植物基因工程

一从现代农业到基因工程

(一)粮食安全现状

1、食物总量供给已成为全球的焦点之一：

从2000年开始，全球出现了当年粮食生产量比消费量低的情况，2003年全世界粮食的消费量超过生产量0.93亿吨，世界粮食储备也降低到30年来的最低水平。

1999年以来，我国粮食连续四年减产。1999-2002年，我国粮食总产量累计减少800亿公斤左右。自2000年以来，我国粮食年消费需求大致在4.8-4.9亿吨之间，产需缺口约400亿公斤。

(二)农业发展的一个主要矛盾——科技支撑能力不强

农业生产的规模化、专业化和多样化对科技提出了更高的要求，大幅度提高农业劳动生产率需要通过先进适用技术的广泛应用，而目前我国科技进步贡献率只有45%左右，与发达国家的70-80%有很大的差距。

一个农业劳动力养活的人口数：

美国：70人；

日本：约25人；

中国：4-5人。

农业发展的根本出路是现代农业，而其核心支撑条件是现代农业科技的进步。

(三)现代农业的内涵

现代农业是以现代工业和科学技术为基础，重视加强农业基础设施建设，充分汲取中国传统农业的精华，根据国内外市场需要和WTO规则，建立起采用现代科学技术、运用现代工业装备、推行现代管理理念和方法的农业综合体系(引自卢良恕院士)。

(四)建设农业科技创新体系是现代农业的一个根本任务

国家级农业科研工作应具有较强的关键性、全局性、基础性、战略性和前瞻性的特点，为加快现代农业建设提供科技支撑。省级有关农业的科研机构应逐步实行联合，重点开展应用研究和开发研究(也可根据需要适当开展应用基础研究)，重视科技成果转化，更好地为发展生产服务(引自卢良恕院士)。

到2030年，我国人口的持续增长将要达到高峰期，预计达到16亿人口，解决这个庞大人口的口粮是一个新的挑战。

随着人民生活水平的提高，肉蛋奶和水产品的消费不断增加，粮食作为饲料的比重将越来越大，人均粮食占有量的标准应有所提高。

2、食品安全性也成为全球的焦点之一：

农业综合措施、现代农业技术尤其是转基因技术的应用，使老百姓对当前食品尤其是转基因食品安全性问题十分关心。

(五)农业科技创新的一个核心内容：良种创新

农业科技创新的核心：良种+良法。良种对增产的作用所占的比重越来越大，良种是一个先进技术的集合体。

良种创新：植物良种创新、动物良种创新。植物食品占总食品的93%，动物食品占7%，但也间接来自植物食品，所以良种创新的首要任务是植物良种创新。

(六)传统育种面临的挑战

以杂交育种为核心的传统育种技术取得了丰硕的成果，目前仍然是主要作物的主要育种手段。目前传统育种技术在改良作物性状方面遇到了一些挑战，如缺乏特别性状的种质资源，育种周期长，难以克服不良性状的连锁或负相关，易受杂交不亲和及杂种不育的限制，远缘物种间不能进行遗物物质交流和性状转移。

(七)基因工程带来的机遇与竞争

20世纪50年代以来，DNA双螺旋模型和基因操纵子学说的提出，以及DNA限制性内切酶的发现，导致了DNA体外重组技术?a?a基因工程技术的发展，推动了分子生物学和基因工程本身在广度和深度方面以空前的速度蓬勃发展，生物技术相关产业和生命科学已经出现划时代的

