斑马鱼胚胎培养pdf
“斑马鱼胚胎”资料文集
“斑马鱼胚胎”资料文集目录一、不同寄主植物桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育毒性及机制研究二、17乙炔雌二醇对斑马鱼胚胎发育的致畸作用及其基因靶位三、斑马鱼胚胎集成测试技术在复合污染毒性评估中的应用四、雄激素1,4雄烯二酮和雄烯二酮对斑马鱼胚胎昼夜节律和下丘脑垂体性腺轴通路中基因转录表达的影响五、不同形态微塑料和汞对斑马鱼胚胎发育毒性联合作用研究六、斑马鱼胚胎模型评价内分泌干扰物的类雌激素效应不同寄主植物桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育毒性及机制研究本文旨在研究不同寄主植物桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育的毒性及作用机制。
采用浸泡法将桑寄生水提物暴露于斑马鱼胚胎，观察胚胎发育情况，并通过分子生物学手段探讨其作用机制。
结果表明，不同寄主植物的桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育具有不同程度的毒性，其毒性可能与其成分及含量有关。
同时，发现这些水提物可能通过影响相关基因的表达，进而影响斑马鱼胚胎心脏发育。
本研究为桑寄生的安全性评价及资源利用提供了科学依据。
桑寄生是一种常见的植物寄生虫，能寄生于多种植物上，其生长过程中会从寄主植物中获取营养。
近年来，桑寄生作为一种中药材受到了广泛关注，但其活性成分及对生物体的影响仍不明确。
斑马鱼作为一种理想的生物模型，具有与人类相似的生理特征，其胚胎发育过程透明可见，便于观察。
因此，本研究选用斑马鱼作为实验模型，研究不同寄主植物桑寄生水提物对胚胎心脏发育的毒性及作用机制。
分别收集寄生于不同植物的桑寄生样品，按照文献报道的方法制备水提物。
将桑寄生水提物配置成不同浓度，采用浸泡法处理斑马鱼胚胎。
分别在暴露后72小时观察胚胎发育情况，记录心脏发育相关指标。
采用实时荧光定量PCR技术，检测处理组和对照组胚胎中相关基因的表达水平。
不同寄主植物桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育的影响实验结果表明，不同寄主植物的桑寄生水提物对斑马鱼胚胎心脏发育具有不同程度的毒性。
随着暴露时间的延长，心脏发育相关指标逐渐受到影响。
斑马鱼的胚胎发育和行为观察
观察
汇报人：XX
2024-01-11
• 斑马鱼基本概述 • 斑马鱼胚胎形态学观察 • 斑马鱼胚胎生理学观察 • 斑马鱼行为学观察方法与技术 • 斑马鱼行为学观察实例分析 • 总结与展望
01
斑马鱼基本概述
斑马鱼生物学特性
体型特征
食性
斑马鱼体型修长，侧扁，成鱼体长34厘米，呈纺锤形。体色为银蓝色或 银色，有数条黑色纵纹贯穿全身，形 似斑马线。
原肠胚期
原肠胚期是胚胎发育的重要阶段之一。在这个阶段，胚胎 内部细胞进一步分化形成中胚层，并开始形成消化管、神 经管等器官原基。
孵化期
孵化期是胚胎发育的最后阶段。在孵化前，胚胎内部器官 基本发育成形。随着孵化过程的进行，胚胎逐渐破膜而出 ，成为幼鱼。
02
斑马鱼胚胎形态学观察
受精卵形态与结构特点
受精卵呈圆球形，透 明度高，直径约 1mm。
受精卵表面有一层坚 韧的卵壳，保护胚胎 免受外界损伤。
卵黄囊较大，占据受 精卵的大部分体积， 为胚胎发育提供营养 。
卵裂期及囊胚期发育过程
卵裂期
受精卵经过连续多次快速分裂，形成多细胞胚胎。此阶段细胞数量增加，但胚 胎总体积基本不变。
囊胚期
细胞继续分裂并重新排列，形成囊胚。此时胚胎内部出现空腔，即囊胚腔，细 胞开始分化为内细胞团和外层细胞。
02
攻击性
在争夺领地、配偶或食物等资源时，斑马鱼可能会表现出攻击性。攻击
行为包括追逐、撕咬等，旨在将竞争对手赶出领地或获取所需资源。
03
行为影响因素
领域性和攻击性行为受到多种因素的影响，如个体大小、健康状况、环
境压力等。较大的个体通常更具攻击性，而环境压力可能导致斑马鱼的
(标准)斑马鱼胚胎原位杂交material&protocol
公司产品；
１ 显微注射用针，由Ｄｕｍｎ 公司 １ 毛细玻璃管拉制而成； ３ ． ｒｍｏｄ ０ 川
