产纤维素酶菌种的研究开题报告

一、研究的目的及其意义

1.意义：能源危机这个时代沉重不可避免的话题以及同样重要的环境污染问题需要更加重视。纤维素乙醇作为新的清洁能源的一支,正在备受瞩目的开发研究之中。当前获得的纤维素酶的活性偏低,满足不了工业化生产的要求。虽然微生物可以直接降解天然的纤维素原料,但是,已知的纤维素酶却不能直接高效的降解结晶纤维素。如何快速有效地获得高活性的纤维素酶及产酶菌株成为了研究的热点之一。本实验利用刚果红脱色圈法,从多种含降解纤维素的自然环境中,得到高纤维素酶的细菌,进一步进行紫外诱变处理,获得酶活显著提高且具有遗传稳定性的菌株,最后通过单因素优化实验,初步确定较优的培养条件。这对利用木质纤维素原料的发酵制备燃料乙醇,解决当今世界所面临的环境污染、资源和能源危机等问题具有一定的现实意义。

2.目的

①了解产纤维素酶微生物分离的基本原理和方法；

②掌握筛选原则与操作方法；

③掌握纤维素酶活力检测原理与方法；

④掌握诱变育种原理与紫外诱变的操作方法；

⑤掌握优化方法；

⑥掌握发酵罐的基本操作；

⑦了解正交分析方法。

二、国内外的研究现状和发展趋势

据估计,通过植物的光合作用,地球上每年合成的植物量约达1.8*1011t,其中有一半是纤维素物质[1,3],我国每年农作物稻秆?产量达6xl08t之多,利用微生物产生的纤维素酶,将这些闲置的纤维素资源水解转化,则可以在能源、词料、食品、纺织、造纸等方面得以有效利用[4,6],不仅可以减少因堆弃和焚烧对环境带来的污染,还将带来的巨大的经济效益和社会价值。

能源危机和环境污染的凸显,使得可再生清洁能源之一的生物质乙醇的进一步研发迫在眉睫。虽然国内外对于发酵工艺和代谢工程的研究较为广泛,但是目前取得的进展仍然存在较大的不足。一方面,人类获得的纤维素酶酶活力偏低,且不能直接高效降解天然结晶的木质纤维素。另一方面,自然界的大量微生物却可以直接快速的利用天然的木质纤维素来迅速繁衍。筛选并获得高活性的纤维素酶及其菌种,对于纤维素乙醇的研究具有重要意义。

三、研究的主要任务

1.调查并充分查阅资料；

2.设计实验方案；

3.样品的采集与处理；

4.实验操作的准备；

5.详细的实验流程；

6. 实验结果处理及计算。

四、试验方案初步设计

本实验以产纤维素酶的菌种为研究对象，进行分离鉴定和培养条件的优化，以及对其所产的纤维素酶进行酶活检测等。包括六个实验项目：（一）产纤维素酶菌种的分离；（二）产纤维素酶菌种的筛选与保藏：（三）纤维素酶活力检测及酶学性质研究方法；（四）产纤维素酶菌种诱变育种条件优化；五）产纤维素酶菌种产酶条件优化;（六）结果分析、正交设计及发酵罐放大培养条件研究。

五、研究方法及步骤

（一）产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定

1.实验内容：筛选平板的制作→取土样→土样处理→稀释涂布→培养观察→染色筛选。

2. 实验原理：本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤

维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。

3. 实验流程：土样采集→实验器材灭菌→无菌水的制备→筛选培养基配制及倒平板→土样预处

理及梯度稀释→倒平板涂布→培养、观察、记录。

（二）产纤维素酶菌种的筛选与保藏

1.实验内容：编号→接种保藏→刚果红染色→洗脱比较→挑选菌种→转接保藏。

2. 实验原理：刚果红能和纤维素结合，纤维素酶能水解纤维素，从而使刚果红在产纤维素酶菌

株周围结合到纤维素而形成透明圈，从而选择目标菌落。利用微生物的纯培养以确定分离所得的最佳产酶微生物，并进行保存与进一步研究。通过酶活测定确定初筛菌株的产酶性能；

通过培养条件的控制而菌种休眠实现保藏。

3. 实验流程：编号（选择透明圈与菌落直径比值较大，分离效果较好）→接种→培养

（三）纤维素酶活力检测及酶学性质研究方法

1.实验内容：①梯度标准G溶液→DNS显色→540nm分光光度计检测→绘制标曲

②发酵液与空白→滤纸反应→终止反应→显色→检测→计算→选择菌种

③菌种斜面→接种保藏→备用

2. 实验原理：本实验使用强碱终止分解反应，通过DNS法进行吸光度的测定。根据相应的标准

曲线，运用比色法可以推算出反应液中葡萄糖的生成量，进而推算出酶的活力。

3. 实验流程：制种子液→制备纤维素酶原酶液→纤维素酶的测定（按下表比例稀释成不同葡萄

糖浓度溶液→显色反应）→滤纸酶活性（FPA）测定→菌种传代保藏

（四）产纤维素酶菌种诱变育种条件优化

1.实验内容：斜面菌种→稀释涂布→紫外诱变→暗培养→观察筛选

2. 实验原理：本实验以紫外线作为诱变剂，通过紫外线照射，使菌种基因发生突变，然后从变

异的菌种中选取功能符合要求的菌种，进行培养，得到我们所需的菌种。

3. 实验流程：斜面菌种梯度稀释→涂布→紫外诱变→暗培养→刚果红平板染色→菌种鉴定（五）产纤维素酶菌种产酶条件优化

1.实验内容：①改变碳源（氮源、无机离子、生长因子）的种类与用量→培养→检测→分析确定

结果

2. 实验原理：以酶活为指标，通过单因子实验及正交实验，确定各因素对产酶影响的大小及最

佳发酵产酶条件。

3. 实验流程：菌种活化及摇瓶种子制作→产酶培养基选择→碳源的选择→氮源的选择→无机盐

的选择→培养基优化→产酶发酵条件选择→发酵产酶的培养基初始PH选择→发酵产酶的摇床转速选择→发酵产酶接种量的选择→装液量对发酵产酶的影响→发酵产酶的发酵时间选择

（六）结果分析、正交设计及发酵罐放大培养条件研究

1.实验内容：①设计正交实验优化培养基与培养条件

②发酵管的消毒→接种→中间取样检测→发酵结果观察

2. 实验原理：正交试验设计（orthogonal experimental design）是研究多因素多水平的又一种设

计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，整齐可比”的特点，正交试验设计是分析因试设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。

3. 实验流程：因素水平的确定→正交表的选择→分析数据

参考文献

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