的应用前景进行了展望。关键词：乳酸菌生理功能应用 The application of the yeast in the food industry ********************* (*************************************************************************** *******************************) Abstract :The Lactobacillus is an important s trains be used in food industry,this paper expounds the basic characteristics and classification of the lactic acid bacteria,summarize the application of yeast be used in the bread manufacturing and fermented wine industry,and application prospect of yeast was prospected. Key words：Lactic acid bacteria Physiological function Application

酵母表达系统概述及相关研究进展

酵母表达系统的研究进展和前景 ( XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院) 摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物引言酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。酿酒酵母（Saccharomyces. cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。其中毕赤酵母（P. pastoris）是继S. cerevisiae之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点[1]：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基中提纯而不必收集酵母本身细胞。

酵母菌在食品中的应用

酵母菌在食品中的应用摘要：本文对酵母菌的发展史，物理化学性质和生物特性作了简要的介绍，重点介绍了酵母菌在食品中的应用，本文对其在面包，酿酒，制醋行业的应用做了详细介绍。关键词：发酵膨松剂酒精发酵 1.酵母菌的发展史早在公元3000年前，人类开始利用酵母来制作发酵产品。从埃及塞倍斯(Thebes)地区出土的面包房和酿酒房的残余模型看，早在公元前2000年人类就已较好地利用酵母制作发酵食品和酿酒。公元前13世纪，面包焙烤的技术从埃及传到地中海和其它地区。1680年列文虎克用显微镜从一滴啤酒中发现酵母细胞，不久，人类就开始有意识地利用酵母（啤酒酵母泥）发面。酵母的重要性逐渐引起工业界的注意。最早在市场上销售的产品酵母泥，发酵速度快，但运输和使用不便，产品的商业化受到了一定的限制。从销售酵母泥算起，把制造酵母作为一种工业来看，酵母工业的发展已有200余年的历史了。酵母已成为世界上研究最多的微生物之一，是当今生物技术产品研究开发的热点和现代生物技术发展、基因组研究的模式系统。 2.酵母菌的物理化学性质和生物特性 2.1酵母菌的物理化学性质酵母是一种单细胞生物，有着天然丰富的营养体系。酵母细胞中含有大量的有机物、矿物质和水分。有机物占细胞干重的90%-94%，其中蛋白质的含量占细胞干重的35%-60%，碳水化合物的含量在35%-60%，脂类物质的含量在1%-5%。酵母细胞中还富含多种维生素、矿物质和

多种酶类，能促进其被消化吸收。此外它还含有多种鲜为人知的活性物质，如麦角固醇、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、辅酶A等。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1-5微米、5-20微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。酵母为兼性厌氧性微生物，在有氧及无氧条件下都可以进行发酵。其发酵机理为：将面团中糖类分为二氧解并转变化碳和乙醇，同时放出能量。化学反应方程式为：C6H12O6→2CH3COCOOH+4H→2CH3CH2OH+2CO2+能量 2.2酵母菌的生物特性酵母经发酵作用产生二氧化碳和乙醇，提供发酵类烘焙产品特有的组织和风味，但其发酵和产气能力深受面团组成成分、酸度(pH值）、温度、糖的种类、渗透压、水分等因素的影响。因此了解酵母的生物特性，正确的储存和使用是面包制作的关键因素之一。由于酵母受到以上因素的影响，在使用酵母时应注意给予适当的保护。如避免在过热过冷、过酸过碱的环境下发酵，避免与糖、盐、油脂、奶粉等物直接接触。可将鲜酵母或速效干酵母直接与面粉混合，使酵母外层被面粉包裹，起到保护作用，或将酵母先溶于少量的温水中，同样起到保护作用。 3.酵母菌在食品中的应用酵母菌与人们的生活有着十分密切的关系，几千年来劳动人民利用酵母菌制作出许多营养丰富、味美的食品和饮料。目前，酵母菌在食品

酵母表达系统

Yeast Expression System Lihong Xu, PhD Technical support Invitrogen corporation Hotline:8008208181-2-2 Email:cntechsupport@https://www.360docs.net/doc/0f14985418.html,

Invitrogen Protein Expression Systems -Prokaryotic: E. coli -Cell-free (and Lumio technology) -Yeast: Pichia Pastoris -Insect: Baculovirus -Mammalian -Mammalian Viral

Expression hosts and their applications

酵母表达系统的优缺点

Invitrogen ’s Yeast Expression Systems ?Bioproduction ?Industrial ?Not as well known as P. pastoris ?High-level expression ?Amenable to large-scale bioproduction ?Licensing for industrial is less restrictive Pichia methanolica ?E. coli user who wants to move to a eukaryote ?Expression not as high as Pichia ?Typically uses nutritional markers rather than antibiotics ?Very commonly used –mostly for genetic studies ?Good alternative to E. coli if eukaryote needed ?Variety of vectors available Sacchromyces cerevisiae ?Need lots of protein ?Bioproduction ?Requires license by industrial ?High-level expression ?Amenable to large-scale bioproduction ?Thousands of publications about the system ?Wide range of products Pichia pastoris Customer ’s needs Disadvantage Advantage System