基因工程是依赖于精密设计的分子育种，是对传统育种的升华和补充。

2l世纪是生命科学的世纪，生物技术可能会对世界的重大问题?a?a饥饿、疾病、能源、污染等提供切实的解决办法。

生物技术正成为国际竞争的主要领域，其核心是基因工程，是强国之策。

二植物基因工程简介

1 基因工程的理论基础

2 植物基因工程的概念和目标

3 植物基因工程的性状和基因

4 植物基因工程的载体和其它DNA元件

5 植物基因工程的基本路线

1.1 生物界的不同基因之间具有相同的物质基础

所有基因均是(或可转化为)具有特定核苷酸序列和遗传功能的DNA片段，因此所有基因均可以DNA片段作为材料进行加工或工程处理。

1.2 所有生物享有相同的遗传密码规则

所有生物都由一个共同的祖先沿不同的分支进化而来，但他们都遵循中心法则(central dogma)，遗传编码规则没有改变。

1.3 基因作为DNA片段，可在体外进行人工裁剪、修饰和连接

有许多类型的工具酶可以完成这些操作：

限制酶：超过300多种，比如Eco RI、Hin dIII等等。

PCR相关的酶：如非校正性的Taq DNA聚合酶，校正性的pfu DNA聚合酶等等。

核酸修饰及其它酶类：比如Klenow大片断酶、DNA连接酶、反转录酶、末端转移酶(TdT)、DNaseⅠ、RNase A、碱性磷酸酶、甲基化酶、多核苷酸激酶等等。

通过使用这些酶，我们可以对核酸分子进行剪切、消化、连接、末端修饰、磷酸基团处理、反转录等操作，以便于克隆目标基因或形成重组DNA分子。

1.4 基因作为DNA片段，可以通过转基因技术实现从任一生物向目标生物的转化

基因操作中，基因可通过质粒或病毒载体或不需要载体，导入目标生物，现在外源DNA的转化或转染已经比较成熟。

被转入来自水母的绿色荧光蛋白(acaleph green fluorescence protein)基因

该项工作由法国科学家于2000年完成。

外源基因与载体一道被采用受精卵微注射法导入并整合到兔子基因组中。

1.5 转基因遵循同内源基因一样的遗传规律，可通过DNA复制将其遗传信息传递给子代

基因工程的外源基因可整合进目标生物的基因组中稳定遗传。DNA的半保留复制模式是高保真的。

1.6 转基因遵循同内源基因一样的表达规则，其表达可赋予特定的生物学功能

狭义概念：现在遗传工程的概念主要是指基因工程或基因操作，是指将供体生物的目标基因与载体进行重组，重组DNA分子导入受体生物体，通过表达外源基因而使受体生物产生新型遗传性状。

基因工程的三要素：供体，受体和载体。对于受体物种而言，来自供体的基因被称为?°外源基因?±。

基因工程的根本技术是DNA重组技术。这是因为除少数RNA病毒外，所有基因均是以DNA 分子的形式存在的，载体也是DNA分子，基因导入技术一般已程序化，但目标性状根本地是由各种外源基因和DNA重组技术而决定的。

转基因：作动词时表示将人工构建的外源基因转化到生物体的过程，作名词时表示被转化到生物体中的外源基因。

外源基因：指基因工程中被转入到生物体中的基因构建物，可以是其它生物的基因，也可以是受体生物本身的基因。?°外源?±主要是指转入的过程，被转入的基因不一定非得来自不同的

广义概念：指DNA重组技术，以及相关的基础研究和产业化技术的开发，典型而言包括“上游技术”、“中游技术”和“下游技术”。

上游技术：包括目标基因和其它DNA元件的鉴定、定位、克隆和功能验证。上游是获得知识产权的制高点。

中游技术：包括载体构建、工程菌株的获得、转化操作、转化后的组织培养、再生个体的分子鉴定、转化子的遗传及繁殖、转基因生物学性检测等。中游是实现转基因的核心步骤。

下游技术：包括转基因产品的中间试验、环境释放、生产性试验和产业化，如从转化体内纯化外源基因产物、推广种植或养殖具有新型性状的转基因动植物等。下游是转基因的价值的体现。在现代，基因工程与细胞工程、发酵工程和酶工程可以实现联合和互相促进。

3.1 抗虫基因

1)Bt基因：来自于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的一大类，均编码杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，又称为δ内毒素(δ-endotoxin)，能特异性杀死鳞翅目(Lepidoptera，蝶蛾类)昆虫，少数能杀死双翅目(Diptera，蝇蚊类)和鞘翅目(Coleoptera，甲虫类) 。人工培养苏云金芽孢杆菌制备的Bt制剂在植保上用于作物虫害防治已有近百年的时间，实践证明Bt蛋白对人畜无害。

