植物基因工程实验技术

植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月

前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
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目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
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实验一
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存
大肠杆菌(Escherichia coli)是分子遗传学实验, 基因工程操作中广泛采用的一种 受体菌,它的遗传背景研究的比较详细, 常用做寄主进行基因扩增及外源基因的 表达. 一. 实验目的: 掌握大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存方法. 二. 实验原理: 大肠杆菌除本身的核染色体外,往往还含有质粒(Plasmid)DNA, 这是一种双链闭合环状的 DNA 分子, 大小在 1Kb-200Kb 左右, 通常质粒 DNA 带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因,而使寄主菌表现以下一些 表现型: 1.对抗生素的抗性 4.产生大肠杆菌素 2.产生抗生素 5.产生内毒素 3.降解有机复合物 6.产生限制修饰酶
pUC19 质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(Ampecillin)有关的基因,它 能编码一种β-内酰胺酶,这种酶降解氨苄青霉素,从而消除了抗生素对细胞壁 形成的抑制作用,不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活.
三.实验材料:
E.coli InvaF'
E.coli InvaF'(pUC19)
四.实验仪器,器皿及试剂: 仪器:超净工作台 等 器皿:(见附录) 试剂:琼脂 等 酵母抽提物 胰蛋白胨 Nacl 氨苄青霉素 NaOH 恒温培养箱 高压灭菌锅 恒温水浴锅 微波炉
五.实验步骤: 1. 配制培养基: a.LB(Lurib-Bertani) media 酵母抽提物 胰蛋白胨 Nacl
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(Yeast extract) (trytone)
5g/L 10g/L 10g/L

加蒸馏水定容至 1000ml 调节 pH 值至 7.0. 配制 750ml 固体培养基: 在上述液体培养基中, 15 g/L 加入琼脂加热至充分熔 按 化,即成固体培养基. b:50%的丙三醇: 取 50ml 丙三醇加入 50mlddH2O 至 100ml. 将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒 15 磅 20min 2. 倒平板:将固体培养基加热至充分熔化,待温度降至 50℃以下凝固前,加入 Amp 至 100ug/ml 摇动混匀, 每平皿倒入 25ml 左右, 此过程应进行无菌操作, 另倒一不含 Amp 的 LB 平板. 3. 待培养基凝固以后,用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种:E.coli InvaF' 和 E.coli InvaF'(pUC19)于不含 Amp 的 LB 平板上和含 Amp 的 LB
平板上,划线接种要防止划破培养基,划线方法如图所示:
第一次划线后接种环灼烧 再进行第二次划线
第二次划线起点与第一次 划线交叉,接种环灼烧后再 进行第三次划线
如此在平板上 划线 5-6 次
4. 接种完成后将培养皿倒置入培养箱 37℃培养过夜,运用这种划线方法接种, 可以较好地保证单菌落的形成. 5. 比较两菌系在培养基上的不同反应.挑取:E.coli InvaF'E.coli InvaF'(pUC19)的 单菌落分别接种至含 Amp 和不含 Amp 的 5ml LB 液体培养基中, 37℃振荡培 养过夜. 6. 分别吸取 0.5 ml 菌液在无菌条件下,加入 0.5 ml 50%丙三醇,置一灭菌的 冻干管中,混匀至-20℃保存. 思考题: 1. 平板培养细菌为什么要倒置培养? 2. 细菌的继代繁殖为何要强调单菌落分离? 3. 在固体培养基中怎样加入抗生素? 4. 简述单菌落分离的接种过程.
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实验二
强碱法小量制备质粒 DNA
一.实验目的:了解基因工程操作中运载基因的载体,掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法.
