常用分子克隆实验方法

常用分子克隆实验方法I

一、植物总DNA的小量提取

方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。

(1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液

A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管

中，55℃水浴30min；

(2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管；

(3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的

溶液B，静置3min;

(4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，

再用移液枪吸走大部分残余液体；

(5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍

吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残

液，晾干5min；

(6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm

离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。

方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。

(1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB

提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃

水浴30-60min。

(2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀，

10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。

(3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃

上清。

(4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于

离心管架上晾干5min。

(5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul

电泳检测后，低温冷藏。

二、植物总RNA的小量提取

操作前必须对枪头，桌面等进行酒精擦洗，最好戴口罩，并及时更换手套，试剂应专用，吸头与离心管应Rnase free.

方法1：离心柱法，其特点是无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，DNA污染少。

(1)充分研磨。取植物组织材料约0.1克，加入液氮尽可能充分研磨3-5min，稍后加入

约500ul溶液B，继续研磨至略微粘稠的组织匀浆；

(2) 高速离心去杂质。用1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，常温下，10,000rpm

离心5min，取上清（约400ul）至已充分甩干的吸附柱中；

(3) 核酸吸附。往柱中补加1/4体积异丙醇，静置3min，然后5000rpm离心30s，弃滤

液，滤液较多时，宜分两次，每次15s；

(4) 75%乙醇清洗。往柱中加400ul75%乙醇，10,000rpm离心15s，弃滤液。重复此步

骤一次，再将空柱子在10,000rpm离心15s，然后将柱子直接转移至新Rnase free

1.5ml管；

(5) 核酸洗脱。往柱中硅土加入45ul DEPC水，静置3min，10,000rpm离心1min，所

得滤液即为RNA样品。可取5ul通过普通琼脂糖电泳检测提取效果，样品应立即

加入0.5ul/10ul的RNA酶抑制剂，并保存于-20℃（3个月）或-70（6个月）℃。

方法2：Trizol法，结合氯仿抽提，异丙醇沉淀。

(1)充分研磨。取植物组织材料约0.1克，加入液氮尽可能充分研磨3-5min，稍后加入

