过柱子的知识总结

过柱子的知识总结

王宇

通常有机反应得到的产物中会混有一定量的副产物和杂质，所以需要对产物进行纯化以得到我们需要的目标产物。纯化的方法有多种，比如减压蒸馏、萃取、重结晶、色谱分离等等。它们有各自不同的适用范围，本文就总结一下柱层析分离（即过柱子）的基本知识。

由于柱层析分离是色谱分离技术中的一种，所以首先介绍色谱法的一些基本概况。

1．色谱法的基本概况

1.1 色谱法简介

色谱法是利用不同的物质在不同相态的选择性分配，以固定相对流动相中的混合物来进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。常用的色谱分离技术有柱色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法以及气相色谱法等。

1.2 色谱法的分类

首先，按照“相”来分类，色谱法可分为气相色谱和液相色谱。气相色谱包括气固色谱和气液色谱，液相色谱包括液-固色谱和液-液色谱。

按照固定相的形式来分类，色谱法可分为纸色谱、柱色谱和薄层色谱。

按照分离原理来分类，色谱法可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、排阻色谱法和亲和色谱法等。

1.3 色谱法的简要发展历史

色谱法的发展起源于十九世纪末的俄国，最先由植物学家Tswett研究时发现，他提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法，同时也被尊称为“色谱学之父”。

1941年Martin和Synge首先介绍了分配色谱法，并将蒸馏塔板理论应用于色谱分离中，使色谱方法在理论上向前推进了一步。他们二人也因为对柱层析应用的贡献而获得了1952年的诺贝尔化学奖。

1952年Martin和Games开创了气—液色谱的新领域。20世纪60年代末，法国的G·Aubouin和美国的Scott等人同时各自创立了高压液相色谱法，它与分光光度、库仑、电导、荧光等方法联用，可使分离和检测实现自动化。

到目前为止，各种色谱还在不断发展，色谱设备日益完善、操作技术不断突破，色谱分析法已成为近代化学中最重要的分离分析手段之一。

有关色谱法的整体概况这里不做重点介绍，接下来重点总结吸附柱层析分离技术的相关知识。

2．吸附柱层析的基本理论

所谓柱层析，就是将固定相装入一根被称为色谱柱的玻璃管中，在其中加入流动相洗脱剂来分离样品的方法。柱层析属于液相色谱中的液-固色谱法，实验室常用的硅胶或氧化铝柱层析都属于吸附色谱。

2.1 吸附柱层析的基本原理

柱层析的原理是根据物质在硅胶上的吸附能力不同而得到分离，极性大的物质更容易被硅胶吸附，极性小的不易被硅胶吸附。样品在随着流动相洗脱剂流下的过程中不断被硅胶吸附、解吸、再吸附、再解吸，最后达到彼此分离的目的。

2.2 液相色谱的塔板理论和速率理论

2.2.1 塔板理论

当样品组分在层析柱分离时，总会伴有谱带的展宽，这会影响到组分的分离。为了衡量一根层析柱的好坏，即色谱展宽的程度，Martin和Synge首先将蒸馏塔板理论应用于色谱分离中，把层析柱比拟成分馏塔，并假定每个塔板高度间隔内，被分离组分在两相间达到分配平衡，保留体积小的先从层析柱中流出。塔板理论虽然是半经验理论，但是可以用理论塔板数N和理论塔板高度H来衡量层析柱的效率。N越大，H越小，柱效越高。若层析柱的高度为L，则有如下公式：H=L/N

理论塔板数和理论高度虽然可以用来衡量层析柱的效率，但它不能正确反映色谱过程的实际情况，所以目前常从动力学方面，即速率理论来研究谱带展宽的问题。

2.2.2 速率理论

速率理论认为谱带扩张原因主要由三个因素引起：涡流扩散、分子扩散和传质过程。但在液相色谱中，分子扩散和在流动相中传质过程引起的谱带扩张一般很小，可以忽略。

由于层析柱装填了颗粒大小不均匀的填充剂，当溶质分子以一定速率流过层析柱时，一部分溶质分子将从柱中敞开的通道随流动相迅速通过，另一部分溶质分子将扩散进入许多弯曲的通道缓慢通过，并形成类似涡流运动。由于溶质分子在柱中的保留时间不一样，因此引起谱带扩张，用下式表示：

H P=2λd P

H P是涡流扩散提供的塔板高度，d P是填充剂颗粒的平均直径，填充剂填装越均匀λ越小。所以，若要降低涡流扩散引起的理论塔板高度，就需要用细小颗粒的填充剂并填装均匀，就会从一方面提高层析柱的柱效。