二.实验原理: 碱变性抽提质粒 DNA 是基于染色体 DNA 的变性与复性的差异 而达到分离的目的.利用溶菌酶,强碱(NaOH)及表面活性剂(SDS)使细胞破壁, 膜,释放出胞内染色体 DNA,质粒 DNA 及其它物质,通过一系列的纯化过程: 高盐除核 DNA,苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类,最后用异丙醇(或乙醇)沉淀出 质粒 DNA 和 RNA 等, RNA 再经 RNase 消化,得到质粒 DNA,这种质粒 DNA 可用作基因工程的载体,更广泛地用于重组子的鉴定. 三. 实验材料: Ecoli InvaF'(pUC19)
四. 实验仪器,器皿及试剂: 仪器,器皿(见附录) 试剂:1.溶液 1(GTE) 50 mmol/l 10 mmol/l 25 mmol/l 4mg/ml 2.溶液 2 200 mmol/l 1% SDS 3.溶液 3 5 mol/l KAC 冰乙酸 ddH2O 4.苯酚-氯仿 5. 异丙醇(或 95%乙醇,100%乙醇) 6. 70%乙醇 7. TE (pH 8.0): 10 mmol/l 1 mmol/l 8.RNase 1mg/ml Amp Tris-Cl EDTA-Na 2 100ug/ml (pH 8.0) 60 ml 11.5ml 28.5ml NaOH 葡萄糖 EDTA-Na 2 Tris-Cl 溶菌酶 (pH 8.0)
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五. 实验步骤: 1. 挑取一单菌落的 Ecoli InvaF'(pUC19)菌种接种到含 Amp100ug/ml 的 LB 液 体培养基中,37℃振荡培养过夜. 2. 吸 1. 菌液至 eppendorf 管中, 4ml 在高速台式离心机上 5, 000g 离心 2min, 倒去培养基. 3. 重复 1 次,尽可能倒出培养基并将管倒置于纸帕上,以吸干管壁上残留 的培养基,收集细菌. 4. 将细菌悬于 500ul 冰冷的溶液 1 中,于离心机上 5,000g 离心 2min. 5. 倒去溶液 1,再悬于 200ul 冰冷的溶液 1 中. 6. 加入 300 ul 新配制的溶液 2,冰浴 5 min. 7. 加入 300ul 冰冷的溶液 3,中和,轻轻振荡 10sec,至冰浴 5 min. 8. 于离心机上,10,000 g 离心 5min. 9. 取上清转移至一新管中,并加入 RNase 酶至 50ug/ml,于 37℃水浴中温 浴 30 min. 10. 加入等体积的饱和酚抽提 1 次,10,000 g 离心 5min 取上清液. 11. 再加入等体积的氯仿抽提 1 次, 10,000 g 离心 5min 取上清液. 12. 加入 750ul 异丙醇,沉淀质粒 DNA, 10,000 g 离心 10min. 13. 倒去异丙醇,用 70%乙醇洗涤沉淀,10,000 g 离心 5min. 14. 置冰箱内开盖干燥,悬浮至 40ul 去离子水或 TE 中.
思考题: 1. 有机溶剂抽提为什么可以达到除蛋白,脂类杂质的目的? 2. 异丙醇沉淀 DNA 后为什么要经过 70%乙醇清洗这一步? 3. 逐步说明强碱法提取质粒 DNA 的原理.
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实验三
琼脂糖凝胶电泳
一.实验目的: 学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳技术,检测 DNA 的纯度,DNA 的构型,含 量以及分子量的大小.
二.实验原理: 琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖,它具有亲水性且不含带电荷的基团, 是一 种很好的电泳支持物,DNA 分子在碱性环境中带负电荷,在电场作用下向正极 泳动,不同的 DNA 片段由于电荷,分子大小及构型不同,在电场中所受的动力 及琼脂糖交联分子的阻力不同,小分子及构型紧密的分子泳动较快, 大分子则较 慢,大小相同的分子形成一条带,于是达到了分离 DNA 分子的目的.