约500ulTrizol溶液，继续研磨至略微粘稠的组织匀浆；或者将粉末转入1.5ml离心

管，再加500ulTrizol溶液，剧烈混合1min。

(2) 氯仿抽提。用1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，加入1倍的氯仿，振荡混

匀，10,000rpm离心3min，取上清重复抽提1遍。

(3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇，混匀，10,000rpm离心5min，弃上清。

(4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，横放于离心管架上，在

超净台中吹5min。

(5) 溶解RNA。加入DEPC处理过的水40-50ul，静置几分钟直至沉淀溶解，可通过普

通琼脂糖电泳检测提取效果，再补充加入0.5ul/10ul的RNA酶抑制剂，并保存于

-20℃（3个月）或-70（6个月）。

三、质粒小提

方法1：碱裂解法。

(1)收获菌体。摇过夜（12h以上）的菌液按1.5ml分装，冰浴，10,000rpm离心30s，

倒掉上清，倒置或晾放于离心管架上，同时用小枪头吸走管底和盖上的残液。

(2)溶菌与变性。加入预冷的溶液I 100ul，混合器充分悬浮菌液，冰浴。逐管加入溶

液IIA（2%SDS溶液，无需预冷）100ul，全部加完后每管补加预冷的溶液IIB（0.4M

NaOH溶液）100ul，快速颠倒混合5次，随加随混，并立即放回冰浴，静置3min。

(3)去蛋白和基因组。加预冷的溶液III（Kac溶液）150ul，用碗力轻摇10s，随加随摇，

并立即放回冰浴，静置3min以上，10,000rpm离心5min（也可分两次换离心管，

每次2min），吸出上清约400ul至新1.5ml离心管，冰浴。

(4)沉淀和清洗。加入2倍体积预冷的乙醇，轻轻混匀，可立即10,000rpm离心3min，

弃上清，同时用小枪头吸走管底残液。每管轻加入1ml 75%乙醇，再吸走乙醇，并

倒置或晾放5min。

(5)溶解核酸。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min后，取约

2-3ul电泳检测，-20℃冷冻保存。

四、核酸回收与纯化

方法1：溶液B柱式回收法，其特点是效率高成本低，适用于电泳和核酸溶液直接回收。

(1)溶液混合。溶液B比例为：胶回收为3倍的胶重（毫克数）或以每小孔150ul计算；

核酸溶液为3倍的体积，溶液B底限为300ul。溶胶可采用55℃水浴3-5min或直

接用混合器混合1min即可溶胶。

(2) 核酸吸附。上柱前，往混合溶液中加入1/3 B溶液体积的异丙醇有助于提高回收率。

将混合溶液移至柱中，静置3min以上，5000rpm离心30s，若溶液较多，可分两次，每次15s。

(3) 75%乙醇清洗。400ul75%乙醇，10,000rpm离心15s，弃滤液。重复此步骤一次，

再将空柱子在10,000rpm离心15s，然后将柱子直接转移至新1.5ml管；

(4) 核酸洗脱。往柱中滴加1/10 左右B溶液体积的双蒸水或TE(PH8.0)溶液（55℃预

热效果更好），静置3min以上，10,000rpm离心1min，所得滤液即为回收核酸样品。

五、RT-PCR基本方法

按照Promega试剂盒方法进行总结，融合了3’RACE技术。

逆转录阶段：（下述为20ul体系，推荐使用40ul体系）

操作前必须对枪头，桌面等进行酒精擦洗，最好戴口罩，并及时更换手套，试剂应专用，吸头与离心管应Rnase free。

(1)变性与退火。准备Rnase free 1.5ml离心管，加入：

总RNA（总样品约40ul）9.5ul（一般5-10ul）；

3’Race引物（60uM，1管约50ul） 1.5ul；

短暂离心，70℃水浴5min，常温短暂离心，冰浴。

(2) 逆转录。按顺序加入（成分及含量各试剂盒有所不同）：

MgCl2(25mM) 4ul；

10X buffer 2ul；

dNTP(10mM) 2ul；

Rnase Inhibitor 0.5ul；

常温，轻轻混合，短暂离心，加入AMV(25u/ul) 0.6ul，45℃(MMLV只能为42℃)