此外，在层析柱中每一个溶质分子都是连续地进入和离开固定相。当一个分子进入固定相或被吸附时，它就落后于谱带的中心，而在后面连续地移动到柱的下端。当一个分子从固定相留下来或被解吸下来，它就成为流动相的一部分，因流动相的流速往往大于谱带的流速，这个分子的移动就快于谱带中心的移动，这种不规则地前后运动引起了谱带的扩张，这属于传质过程引起的谱带扩张。

固定相中传质提供的塔板高度H S=qrd3V/D S

式中q为固定性的构型因素，r为不断随溶质和流动相的相对迁移速率变化而变化的数值，d为固定相的厚度，V为流动相的线速度，D S为溶质在固定相中的扩散系数。

所以若想降低固定相传质的理论塔板高度，从而提高柱效，可以降低流动相的流动速度，但又不能过分降低，否则会大大延长过柱子的时间。

总之，在实际的分离过程中，要结合具体情况，选择最佳分离条件，使各种因素引起的谱带扩张减小到最低程度，达到提高分离效果的目的。

3．柱层析的固定相与流动相

3.1 固定相吸附剂

实验室常用的柱层析是以硅胶或氧化铝为固定相的吸附柱层析。硅胶的性能比较温和，属无定形多孔物质，适合于分离极性较大的物质如醇、羧酸、酯、酮等，是应用最为广泛的吸附剂。硅胶可分为颗粒较粗（70-230目）和较细（230-400目）两种，前者适用于易于分离的混合物，后者适用于难于分离的混合物。

供色谱使用的氧化铝可以分为酸性、碱性和中性三种。酸性氧化铝pH为4-4.5，适用于分离羧酸和氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH为7.5，应用很广，适用于对酸碱敏感的各种化合物；碱性氧化铝pH为9-10，适用于分离胺类、生物碱等碱性化合物。

此外吸附剂的活性与其含水量有关，若吸水过多则活性变差，分离效果不好，此时可通过加热的办法使其脱水，以提高吸附活性。硅胶一般在105-110 o C恒温0.5-1 h，氧化铝在200 o C恒温4 h即可。

3.2 流动相洗脱剂

选取哪种极性合适的洗脱剂进行洗脱可通过TLC法来确定，结果就是要使产物点和副产物点在薄层板上明显分开，并且目标产物点的R f值为0.2-0.3之间。不能认为各点在薄层板上爬得越高，分离效果就越好，如果R f在0.6，也不容易在柱子上分开。因为柱子是一个多次爬板的过程，可以通过公式的比较0.6/0.8 一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。

此外，有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好，但过柱子时还是很难分开。这主要的原因就是TLC用的硅胶比柱层析用的硅胶要细得多，所以分离效果好。

解决的办法就是降低洗脱剂的极性，一般过柱子实际所用洗脱剂的极性要比TLC 选定的最佳分离效果的展开剂的极性要再降低一倍，才可以达到比较好的分离效果。当所分离物质极性跨度较大时，可用采梯度洗脱的方法，即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。

常用溶剂的极性排列顺序为：石油醚<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙腈<甲醇<水。

使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，有增加区分度的作用。实验室最常用的洗脱剂是石油醚和乙酸乙酯体系，也可以根据产物的溶解性和极性选择二氯甲烷，但是前面提到它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。有时由于洗脱剂里可能会含有少量杂质，所以在过柱子之前需要对溶剂进行重蒸。溶剂在过柱子后需要回收使用，一方面环保，另一方面也能避免浪费。此外要注意的是，一般在过柱子的同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般石油醚挥发地更厉害，会使得洗脱剂极性变大，适当时候需要注意这一点。

此外，除了分离效果外还应当考虑：(1) 在常温至沸点的温度范围内可与被分离物长期共存不发生任何化学反应，也不被固定相或被分离物催化而发生自身的化学反应；(2) 沸点较低以利回收；(3) 毒性较小，操作安全；(4) 适当考虑价格是否合算，来源是否方便；(5) 回收溶剂一般不应作为最终纯化产物的流动相，但也可以点薄层板看是否可以应用。

另外，如果过柱子的过程中发生拖尾的现象，可以加入少量氨水或者冰醋酸来解决。

4．柱层析的装置与柱子的选择

4.1 柱层析装置

柱色谱装置图如下图所示，装置包括色谱柱、漏斗、接收瓶（可用锥形瓶或试管）。实验室中所用的色谱柱常用玻璃制成，

下端配有用四氟乙烯为材料做成的活塞，这样可以不用涂抹真

空油脂，避免污染产品。

4.2 柱子的选择

色谱柱的尺寸根据被分离样品的量来确定，见表1。其直径与高度比则根据被分离混合物的难易而定，一般在1:8到1:50

之间。粗长的柱子分离效果最好，因为柱子变长能提高塔板数，图一提高分离效率；柱子变粗，硅胶上的样品半径就会变大，样品

所堆积的高度就会变小，这样能减少分离的难度。但如果分离的样品较少，选择粗长的柱子就会使得样品损失过多。所以柱子的选择还是具体问题具体分析，样品多用大柱子，样品少用小柱子。如果所需组分和杂质分的比较开，就可以减少硅胶用量，反之需要增加硅胶用量或者减小洗脱剂的极性等等。