Bt基因已广泛应用于多种作物的抗虫转基因，防治棉铃虫、红铃虫、玉米螟、水稻螟虫、菜青虫等，但须注意它也能杀死鳞翅目的益虫如家蚕。

2)PI基因：来自于各种植物本身，编码蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor)，对许多昆虫具有广谱抗性，可分为丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor)、巯基蛋白酶抑制剂(sulfhydryl proteinase inhibitor)和金属蛋白酶抑制剂(metal proteinase inhibitor)这三类。代表性的为豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CPTI，未发现对人畜有害。

3)凝集素(Lectin)基因：来自于各种植物，编码凝集素，主要用于防治同翅目(Homoptera)害虫如蚜虫、飞虱等。有的凝集素对人畜有毒，但目前使用的雪花莲凝集素GNA等被证明是安全的。

4)α-AI基因：来自于植物，编码α-淀粉酶抑制剂，可防治鞘翅目(Coleoptera)害虫，但许多也能抑制哺乳动物的α-淀粉酶。

5)其它基因：如几丁质酶、蝎毒素(scorpion toxin)、苦楝素(azedarachin)、鱼藤酮(rotenone) 等基因，有的有前景，有的则存在安全性问题。

3.2 抗病基因

1)抗病毒病：有病毒外壳蛋白(coat protein，CP)基因、病毒复制酶(replicase)基因、病毒卫星RNA 基因、植物或真菌核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)基因、动物干扰素基因、病毒缺陷干扰(defective interfering，DI)基因等。一些转CP基因的作物已开始推广应用。

2)抗真菌病：有抗病基因(resistance genes，R基因)、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein，PGIP)基因、抗病信号传导基因、防卫基因如病程相关蛋白(pathogenesis related protein，PR)、葡萄糖氧化酶基因等。一些转基因抗真菌病作物在西方国家已经开始推广种植。

3)抗细菌病：有抗病基因(resistance genes，R基因)、抗病信号传导基因、防卫基因如病程相关蛋白(pathogenesis related protein，PR)、昆虫抗菌肽基因、溶菌酶基因等。一些转基因抗细菌病作物也在西方国家已经开始推广种植。

4)抗线虫病：抗病基因(resistance genes，R基因)、抗病信号传导基因、防卫基因如病程相关蛋白(pathogenesis related protein，PR)基因等。

转基因抗病农作物几乎不存在食品安全性问题。

3.3 耐非生物性胁迫的基因

1)耐高温干旱：主要为渗透调节基因，如脯氨酸合成酶、甜菜碱合成酶等基因。

2)耐冷耐冻：一类是保持低温下生物膜流动性，如脂肪酸脱饱和酶；另一类是抗胞内结冰，如深海鲽鱼和胡萝卜的抗冷蛋白。

3)耐盐：如藻类和高等植物的液泡Na+/H+反向泵基因等。

4)耐缺素：对于缺氮、缺磷、缺钾、缺硼、缺钼、缺锌等，可以利用这些元素的高效吸收或高效转运蛋白基因。

5)耐土壤毒害：与重金属(如汞、镉、铅等)、轻元素毒素(如铝、砷)及其它毒素(如硫化氢等)结合使之无效化的基因。

6)耐氧化还原电位胁迫：耐缺氧基因、耐自由基胁迫基因、耐pH值胁迫基因等。

3.4 品质改良基因

1)贮藏蛋白基因：来自大豆、巴西坚果等植物的种子贮藏蛋白。

2)氨基酸改良基因：如富赖氨酸蛋白，主要用于禾谷类作物如玉米等蛋白中氨基酸比例的改良，还有富甲硫氨酸蛋白基因等。

3)维生素改良基因：如将细菌的3个关键酶基因转入水稻，创造了胚乳中富含β-胡萝卜素的“金色稻”。维生素E合成途径的基因可是用于提高植物油中的VE。

4)脂肪酸改良基因：一类是关于脂肪酸合成，另一类是关于脂肪酸脱饱和，用于增加含油量，增加或减少某种脂肪酸，增加或减少脂肪酸的饱和度，甚至生产极具医疗保健价值的特殊脂肪酸。