１． ４拉针仪 （ＥＡ Ｐ ） ＨＫ Ｐ ５ ，日本 ＨＫ 公 司产 品； Ｉ ＥＡ １． ５荧光解剖镜 （Ｘ－２ ，日本 ＯＹＰＳ ＳＺ １） ＬＭＵ 公司产 品； １． ６数码相机 （９５ ， 本 ＮＫＮ Ｅ９ ） Ｆ Ｉ ＩＯ 公司产品 ； 主要试剂、试剂盒 、酶 、载体和菌株
１ ．各种限制性内 切酶、 ４ＤＡ Ｔ－Ｎ 连接酶、 ｌ ｏ 片段均为Ｎｗ ｇａｄ ｌｂ 公司 Ｋｅ ｗ ｎ ｅ Ｅ ｌｎ Ｂｏａｓ ｎ ｉ
产 品；
２ ＰＲ 应试剂， ． 反 Ｃ 包括： ａ 酶、 应缓冲液、 ＮＰ Ｔｑ 反 ｄＴ 等均购 自 上海申 能博 彩生物公司： ３ 位杂交试剂：Ｓ６ ．原 Ｐ ＲＡ聚合 （ ５ 反应缓冲液和 ｌ ｍ Ｄ Ｎ 酶含 ｘ ０ Ｍ ０ Ｔ Ｔ溶液） Ｔ Ｒ 、 ７ Ｎ Ａ
Ｓ Ａ Ｔ ｇｎｃ ｏｄ 部分序列 ５ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｔ３ Ｍ Ｒ Ｏｉ ｕｌｔｅ ｌｏ ｅ ｉ ＇ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ ＴＴ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ －’ － 作为５ ＇ 端
Ｐ Ｒ引物 ，进行 Ｐ Ｒ扩增 ｃ Ｎ Ｃ Ｃ Ｄ Ａ． Ｐ Ｒ反应 体系： Ｃ Ｆｒ－ｔｎ ｃ Ａ ｄ Ｎ ｉｔ ｒ ｓ Ｓａ Ｄ １１ ４ １Ｘ Ｒ ｅ ｂｆ ｒ ０ Ｃ ｕ Ｐ ５１ ４ ５ Ｘ Ｔ Ｍｉ Ｐ ｘ ０ Ｎ ｄ １１ ４
斑马鱼平滑肌特异性基 因 Ｓ ２ 的克隆 、表达和功能研究 Ｍ２ ａ
Ｌｎ，９７０ ｏｇ １９） Ｐ Ｒ产物克隆到 Ｔ ｅａ ｖ ｃｏ Ｃ － ｓｙ ｔｒ上，通过连接 、转化 、小量抽提 、限制性 内切酶 ｅ 酶切、电泳 鉴定出正确克 隆，具体步骤参考 《 子克 隆实验 指南 （ 分 第三版 ） ，并通 过测序 验证 其正确性 。大量抽提 Ｇ Ｔ －ｃ Ｎ Ｔ质粒 ，分 别采 用 限制性 内切 酶 Ｓｌ ＡＡ １ Ａ－ Ｄ ａ ｌ
斑马鱼早期胚胎发育囊胚sphere时期的蛋白组学研究
本研究以高通量和高灵敏度的 ｉＴＲＡＱ蛋白 质组定性定量技术为基础，结合高效液相色谱串 联质谱法 （ＬＣＭＳ／ＭＳ），检测斑马鱼胚胎发育 ｓｐｈｅｒｅ时期蛋白质表达情况，探索新的蛋白质，并 进一步分析这些蛋白质的生物学功能，从而获得 不同蛋白在该时期的表达情况及其参与的生物 学过程，以期为进一步研究斑马鱼胚胎发育过程 及其调控机制提供基础数据和参考。
文章编号：１００４－２４９０（２０１９）０１－００５３－１２
斑马鱼早期胚胎发育囊胚 ｓｐｈｅｒｅ时期的蛋白组学研究
陈 漪１，２，３，胡瑞芹１洋生物科学国际联合研究中心（上海海洋大学，中国科学技术部），上海 ２０１３０６； ２．水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室（上海海洋大学），上海 ２０１３０６； ３．水产科学国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 ２０１３０６）
斑马 鱼 胚 胎 发 育 至 ４ｈｐｆ即 胚 胎 球 型 期 （ｓｐｈｅｒｅ），是介于囊胚（ｂｌａｓｔｕｌａ）和外包（ｅｐｉｂｏｌｙ）
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色斑马鱼胚胎的全组织免疫化学染色被广泛应用，这一技术需要额外的步骤来固定和通透以确保卵膜能够完全被溶液渗透。
固定、封闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要比正常的免疫细胞化学/免疫组化更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。
实验步骤：1. 将胚胎置于5ml的器皿中固定1h。
固定液的选择要谨慎，取决于两点：一是对于同一种抗体，在冰冻切片中成功使用的固定液，可用来做全胚胎染色实验，二是根据目的蛋白。
可用4%的多聚甲醛或者预混合的固定液来固定，预混合的固定液十分适合于神经蛋白。
使用Pasteur移液管来移动胚胎、吸取溶液，这有利于防止来自于移液管窄末端对胚胎的损坏。
2. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。
3. 将胚胎置于冰丙酮/PBS混合液中8分钟。
丙酮可用帮助通透坚固的卵膜，对于其他样品如鸡和鼠这一步可省略。
4. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。
5. 用封闭液（含1%Triton、10%胎牛血清的PBS）室温孵育胚胎1h。
6. 阻断过氧化物酶：将胚胎置于含0.1%H2O2的封闭液中4°C过夜。
7. 用封闭液清洗胚胎2次。
8. 将Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其转移胚胎。
加入合适浓度的一抗。
一般在全胚胎染色中抗体孵育的时间比较久，为了防止微生物的生长，在稀释一抗的封闭液中会加入0.02%的叠氮化钠。
9. 样品在混合器上4°C缓慢旋转孵育1-4天。
根据不同的抗体以及胚胎的大小，孵育的时间需要进行一些优化。
10. 用含1%Triton、10%胎牛血清的PBS清洗胚胎3次，每次1h。
11. 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分钟。
12. 用DAB底物室温孵育胚胎2-3h。
13. 将胚胎转移到一个碟子中，加入新鲜的配制的显示底物（每1mlDAB加5ul的过氧化氢）。
14. 用PBS清洗3次，使得样品达到理想的染色强度。
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧引言：转基因技术是现代生物技术的重要组成部分，通过改变生物体的基因组，使其具有新的特性或功能。
斑马鱼作为一种常见的实验动物模型，被广泛应用于生物学研究中。
本文将介绍转基因斑马鱼胚胎养殖技巧，帮助研究者顺利进行相关实验。
一、斑马鱼胚胎的获取斑马鱼胚胎的获取是进行转基因实验的第一步。
通常情况下，斑马鱼胚胎可以通过自然产卵或人工授精获得。
为了提高产卵的效率，可以将斑马鱼置于特定的环境条件下，如适宜的水温和光照条件。
此外，还可以使用药物刺激促进斑马鱼产卵。
对于人工授精，可以将雄性和雌性斑马鱼分别放入相同的容器中，利用它们的自然产卵和受精过程来获得胚胎。
二、胚胎的培养获得斑马鱼胚胎后，需要进行胚胎的培养。
首先，将胚胎转移到培养皿中，添加适宜的培养液，如E3培养液。
E3培养液中含有必需的营养物质，可以为斑马鱼胚胎提供所需的营养。
同时，保持培养皿中的水温和光照条件也非常重要，通常将其保持在28-30摄氏度，并提供适量的光照。
三、转基因技术的应用在斑马鱼胚胎培养的基础上，可以进行转基因技术的应用。
目前，常用的转基因技术包括转基因敲除和转基因过表达。
转基因敲除是通过将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其失去特定基因的功能。
而转基因过表达是将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其在特定生理条件下过度表达。
这些转基因技术可以帮助研究者研究特定基因的功能和调控机制。
四、转基因斑马鱼胚胎的鉴定进行转基因实验后，需要对转基因斑马鱼胚胎进行鉴定。
常用的鉴定方法包括PCR、荧光显微镜观察和基因测序等。
PCR是一种常用的分子生物学技术，可以通过检测特定基因的存在来鉴定转基因斑马鱼胚胎。
荧光显微镜观察则是通过检测转基因斑马鱼是否发出特定颜色的荧光来鉴定。
基因测序则可以直接确定转基因斑马鱼胚胎中特定基因的序列，从而进行准确的鉴定。
五、转基因斑马鱼胚胎的进一步研究鉴定转基因斑马鱼胚胎后，可以进行进一步的研究。
例如，可以观察转基因斑马鱼胚胎在不同生理条件下的表型变化。
斑马鱼的原位杂交技术