三.实验材料: 菌种 Ecoli.INVαF ,(pUC19)
四.实验仪器,器皿及试剂: 仪器,器皿(见附录) 试剂:1.电泳缓冲液: 5×TBE pH8.0(使用浓度为 0.5×) 配制:称取 54.0gTris,27.5g 硼酸,加入 20ml 500mmol/l 的 EDTA, 先加 800ml 重蒸水,加热溶解后,再加重蒸水定容至 1000ml. 2.1mg/ml 溴化乙锭溶液 (EB) 配制:带手套谨慎称取 1mg 溴化乙锭,溶于 1ml 重蒸水中,置 4℃冰箱 备用.(EB 是 DNA 的诱变剂,亦是强致癌屋,操作时应小心!) 3.琼脂糖:视实验要求制不同浓度的胶,用 0.5×TBE 作溶剂配制. 4.0.2% 溴酚蓝,50%蔗糖指示剂(Loading buffer) 配制: 称取溴酚蓝 100mg,加重蒸水 5ml,在室温下过夜,待溶解后 再称蔗糖 25g, 加重蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中, 摇匀后加重蒸水定容至 50ml, 加 NaOH1-2 滴调至蓝色.
五.实验步骤:
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1. 琼脂糖凝胶的制备: 琼脂糖凝胶的浓度一般为 0.5%-1.5%, 称取 1g 琼脂 糖于 250ml 的三角瓶中,加入 100ml 0.5×TBE 于微波炉内充分加热煮沸, 慢慢冷却至 50℃以下, 电泳平板洗净后晾干, 两端封上胶布, 置于水平板上, 架上梳子后倒入凝胶液 4-5mm 厚,待凝胶充分凝固后,撕下两端胶布,置于 电泳槽内, 加入电泳缓冲液至浸没胶 0. 5mm 左右, 轻轻拔出梳子, 接上电源, 明确电源极性. 2. 样品准备:电泳样品 DNA 的量由电泳所跑的带的数量而定,一般为 2-800ng, 质粒 DNA 一般为两条带, 这是由同种分子构型差异而形成的, 点样量为 300ng 左右. 吸取质粒 DNA TE 或重蒸水 Loading buffer 3. 点样 4. 开稳压电源,电压调整至 1-5V/cm,电泳 3-4 小时. 5. 染色: 电泳后的凝胶,置于含溴化乙锭 0.5ug/ml(EB)的蒸馏水或 TBE 染色 0.5h,为方便起见,常在电泳时在电泳液中加 EB 或直接在凝胶中加入 EB. 6. 观察电泳结果:将凝胶置于透射式紫外检测仪上,在紫外灯下可见荧光带. 7. 绘出电泳带草图. pUC19 12ul 4ul 4ul
思考题: 1. 简述 DNA 分子大下电泳确定法. 2. 凝胶电泳为什么能分离不同构型或分子大小 DNA? 3. 你认为迁移率与分子大小是否成直线关系.
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实验四
植物总 DNA 的提取,纯化和检测
植物 DNA 是进行分子遗传研究的基本对象, 提取完整, 高纯度的 DNA 是研究中很重要的 一环,在近年来兴起的分子育种中运用尤为广泛,掌握植物 DNA 的提取方法,了解其原理有 其重要意义,本实验在着重于原理的前提下,介绍一种可适用于多种植物的简便方法.
一.实验目的:学习植物总 DNA 的提取,纯化及检测方法
二.实验原理:植物 DNA 的提取首先是机械破碎植物细胞,可采用石英砂或氧化铝研磨法, 液氮冷冻研磨法等,在研磨液中含有 SDS 破细胞膜,蛋白酶水解除 DNA 结合蛋白,再以有机 溶剂除去蛋白,脂类和杂质,乙醇沉淀 DNA,这时的 DNA 为粗制品,含 RNA,少量蛋白质, 多糖等杂质, RNase 处理再以有机溶剂抽提和乙醇沉淀, 经 可得到较纯的 DNA 适用于一般的 分子育种工作.