5)其它品质改良基因：比如棉花纤维发育相关的基因、植物淀粉合成酶基因、植物香气物质合成酶基因、植物单宁合成基因等。

3.5 作物产量改良基因

1)“开源”基因：增强植物叶片的光合作用效率的基因、根瘤菌基因工程。

2)“扩库”基因：植物果实、种子等经济器官发育相关的基因。

3)“暢流”基因：植物维管束发育及维管装载相关的基因。

作物的产量是最重要的性状，却是一个典型的多基因性状，基因工程操作的难度最大，目前几乎没有显著进展。

3.6 抗除草剂基因

1)修饰除草剂靶蛋白的基因：

EPSPS(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因：超表达或突变型能抗草甘膦(glyphosate)类除草剂如农达等，这是抗除草剂基因工程应用最广泛的。

ALS(Acetolactate synthase，乙酰乳酸合成酶)基因：该基因点突变后可抗甲嘧磺隆(sulfometuron methyl)和氯磺隆(chlorsulfuron)。

psbA基因：属于光系统II，点突变后可抗阿特拉津(atrazine)。

2)除草剂解毒的基因：

乙酰辅酶A转移酶(Acetyl CoA transferase)基因：可使膦丝菌素(phosphinothricin, PPT，草丁膦Basta的有效成分)失活。

羟化酶：是一些腈水解酶，可抗溴苯腈(bromoxyril)。

SOD (superoxide dismutase, 超氧化物歧化酶)基因：过量表达可抗百草枯(paraquat)。3.7 用于医疗保健生物活性物质基因工程的基因

1)用于超量表达植物药化成分的基因：主要是与植物药化成分合成相关的关键酶基因或调控基因，涉及各种植物中的各种各样的次生代谢途径，比如皂甙、紫杉醇、喜树碱、丹酚酸、东莨菪碱、类黄酮、原花青素、萝卜硫素等。

2)基于植物生物反应器生产药物蛋白的基因：如可以将人的干扰素、胰岛素、疾病抗体及其它药物蛋白基因，在植物中表达和生产药用蛋白。

3)其它生物活性物质相关的基因：如用于生产化妆品原料的保健蛋白或酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、金属硫蛋白基因等。