斑马鱼的原位杂交技术整理人邵明:将特定时期的斑马鱼胚胎在多聚甲醛中C4%4o固定过夜第一天：、洗1PBST2x5min、剥膜2、洗3PBST5min可选步骤蛋白酶处理前的胚胎不处理(: K: 24hpf, 24hpf-的胚胎蛋白酶处理分钟以后的胚胎处理半小时48hpf10ug/ml K15, 48hpf,然后洗PBST3x5min)、C5min4hyb- 65o孵育、C4h（可选步骤: 可将胚胎置于hyb+中-20oC长期储存）5hyb+ 65o孵育、加探针(探针孵育置于冰上65oC10min, 5min, 655oC-孵育过夜65oC先将然后使用).第二天：、回收探针, I2x30min1（探针可以重复使用10次以上）洗液孵育探针的温度、洗液孵育探针的温度2II 1x15min、洗液孵育探针的温度3III 2x30min、室温4MABT 3x5min、封闭液孵育室温5 4h、AP, 4oC (-20oC, 61:2500 Anti DIG-稀释于封闭液中孵育过夜稀释好的抗体保存于可重复使用3次以上。
)第三天、回收抗体1、2MABT 2x30min3、PBST 2x30min、平衡缓冲液左旋咪唑4+0.5mg/ml （60mg/ml左旋咪唑储液稀释120倍）孵育10min、显色液中孵育直到信号足够强为止。
5试剂配方固定液: 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde）in 1XPBSWeigh 2 g PFA and dissolve it in 50 ml 1XPBS. (PFA is hard to dissolve.) Incubate the mixture at 65oC for around 2 hours. Shake the mixture during the incubation). After dissolved, the solution is stored at 4oC.10XPBS stock solution: mix 76 g NaCl, 9.9 g Na2HPO4, 3.6g NaH2PO4. Dissolve them in less than 1 liter nanopure water, adjust to pH7.0 and a final volume of 1 liter. Autoclave for 35 minutes to sterilize.130 mM NaCl = 10 X 0.13 X 58.44=76 g NaCl7 mM Na2HPO4 = 10 X 0.007 X 142 = 9.9 g Na2HPO43 mM NaH2PO4 = 10 X 0.003 X 120 = 3.6 g NaH2PO4Paraformaldehyde (PFA) (Mallinckrodt 2621).（注意所用的试剂有没有结晶水）Proteinase K (Sigma P-2308); Stock solution (10 mg/ml = 10 ug/ul): weigh 10 mg proteinase K and dissolve in 1 ml nanopure water. Aliquot 50 ul each and store at -20oC. Thaw at room temperature before usage. Long storage may appear to see white precipitate after thawing. V ortex the tube and make sure the precipitate be mixed evenly.20XSSCFor 1 liter: 1 X 3 mol = 3 X 58.44 =175.3 g NaCl1X 0.3 mol = 0.3 X 294.1 = 88.2 g Na3.Citrate.2H20adjust pH=7 using HCl. autoclave 35 minutes for sterilizeization.（注意所用的试剂有没有结晶水）Yeast RNA: dissolve 50 mg RNA in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oC肝素（Heparin） (Sigma H3393): dissolve 50 mg heparin in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oCMAB X 2 liters pH7.5100 mM Maleic acid (Sigma M-0375) = 23.2 g (2 X 0.1 X116.1)150 mM NaCl = 17.5g (2 X 0.15 X 58.44)add solid (? g) to adjust pH=7.5, autoclave for 35 minutes to sterlize.Blocking regent (1096 176, Boehringer Mannheim, now Roche?). 