表1 色谱柱大小及分离试样量

柱子的直径/mm 柱高/mm 试样量/g 固相吸附剂的量

/g

0.01 0.3 3.5 30

0.10 3 7.5 60

1.00 30 16.0 130

10.00 300 35.0 280

此外，实验室常用的硅胶柱层析可分为三类，即加压柱、常压柱和减压柱。压力可以增加洗脱剂的流动速度，减少产品收集的时间，提高过柱子的速度。但是这样会降低柱子的塔板数，影响柱效。所以相比较而言常压柱是效果是最好的，但是过柱子的时间也最长。

5．柱层析的操作步骤

5.1 装柱子

装柱可采用湿法和干法两种，无论采用哪种方法装柱，硅胶表面一定要平整并且不要有裂缝或气泡，虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，样品就不可能顺利地通过，无法有效分离产物。

5.1.1 干法装柱

首先，如果柱子中有砂芯，则需加入一小块脱脂棉，用长玻璃棒将其推至柱底，将其压紧，但要能保证溶液顺畅流出。然后在脱脂棉上铺一层薄薄的石英砂。再关闭柱子下端活塞，直接往柱子里填入所需用量硅胶，再用气泵在柱子上端加压，至硅胶界面不再下降为止，即硅胶已变得结实。然后从柱子上倒入足量洗脱剂，打开活塞，继续加压。可用洗脱剂多淋洗几次，可以排出气泡，使硅胶更加紧密。

此外，也可在柱子内先装大约三分之二的洗脱剂，再将硅胶加入到柱内，同时不断敲击柱子，使硅胶均匀地沉降到柱内。再把收集到的溶剂反复通过柱体几次，可适当加压排除硅胶内的气泡，使硅胶压实。

本法的优点是装柱较方便，特别是装大柱子的时候能显示速度优势。最大的缺陷在于加压使硅胶和洗脱剂混合时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热，不太适

合低沸点的洗脱剂如乙醚和二氯甲烷等，会产生大量气泡。所以如果要避免这种情况需要让硅胶压得结实，另外一定要用较多的溶剂“走柱子”，排出气泡。

5.1.2 湿法装柱

向柱内倒入一定量洗脱剂，打开活塞放出少许洗脱剂，用长玻璃棒压出柱底脱脂棉的气泡，再在脱脂棉上覆盖一层薄薄的细石英砂。关闭活塞，把硅胶用适量的溶剂拌成半透明状的均匀稀糊，充分搅拌，仔细观察没有气泡后，以玻璃棒引流倒入柱子中，然后打开活塞让溶剂流出，在上端加压让硅胶沉降，压实至所需高度后即可，此时洗脱剂液面要稍高于硅胶液面。此外要注意倒入硅胶稀糊应有耐心，以防止有气泡留于柱内。此外如果柱中已产生气泡，则可用洗耳球轻轻敲打柱子两侧，让气泡排出。本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。

5.2 上样

上样的方法也可分为干法上样与湿法上样。上样的基本要求是使样品以尽可能小的厚度上到柱子上，采用哪种方法应根据样品的实际情况而定，无论哪种都要求样品中不含大于淋洗剂极性的溶剂。

5.2.1 湿法上样

适合湿法的样品应该是室温下粘度不大的均匀液体样品或者在小极性溶剂（极性不大于淋洗剂）中溶解度非常好的固体样品用于溶解样品的溶剂体积应越少越好。打开活塞，控制柱子上方溶剂恰好流干时关闭活塞，即用滴管吸取样品，沿柱子内壁于硅胶面上方0.5 cm以内距离均匀地加样，待样品布满硅胶面后打开活塞，继续加样，要保证不出现气泡。待所有样品上完后，用尽可能少的溶剂洗剂样品瓶，待样品在硅胶上恰好走干后依上样法将溶液加到硅胶上。另取干净滴管从上样处上方沿柱子内壁淋洗，确定所有样品开始在柱子中展开后可加入大量溶剂开始过柱。若担心上样及加溶剂过程中会将柱子表面弄破可考虑在上样前先在柱子上加一层石英砂。

但是如果有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF或DMSO 等，会随着溶剂一起走），这时就必须用干法上柱了。