3.8 用于改良植物其它性状的基因

1)改良作物成熟期的基因：比如对CCC等基因进行超表达或沉默，可以调控植物的成熟激素乙烯的合成，进而调控成熟期。

2)调节作物株型的基因：如调控侧向生长、决定分蘖发生、叶生长速度等的基因。

3)作物贮藏品质相关的基因：如转化PGIP基因或反义PG基因的番茄等可以使果实熟而不烂，延长货架期，1994年美国已开始上市。

4)植物花色修饰基因：主要为类黄酮复合途径的基因，最典型的成就是近年来通过基因工程将红色的玫瑰变为了蓝色的玫瑰。

5)植物种子、果实或其它器官形态发育相关的基因：如番茄的大小果发育基因、花形态发育基因等。

4 植物基因工程的载体和其它DNA元件

4.1 根据载体生物特性的载体分类

1)Ti质粒：来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。

2)Ri质粒：来自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

3)病毒：植物病毒。

4.2 根据功能进行的载体分类

1)克隆载体：用于克隆目标基因进行测序等。

2)中间载体：用于装载T-DNA区、启动子、增强子、标记基因等元件。

3)卸甲载体：将诱导植物长瘤或长发状根的基因去除以后的Ti或Ri质粒。

4)转化/工程载体：用于直接转化植物，分为共整合载体和二元载体两类。

4.3 启动子、终止子和增强子

1)组成型表达启动子：最典型的如芜菁花叶病毒的CaMV 35S。

2)器官/组织特异性表达启动子：只在特定的目标器官/组织中表达外源基因，如棉花纤维发育的E6启动子、番茄果实特异表达的E8启动子等。

3)发育阶段调控型启动子：只在一些特定器官/组织分化发育的特定阶段表达，比如PG启动子只在植物果实成熟阶段表达。

4)诱导型启动子：在适当剂量的外源物质的诱导下转基因才表达。

5)终止子：有NOS、OCS、35S等。

6)增强子：比如Ω元件等，可以增加外源基因的表达强度。

4.4 标记基因和报告基因

1)标记基因：抑制非转化细胞的生长，而转化细胞由于具有抗性而继续生长和分裂，达到筛选转化子的效果。典型的有：

新霉素磷酸转移酶基因NptII：抗卡那霉素、新霉素等，用于双叶子叶植物比单子叶植物多。潮霉素基因Hyg：抗潮霉素，用于单子叶植物比双子叶植物多。

草丁膦抗性基因bar：抗除草剂草丁膦、草铵膦等，单、双子叶植物均可用。

新型标记基因：已新开发出了磷酸甘露糖异构酶基因pmi、甜菜碱乙醛脱氢酶基因badh等多种，但商品转基因食品中尚不含有。

2)报告基因：用于对转化子进行肉眼可见的表型鉴定，最典型的有：

β-葡萄糖苷酸酶基因(β- glucuronidase, gus) 基因：加底物X-gluc后，转基因组织产生蓝色物质。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, gfp)基因：在紫外光下，转基因组织发出绿色荧光。

5 植物基因工程的基本路线

5.1 从供体生物分离克隆目标基因

1) 目标基因的遗传学研究、分子标记定位，或目标基因编码蛋白的纯化与测序；

2) 构建基因组或cDNA文库；

3) 获得目标基因的探针或引物信息；

4) 标记探针，筛选文库获得目标基因，或直接通过PCR扩增目标基因；

5) 目标基因克隆到质粒载体，转化大肠杆菌，目标基因的测序和分析；

6) 目标基因及其编码蛋白的进一步功能验证和分子鉴定。

5.2 构建工程载体

1) 采用特定的限制酶切割，从克隆载体上切下并回收目标基因；

2) 选取合适的转基因骨架载体，并完成启动子、终止子等元件的亚克隆装载；

3) 采用相同的限制酶切割骨架载体，使其末端与目标基因的末端相匹配；

4) 将目标基因骨架载体进行连接，形成重组表达载体。

5.3 转化大肠杆菌和重组载体的分子鉴定

1) 制备大肠杆菌感受态细胞；

2) 将重组载体转化大肠杆菌；

3) 通过抗生素筛选获得大肠杆菌的转化子菌落；

4) 通过蓝白斑筛选初步获得重组载体而非空载体的克隆子；

5) 通过PCR、限制酶切图谱分析、测序验证等，确认重组载体克隆子。

5.4 获得农杆菌工程菌株及植物转化

1) 从大肠杆菌中抽提工程载体的质粒或病毒DNA；

2) 将工程载体导入农杆菌或病毒外壳蛋白中；

3) 一般采用农杆菌介导的二元载体转化法，将含有目标基因的T-DNA片段导入受体植物细胞中，并整合到其染色体上。

4) 或采用基因枪微粒轰击法，直接将含有目标基因的DNA转化受体植物的器官。

5) 或采用病毒接种侵染方式，将目标基因转化受体植物的活体植株。

6) 针对标记基因进行筛选，通过组织培养获得再生植株，或收获活体转化母株上的种子。

5.5 鉴定和筛选转基因植株

1) 对再生植株进行分子鉴定，如PCR扩增、GUS染色或GFP荧光检测和Southern杂交检测，得到确认外源基因转入并整合的阳性植株；

2) 对阳性植株进行RT-PCR、Northern杂交、Western杂交等检测，得到外源基因高水平表达的转基因植株；

2) 对转基因植株进行生物学鉴定与检测，确认背景性状是否改变和目标性状的改良程度，选择和保留最符合要求的转基因植株；

4) 繁殖转基因植株，并跟踪进行分子检测和生物学检测，获得目标性状和背景性状均稳定遗传的株系。

5.6 转基因植物的安全性评价和产业化

1) 中间试验：向国家申请，在控制系统内或者控制条件下进行小规模试验，并取得合格。

2) 环境释放：向国家申请，在自然条件下采取相应安全措施进行中规模的试验，并取得合格。

3) 生产性试验：向国家申请，在生产和应用前进行较大规模的试验，最终取得安全证书。

4) 大规模推广种植转基因植物。