三.实验材料: 幼嫩植物苗或幼叶
四.实验仪器,器皿及试剂: 仪器,器皿(见附录) 试剂: 研磨液: 0.45mol/l 0.1 mol/l 0.1mol/l 1% SDS 70%乙醇 95%乙醇 NaCl Tris-Cl (pH7.0)
EDTA-Na2
氯仿-异戊醇 (24:1) 5mol/l 3mol/l TE: 高氯酸钠 NaAC 10mmol/lTris-Cl (pH7.6) 1mmol/l EDTA--Na2 (pH 7.6) RNase: 10mg/ml
五.实验步骤:
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1. 称取植物材料 10g,野外采材要经清洗,再以 70%乙醇表面消毒后凉干. 2. 将材料置于研钵中,倒入适量液氮捣碎材料并研磨至粉状. 3. 加入 20ml 研磨液,继续研磨至糊状. 4. 加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)充分混匀,分装于离心管中,平衡. 5. 离心除渣,4,000g 10min,将上清移至一新管. 6. 72℃水浴保温 3-4min,加入 5mol/l 的高氯酸钠(体积比为 4:1) 7. 加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)充分混匀,4,000g 离心 10min. 8. 加入 2 倍体积的 95%低温乙醇,沉淀 DNA,可见白色丝状物. 9. 用玻棒搅起丝状物(搅不起的,可离心收集沉淀物),用适量 TE 溶解. 10. 加 RNase 至终浓度为 50ug/ml,37℃保温 30min. 11. 加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1), 4,000g 离心 10min. 12. 吸取上层水相,加入 1/10 体积的 3mol/l NaAC 及 2 倍体积经预冷的 95%乙醇,混匀,在 -20℃放置 30min,DNA 形成纤维状沉淀. 13. 沉淀加入 1ml70%乙醇洗涤 1 次,4,000g 离心 8min 去上清,纸帕吸干. 14. DNA 沉淀真空干燥后溶于 TE 中. 15. 将 DNA 粗制品和纯化品点样电泳,设 DNA 分子量标准,观察 DNA 纯度,分子大小. 16. 对纯化后 DNA 样品进行紫外吸收测定,计算 DNA 浓度和纯度,用坐标纸绘出 DNA 吸收曲 线. 附: DNA 纯度鉴定公式: A260nm/A230nm≥1.8 A260nm/A280nm≥1.8 DNA 浓度(ug/ml)=A260nm×50 稀释倍数
思考题: 1. 研磨液中 EDTA 的作用是什么? 2. 沉淀粗 DNA 时不要加 NaAc,而纯化后再沉淀时则要加入 NaAc,为什么?
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实验五
DNA 的 PCR 扩增
一.PCR 扩增的原理 聚合酶链式反应(polymerease chain reaction, PCR)即在 DNA 聚合酶催化 下,通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向 DNA 合成.扩增反应一般 包括 DNA 模板变性,引物与模板退火,引物延伸合成三步反应的重复过程.经 过多次循环,使一个模板分子的特定区域得以等比级数地扩增.耐热 DNA 聚合 酶(Taq DNA 聚合酶)的应用,使聚合酶能耐受 DNA 变性的高温,因而避免了 每次热变性后聚合酶失活,使扩增的三步反应实现了连续的循环, 在此基础上产 生了自动 PCR 仪. PCR 扩增的产物是由两引物界定的一段双链 DNA. 通常的 PCR 引物是一段 人工合成的寡核苷酸,在反应体系中成对存在,与 DNA 模板一定区域的两条链 分别互补.在 DNA 模板变性后的退火过程中,两引物与模板上的互补序列发生 退火复性,为 DNA 的合成提供了带 3'-OH 的引物序列,在聚合酶的催化下便可 进行引物延伸合成 DNA. PCR 反应的原理可由下图所示:
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二.实验目的 了解 PCR 的基本原理; 掌握 PCR 实验的操作方法; 运用 PCR 方法检验克隆质粒. 三.实验材料,药品及仪器 寡 核 苷 酸 引 物 , 为 pUC 质 粒 的 通 用 引 物 , 正 向 为 : GTAAAACGACGGCCAGT;反向为:CAGGAAACAGCTATGAC. 两引物的互补序列位于 pUC 质粒多克隆位点的两端,因此可将克隆 在多克隆位点的插入片段扩增出来. Taq DNA 聚合酶及其最适缓冲液(10X) 15mM MgCl2 2mM dNTPs(pH 7.0) 去离子水 PCR 薄壁管 PCR 仪 琼脂糖凝胶电泳装置 凝胶成像系统 四.实验步骤 按以下比例和浓度在 PCR 反应管中按下列顺序配制反应体系: 去离子水 10X Taq DNA 聚合酶 缓冲液 质粒 DNA 模板 正向引物 mol) 反向引物 mol) dNTPs MgCl2
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11ul 2ul 1ul 1ul(25p 1ul(25p 1ul 2ul

Taq DNA 聚合酶 总体积 20ul,混匀后置于 PCR 仪中进行自动 PCR ②PCR 仪的设置: 预变性 95℃ 变性 退火 延伸 94℃ 52℃ 72℃ 4 min 1min 1min 1min 5 min
1ul(1 U)
循环 35 次
最后延伸 72℃ ③电泳检查:
扩增结束后,在体系中直接加入 4ul 电泳载样缓冲液,在预加 了 EtBr 的 1.0%琼脂糖凝胶上点样电泳(见实验 4) .5V/cm 电场强度 电泳 45min 后,紫外线下观察凝胶,正确扩增反应可观察到目的分子 带.
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实验六
植物总 RNA 的分离
一.实验原理 真核生物的 RNA 包括 rRNA,tRNA 和 mRNA.一个典型的真核细胞约含 有 10-5~10 -6g 的 RNA,其中 80-85%为 rRNA,其余 15-20%主要由各种低分子 量 RNA 组成(如 tRNA,核内小分子 RNA 等) ,细胞的 RNA 大多都与蛋白质结 合在一起,但这种结合很容易在变性剂存在下打破.在经有机溶剂抽提后,用乙 醇或异丙醇可将其从上清中沉淀出来. RNA 提取中要严格避免 RNA 酶的污染, 因为 RNA 酶极稳定, 通常的消毒 方法难以将其灭活,而空气中细菌,真菌和操作者都有可能成为 RNA 酶的污染 源.RNA 酶污染会使分离的 RNA 大量降解. 对于 rRNA 和 tRNA 分子具有确定的大小和核苷酸序列, 当总 RNA 分离出 来后还能用电泳,密度梯度离心,层析等方法加以进一步分离纯化.而 mRNA 的分离将在后续实验中做到.
二.实验目的 认识真核生物 RNA 的组成及分离的原理; 学习 RNA 提取过程中抑制 RNA 酶活性的方法;
三.实验材料 水稻幼苗,剪取幼芽.
四.实验器具及药品 瓷研钵(组织捣碎机) ,eppendorf 离心管,冷冻台式离心机,液态氮,剪刀, 一次性手套,恒温水浴锅,真空干燥仪,紫外分光光度计,凝胶电泳装置,凝胶 成像系统等. 进行 RNA 提出的所有器皿必须保证未受 RNA 酶的污染,玻璃,瓷器和金属 耐热器皿应先以 0.1%DEPC(二乙基焦碳酸盐)水溶液浸泡 2hr,然后以铝箔包 裹后在 180℃烘烤过夜.使用新的塑料制品,并将其在 0.1%DEPC 中浸泡 2hr 并 经高压蒸汽消毒 30min.操作过程中还应严格避免外源 RNA 酶的污染.
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药品:异硫氰酸胍,CSB(柠檬酸/十二烷基肌氨酸钠/β-巯基乙醇)缓冲液, 2mol/L NaAc pH 4.0,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) ,异丙醇,75%乙醇,DEPC H2O 等.