5.2.2 干法上样

干法就是把待分离的样品用少量低沸点大极性溶剂（实验室常用乙酸乙酯）溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋蒸掉溶剂，如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层，注意保留足够的溶剂使加入的粉末恰好能被覆盖以防柱子开裂，溶剂太多也不好，相当于增加了上样厚度。此时加入的粉末层中可能会有大量的气泡，但由于是松的，可以用玻棒稍做搅拌以除去气泡，同样要保持硅胶表面的平整。关于干法上样的样品和硅胶比例问题，只要保证在旋干后固体是均匀的，不能看到有样品颗粒析出就行，若有则应重新用溶剂溶解后再加入硅胶重新抽干。

此外，上样完成后可以在硅胶的最上层填上一小层石英砂或再加少量硅胶，防止添加洗脱剂的时候，使得样品层不整齐，影响分离效率。

5.3 洗脱与收集

将配好的洗脱剂沿着柱子内壁缓慢加

入进去，打开活塞，让洗脱剂慢慢留下，

开始洗脱。在洗脱过程中，注意随时添加

洗脱剂，以保证硅胶被洗脱剂覆盖，切不

可使其暴露在空气中。接收洗脱液时，一

般用试管或者小的锥形瓶等量连续收集。

若洗脱剂的极性较强，则每份收集的量就

要稍小一些。

此时的收集过程也是对过柱子进程的

一个监测过程。一般是通过TLC来监测进图二程。当柱子内第一个色谱带下来时，反映在TLC板上就是最上面的点出现，此时用第一个接受瓶接收。如果TLC板上第一个点已消失且第二个点还未出现，则换用第二个接受瓶进行接收。如果在前一个点还未消失但下个点开始出现时，也应换一个接受瓶进行接受新的组分，直至前一点完全消失，再换用新的接受瓶接收纯组分。按此步骤直至接收完所有组分。

此外，洗脱的速度也是影响层析柱分离效果的一个重要因素。如果洗脱剂流速较慢，则样品在色谱柱中的保留时间就长，各组分在固定相和流动相之间就能得到充分的吸附，使其更容易分离。但如果混合物在柱中保留时间太长，则可能由于各组分在溶剂中的扩散速度大于其流出速度，从而导致色谱带变宽，相互重叠影响分离效果。因此洗脱速度要适中，中小柱一般以1-5滴/秒的速度为宜，所以可以适当地选择加压柱来进行洗脱。

5.4 合并产物与后处理

将纯的目标产物合并收集，然后将其旋蒸浓缩。回收的溶剂可作为下次过柱的流动相继续使用。对浓缩后的纯组分点板，观察在TLC板上是否为一个点。若不是，则考虑重新过柱或者进行重结晶。

当所有组分都分离出来以后，可用大极性（一般为甲醇）再冲洗一遍柱子，然后将柱子压干（或抽干），干燥硅胶一段时间，以方便取出硅胶和清洗柱子。

5.5 柱子的洗涤

过柱子完毕后，由于柱子内还含有洗脱剂，所以此时要想将里面的硅胶取出是非常困难的。一种的可行的办法是将使用加压泵，通过空气流通使洗脱剂挥发，而后将柱子倒置，用洗耳球从柱子的底部吹起，将里面的硅胶吹出，同时将其收

集好。要注意的是此操作一定要在通风橱内进行，以防止硅胶被吸入身体内。6．柱层析操作中的注意事项

（1）装柱子的时候需要小心，不能将硅胶吸入肺中，日积月累可能会引起肺部疾病。所以过柱子一定要在通风橱内进行。

（2）实验前需要检查柱子是否有裂缝，否则在过柱子的过程中一旦加压，就会导致柱子爆裂，容易造成人身伤害。

（3）尽可能少用有毒易燃的溶剂作为洗脱剂，比如氯仿、乙醚等等。

（4）柱子中不能有气泡和水，否则会影响分离效果。

（5）在过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大。

（6）在装柱上样完毕后，可以在样品上面再铺上薄薄的一层硅胶，这样可以防止添加洗脱剂时冲坏硅胶表面，影响分离效果。

（7）在装柱和洗脱的过程中，硅胶上面要始终保持有洗脱剂覆盖，不能使其暴露在空气中，如果流干后再添加洗脱剂，易使柱内产生气泡和裂缝，影响分离效果。

（8）收集洗脱液的试管或者锥形瓶的大小要以样品的量而定。少量样品如果用大试管来收集，可能一根试管就会收集多个组分，如果分离量大而用小试管收集，那又会导致工作量加大。

（9）若待分离组分为极性较大的胺，可加少量氨水或者三乙胺到洗脱体系中，以减少胺在柱中的拖尾现象。同样，加入少量冰醋酸到洗脱体系中，也可以减少酸在柱中的拖尾现象。