10% stock solution. Weigh 10 g blocking regent and dissolve it in 100 ml MAB, shaking and heating in a microwave oven for 1 minutes (?), autoclave for 25 minutes and then aliquot into 14 ml and store at -20oC.50mg/ml 酵母RNA：称取2g酵母RNA干粉（生工），加入40ml去离子水，超声振荡溶解，-20oC保存。
分子生物学实验技术斑马鱼胚胎显微注射实验步骤
斑马鱼胚胎显微注射实验步骤：显微注射是指在显微镜下操作的微量注射技术。
可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。
是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。
显微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。
这些可以注射进细胞的物质包括有：各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。
运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验。
斑马鱼个体小，养殖成本低，能大规模繁殖，胚胎透明，体外发育，肉眼可见，因此斑马鱼胚胎是很好的开展显微注射的材料。
1、主要试剂的配制（1）胚胎培养液的配制称取0.8g NaCl、0.04g KCl、0.00358g Na2HPO4、0.006g KH2PO4、0.144g CaCl2、0.246g MgSO4•7H2O、0.35g NaHCO3、0.06g 青霉素、0.1g 链霉素加入含有800mL 灭菌水的1L烧杯中，搅拌至完全溶解，再用灭菌水定容至1L。
（2）显微注射指示剂的配制称取0.1克酚红溶于5ml灭菌的蒸馏水中，配制成2％的母液。
先用1mm滤膜过滤后，再用0.22mm的滤膜再次过滤，然后储存在-20℃冰箱里备用。
2、显微注射操作（1）注射针头的拉制：装上一根直径为1mm的毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。
设定参数为：Heat-600, Pull-55, Velocity-80, Time-10。
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斑马鱼胚胎培养
胚胎培养
收集卵细胞放置于一个浅盘，解剖显微镜下观察。
用吸管转移看似健康卵细胞(见健康卵细胞)至装有新鲜体系水的250 ml烧杯。
吸取胚胎细胞时尽量避免吸入任何残渣减少污染机会。
每一个烧杯200ml水中胚胎系统不应超过25个。
烧杯中的水需每天更换。
第四天开始喂养胚胎细胞。
喂养培养的活草履虫饵料(见饲养草履虫)或喂它们Liquifry
饲料,可以在任何热带鱼商店购买。
5ml活草履虫或容器中说明的Liquifry饲料量。
每日喂养两次。
9天，转移鱼苗至1/2加仑的容器，继续喂养Liquifry饲料，或混有幼鱼鱼食的草履虫或者活的丰年虾幼虫。
（可在任何热带鱼商店购买到丰年虾卵。
）
14天，停止使用Liquifry饲料或草履虫喂养，只用幼鱼鱼食或丰年虾幼虫喂养。
21天，幼鱼转移至常规鱼缸。
不要忘记，此阶段大鱼吃小鱼，应隔离饲养。
健康卵细胞
1.健康卵细胞是透明的，可以每隔20-40min观察到分裂状况，或者置于解剖显微镜下观察。
2.不良卵细胞看起来不透明，发白，或者是顶部凝固态的永久单细胞卵。
注意：第二种状态有时很难分辨，需要实践，没有细胞分裂，可以将其分离。