五.实验步骤 1.称取材料 0.1g,剪成约 2mm 长段,加入液氮研磨成细粉状. 2.加入 0.2g 异硫氰酸胍和 2ml CSB 缓冲液,继续研磨成匀浆. 3.将匀浆转移至两个 eppendorf 管中,加入 0.12ml NaAc,加盖后反复颠倒离心 管 20 次. 4.每管加入 1ml 酚:氯仿:异戊醇,混匀后剧烈震动 10sec,冰浴 15min. 5.10,000g,4℃离心 15min. 6.小心将上层水相转移至新管中,注意不要吸动中间层.中间层富含蛋白质和 DNA. 7.加入等体积的异丙醇,混匀后置-20℃放置 30min 以沉淀 RNA. 8.10,000g,4℃离心 20min 沉淀 RNA. 9.弃上清,将 RNA 沉淀悬浮到 0.5ml CSB 溶液中,摇动溶液至 RNA 溶解. 10.加入等体积的酚:氯仿:异戊醇重新抽提一次,即重复④—⑧的步骤. 11.离心后弃上清,沉淀用 0.5ml 预冷的 75%乙醇漂洗一次.离心后弃上清,真 空初步干燥沉淀. 12.RNA 溶解在 0.2ml DEPC 水中,用紫外分光光度计测定 260nm,280nm,及 230nm 波长的光密度,获得 RNA 的浓度和纯度.
注:1.RNA 的浓度 C=A260×40×测定稀释倍数(ug/ml) , 纯 RNA 的 A 260/A280 比值在 1.7-2.0 之间, 若低于该值范围, 表明有蛋白质污染, 应重新进行有机溶剂抽提.若高于该范围,可能有异硫氰酸胍的残留或有核 酸的严重降解,应重新进行醇沉淀的步骤. 2.当前有很多生物技术公司生产分离 RNA 的试剂盒,如 Trizol 试剂,将异 硫氰酸胍,CSB 及苯酚混合在一起,按一定的体积与材料研磨后,即可通过 氯仿抽提和乙醇沉淀 RNA,可很方便地进行 RNA 的分离.
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实验七
RT-PCR
一.原理 RT-PCR 即逆转录 PCR,过程由两部分组成:cDNA 的合成:以 mRNA 为模板, 在逆转录酶的作用下,以 Oligo(dT)或特异的下游引物合成与 mRNA 为互补的 cDNA 片段;PCR 扩增:以已合成的 cDNA 为模板,在耐热的 DNA 聚合酶和上,下 游引物作用下进行标准的 PCR 扩增. PCR 和 RT-PCR 技术操作简单,敏感性高,已广泛应用于基因结构分析,基因表 达和基因克隆研究.
二.试剂和样品: 1.模板 RNA:根据实验二(哺乳动物细胞 RNA 的分离)的方法,提取总 RNA,适 当稀释后备用. 2.四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs,包括 dATP,dCTP,dGTP,dTTP) :用 pH7.0 的 中性水溶液先分别配成 100mmol/L 储备液, 储存于-20℃. 使用时, dATP, 取 dCTP, dGTP,dTTP 贮备液等分混匀,并适当稀释,使 dNTPs 工作液的浓度为 10mmol/L. 3.标准 PCR 缓冲液:10×缓冲液组成为:200mmol/L Tris-HCl (pH8.3,25℃), 15mmol/LMgCl2 ,250mmol/LKCl,0.5%Tween20,1mg/mlBSA(或 gelatin). 4.引物 (1)Oligo(dT) 16,合成后用水溶解,使其浓度为 500ng/ul. (2)PCR 扩增引物 本实验所用引物根据-actin mRNA 的序列设计,扩增产物的长度为 260bp.上游 引 物 : 5'-TGACGGTCAGGTCATCACTATCGGCAATGA-3' 下 游 引 物 :
5'-TTGATCTTCATGGTGATAGGAGCGAGGGCA-3' .引 物 合 成 后 用 水 溶 解, 配 制 成 100umol/L 贮备液,使用时稀释成 10umol/L 或 2umol/L. 5.TaqDNA 聚合酶:浓度为 3U/ul,为了便于准确取样,实验前稀释成 1.5U/ul (也可以不稀释) . 6.AMV 逆转录酶,缓冲液. 7.DEPC 处理的无菌双蒸水.