水浴60min。

(3) 终止反应。在刚煮沸过的水浴（99℃）中放置5min（MMLV为70℃10min），冰

浴5min，-20℃冷冻。一般每25ul PCR体系加2-3ul作模板。

PCR阶段：。

(1) PCR体系（约25ul体系）：

H (H2O) 16ul；

P (Primer) 基因特异引物1ul + 3’嵌套引物1ul；

B (Buffer) 2.5ul；

M (Mg2+) 1.5ul；

N (dNTP) 0.5ul；

E (Taq) 0.125ul；

T(Template) 2-3ul 逆转录产物；

PCR程序为：

300s 94℃；

30-35个循环：94℃30s；60℃60s；72℃60-90s；

300s 72℃

(2)回收后再PCR。确定目标条带出现的位置，进行回收后PCR（一般扩增两个模板

梯度），同时三个对照（空白，两个单条引物），全部电泳回收，T载体连接。

六、T载体构建

方法1：单酶切加T法。

(1) 质粒单酶切。取2管各约50ul 小提的PBS质粒，分别以如下100ul体系37℃酶切

6h以上（可以过夜）：

PBS或其它质粒50ul；

EcoRV Buffer（R+）10ul；

EcoRV 2ul；

ddH2O 38ul。

(2) 酶切产物回收。以3倍体积溶液B回收200ul核酸溶液（见溶液B柱式回收法），

70ul ddH2O溶解产物。取5ul稀释至50ul，测定核酸浓度，一般要求浓度100ng/ul

以上，而总量必须大于5ug。

(3) 加T反应。回收产物加水总量为77ul，100ul体系的其余组成为：

PCR buffer 10ul；

Mg2+6ul；

Taq(5u/ul) 5ul；

dTTP（100mM）2ul。

70℃水浴2h。

(4) 产物回收及检测。以3倍体积溶液B回收100ul核酸溶液，40ul TE（PH8.0）溶解

产物。取1ul跑电泳，2ul稀释到50ul测浓度。控制连接时的加入量1ul左右。

七、感受态细胞制备

方法1：CaCl2法。

(1) 摇菌。从冷藏平板上挑取（或冷冻菌液中吸取）菌后可以按先小摇（10ml以下），

再大摇（总体积放大10倍）的方法。也可以直接在装有50ml或100ml LB培养基

的500ml三角瓶中摇。对于大肠杆菌，37℃快速摇，小摇过夜，大摇3h，直接摇

需5－6h；对于农杆菌，培养基可简化为LB，28℃中速摇，小摇大摇均需过夜，

直接摇需26-28h，中间还需添加一次利福平（Rif，20mg/ml，1/500使用）。

(2) 收集菌。将菌液按10ml或50ml分装，冰浴5－10min。4℃4000rpm离心10min，

弃上清，倒置于吸水纸上3min。

(3) CaCl2处理。按每10ml管加1ml预冷的0.05MCaCl2，充分重悬细胞，再4℃4000rpm

离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上3min。

(4) 分装。按每10ml管加400ul（或600ul）预冷的含15％甘油的0.05MCaCl2溶液，

充分重悬后，以每份200ul分装于1.5ml离心管中，4℃过夜或冻存于-70℃。

八、大肠杆菌转化方法

方法1：热击法。

(1) 准备。将已连接16h以上的连接体系65℃水浴处理10min，冰浴。从-70℃取出200ul

感受态细胞，冰浴化开。

(2) 吸附。取100ul感受态细胞加入5ul连接产物或质粒，快速轻轻混匀，冰浴静置

30min。

(3) 热击。42℃水浴热击60s，冰浴3min。

(4) 恢复。加入4倍体积无抗生素的LB培养基，混匀，37℃温浴。

若用Amp（蓝白斑筛选）来选择，则可立即涂菌；

若用Kan，则需37℃摇约1h。

(5) 涂菌。涂布前一般将菌浓缩为原感受态体积，即4000－5000rpm离心5min，去部

分上清，再用枪头吹吸均匀，最后涂布至培养基表面基本干燥为止。

若为蓝白斑筛选，则培养基除含Amp (每100ml培养基加入100mg/ml原液60-80ul) 外还需预涂布50ul X-Gal（20mg/ml）和5ul IPTG（200mg/ml）。

Kan培养基（50mg/ml原液1/1000使用）则可直接涂。

一般过夜培养前，需37℃正放1h，再倒放培养12h以上。

(6) 鉴别。对于蓝白斑，应挑取白斑划线，8h后菌落PCR鉴定，再挑取相应克隆摇菌

小提，酶切鉴定。酶切一般为25ul体系，质粒20ul。

九、农杆菌转化方法

方法1：冷击法。

(1) 准备。需用于农杆菌转化的已构建好的表达载体质粒。从-70℃取出200ul感受态

细胞，冰浴化开。

(2) 吸附。往200ul感受态细胞加入3-5ul质粒，快速轻轻混匀，冰浴静置5min。

(3) 热击。快速浸入液氮，维持5min，再37℃水浴5min。

(4) 恢复。加入4倍无抗生素的LB培养基，混匀，28℃摇2－4h。

(5) 涂菌。涂布前一般将菌浓缩为原感受态体积，即4000－5000rpm离心5min，去部

分上清，再用枪头吹吸均匀，最后涂布至培养基表面基本干燥为止。培养前，需

28℃正放1h，再倒放培养48h以上。

(6) 鉴别。PCR效果不好，通常直接摇菌，再做质粒PCR，而质粒酶切效果也不好。