三.操作步骤
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cDNA 的合成 总 RNA ≤1ug(约 5—10ul) Oligo(dT)16 RNasin 5xRT 缓冲液 10mmol/LdNTPs AMV 逆转录酶 加水到 0.5ug(也可使用特异下游引物 50—100pmol) 20U 4ul 1ul 10ul 20ul
42℃保温 30—60 分钟,冰上冷却,离心数秒钟,然后进行 PCR. PCR 5ml 反应管中,按照以下顺序加入各种成分,使反应总体积为 50μl: H2O 10×PCR 缓冲液 10×dNTPs(2.0mmol/L) 28μl 5μl 5μl
扩增引物混合物(2μmol/L) 5μl cDNA 模板 TaqDNA 聚合酶(1.5U) 5μl 2μl
在冰上轻轻混匀后,离心数秒钟,放置于冰上,准备上机扩增. ⒉上机 先在 DNA 扩增仪上设置好循环程序:94℃预变性 2 分钟;94℃变性 30 秒,60℃ 退火 30 秒,72℃延伸 40 秒,共 30 个循环;72℃延伸 5 分钟.反应管放在 DNA 扩增仪的插孔中.按"START"键,循环开始. ⒊循环完毕,取出反应管,放置于 4℃冰箱备用. ⒋ PCR 产物电泳 PCR 扩增完毕,需要用凝胶电泳的方法检测扩增效果.扩增片段长度一般在 0.2kb～1.0kb,宜用 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,以φX174/HaeⅢ作为分子量标 准.如扩增片段的长度在 1.0kb～3.0kb 范围,宜用 1.0%琼脂糖凝胶进行电泳, 以λ/HindⅢ+EcoRⅠ作为分子量标准. ⑴1.5%琼脂糖凝胶的制备 称取 1.5g 琼脂糖放于洁净的 250ml 三角烧瓶中,加 100ml0.5×TBE,放入微 波炉或水浴锅内,加热至琼脂糖完全溶化透明.取出冷却至 55℃左右.加 5μ
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l10mg/ml 溴乙锭于琼脂糖溶液中,混匀后倒胶.放置半小时以上. ⑵ 点样及电泳 将制备好的凝胶放入电泳槽中,加入适量 0.5×TBE(缓冲液高于凝胶平面 2mm) , 取出梳板. 在 PCR 反应管中加等体积氯仿,混匀后,离心 2 分钟,吸出上层 PCR 产物于 另一离心管中.取 5μl 或 10 μl PCR 产物与上样缓冲液(50%甘油,10mmol/L EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯蓝)混匀,加入到凝胶的点样孔中,左侧点 φX174/HaeⅢ分子量标准(100ng) ,在 100V 稳压条件下电泳 1～1.5 小时. ⑶ 观察结果 将凝胶放置于紫外检测仪上观察.必要时可照相,记录实验结果. (主要分析: ①是否有扩增产物.②如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增.③分子量 标准电泳后区带是否分开.④与分子量标准比较,PCR 产物的长度是否正确.⑤ PCR 产物的产量) .
注意事项 为了防止皮肤上的 RNase 对样品 RNA 的降解以及脱落的细胞可能导致的假阳性结 果,做 RT-PCR 反应时应戴手套,并洗去滑石粉,擦干净. 加入试剂的量一定要准确.
常见问题及解决方法 无 PCR 产物.可能由以下原因导致: (1)无模板 DNA. (2)无 TaqDNA 聚合酶:TaqDNA 聚合酶无活性. (3)无引物或引 物已降解. (4)变性温度和时间是否已使模板 DNA 解链. (5)PCR 仪的热传递效 率. (6)Mg 2+浓度是否合适. PCR 产物呈拖尾现象.可通过下列方法解决: 提高退火温度. (2)减少 Taq DNA 聚合酶的用量. (3)试用二步法进行 PCR 扩
增. (4)调节 Mg2+浓度,使之最优化. (5)减少延伸时间. (6)减少循环次数. (7)设计新的引物. (8)采用热启动法进行 PCR. 引物二聚体. 解决方法: (1) 防止引物 3'端互补. (2)设计较长的引物. (3)增大模板的量. (4)降
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