实验二 细胞核与线粒体的分离与观察
实验二细胞核与线粒体的分离与观察
一、实验目的
1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。
2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。
二、实验原理
细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。
从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。
分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为
竞争性底物削弱蛋白酶的作用。
三、实验仪器、材料和试剂
1．材料
大白鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）。
2．试剂
动物细胞
（1）0.9 % 生理盐水
（2）0.02 % 詹纳斯绿B染液（用生理盐水配制）
（3）0.25 mol/L 蔗糖+0.01 mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）：0.1 mol/L 三羟甲基氨甲烷10 ml，0.1 mol/L 盐酸8.4 ml，加双蒸水到100 ml，加蔗糖到0.25 mol/L。蔗糖为密度梯度离心用D（+）蔗糖
（4）0.34 mol/L 蔗糖+0.01 mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）
（5）固定液：甲醇︰冰醋酸（9︰1）
（6）姬姆萨染液：Giemsa 粉0.5 g，甘油33 ml，纯甲醇33 ml。先往Giemsa 粉中加入少量甘油在研钵内研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2 h 令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。用时吸出秒量用0.067 mol/L 磷酸盐缓冲液作10～20倍稀释。
0.067 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.8）：
0.067 mol/L KH2PO450ml
0.067 mol/L Na2HPO450ml
（7）1 % 甲苯胺蓝溶液
植物细胞
（1）分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH 7.4），3mmol/LEDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。
50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液（pH7.4）配法：50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与42ml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
（2）保存液：0.3mol/L甘露醇（pH 7.4）
（3）20%次氯酸钠（NaClO）溶液。
（4）1%詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。
3．器材
高速冷冻离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物（或纱布）、玻璃匀浆器、瓷研钵、显微镜、天平、载玻片、盖玻片、微量离心管。
四、方法与步骤
（一）大白鼠肝细胞细胞核与线粒体分离
1.细胞核的分离提取
（1）制备大白鼠肝细胞匀浆
1）实验前大白鼠空腹12 h（空腹过夜，降低肝组织中脂肪含量），击头处死，迅速剖腹取肝，在冰浴的小烧杯中剪成小块，迅速用预冷的生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。
2）称取肝组织2 g，剪碎，用预冷到0～4℃的0.25 mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0～4℃条件下，按每克肝组织加9 ml预冷的0.25 mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用从层尼龙织物过滤备用。
注意：先要求充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长且保持冰浴状态，以保持组分生理活性。
（2）差速离心
1）先将0.5 ml 0.34 mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入0.5 ml 肝匀浆使其覆盖于上层。4℃用冷冻高速离心机700 g离心10 min，得到沉淀A1和上清液B1。
2）用1 ml预冷的0.25 mol/L 缓冲蔗糖溶液将A1重新悬浮，1000 g 离心15 min，得到沉淀A2和上清液B2。
3）用1 ml预冷的0.25 mol/L 缓冲蔗糖溶液将A2重新悬浮，1000 g 离心15 min，得到沉淀A3和上清液B3。
（3）细胞核的鉴定
1）将A3以少量0.25 mol/L缓冲蔗糖溶液重新悬浮，制备细胞核悬液，滴一滴于载玻片上，涂片，自然干燥。用1% 甲苯胺蓝溶液染色，在光镜下观察，细胞核呈深蓝色。
2）同样得到细胞核涂片，自然晾干，入甲醇-冰醋酸液固定15 min，充分吹干，滴姬姆萨染液染色10 min。蒸馏水冲洗，吹干，镜检。结果：细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。
2.分离提取线粒体
（1）差速离心
1）将B1、B2、B3合并，10 000 g 离心10 min，弃上清液B4，收集沉淀A4。
2）用1 ml 预冷的0.25 moL/L缓冲蔗糖溶液将A4重新悬浮，10 000 g 离心15 min，弃上清液B5，将沉淀再用1ml预冷的0.25 mol/L缓冲蔗糖溶液将A4重新悬浮，10 000 g 离心15 min，弃上清液，收集沉淀A5。用少量0.25 mol/L 缓冲蔗糖溶液将A5重新悬浮。
（2）线粒体的鉴定
取B1—B5各阶段的上清液和A5沉淀悬液，分别一滴于载玻片上，涂片，不待干即滴加0.02 % 詹纳斯绿B染液，染色20 min，镜检（为了有利于线粒体的有氧呼吸，可以不加盖玻片）。线粒体染成蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。比较B1～B5各阶段的上清液和A5沉淀悬液染色后的差异。
（二）玉米线粒体的分离
1．玉米种子用20%次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28℃于暗处培育2～3d。待芽长到1～2cm长时剪下约15g，放0～4℃1h。
2．加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。
3．用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min。除去核和杂质沉淀。
4．取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。
5．沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上匀浆化及离心均控制在0～4℃进行。
6.参照上面方法进行细胞核的鉴定。
7.线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1%詹纳斯B染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。
五、作业与思考题
1．作业
（1）将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨和甲苯胺蓝染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
（2）分离出的线粒体立即用詹纳斯绿 B 染色和放置室温 2 h 后再染色，比较二者着色的差异。
2．思考题
分离介质0.25 mol/L 及0.34 mol/L 缓冲蔗糖溶液哪一种在下层？有什么作用？
线粒体的分离
线粒体的分离
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实验三线粒体的分离、超活染色与观察 一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。 二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法 （一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组
造血干细胞分离培养方法
一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。
临床级干细胞分离培养
临床级干细胞分离培养等产业化关键技术研发 一、项目背景和意义： 作为生物技术最新的研究领域，干细胞的发现和干细胞技术的发展为人类疾病的治疗提供了独特的视角、方法和手段，为人类疾病治疗提供了新的希望和曙光，必将引起一场医学的革命。干细胞的重要性奠定了其在医药卫生、科技产业和国防等领域内的重要地位，因此干细胞的研究开发和应用是人类的健康工程，预期在未来几年内会有更大的飞跃。尤其是近年来，干细胞研究的进程和产业化速度大大加快。干细胞的产业化是指依托于干细胞采集、储存、研发、移植、治疗等产品或服务以满足人类各种治疗和应用目的的行业种类的总称，干细胞产业已成为一个生机无限的经济增长点，蕴含着巨大的利润空间，是21世纪最有前景的朝阳产业。 临床级干细胞的分离与扩增是干细胞产业化过程中的重要环节。什么样的干细胞能从体外培养进入临床疾病治疗？这就需要建立一个临床级干细胞的标准，它可以极大促进干细胞临床疾病治疗的研究和发展。目前干细胞治疗研究中开展最广泛的两类细胞是造血干细胞和间充质干细胞。对于造血干细胞，目前全世界已经建立了很多脐带血库来保存造血干细胞，并已得到广泛的应用。而间充质干细胞的建库和临床应用才刚刚起步，目前已初步应用于治疗血液病（与造血干细胞共移植）、心脏病、脊髓损伤和多种自身免疫性疾病等，并取得了一定进展。在间充质干细胞治疗同种异基因造血干细胞移植后发生
的GVHD方面，美国Osiris公司已完成了III期临床试验。间充质干细胞具有广泛的应用前景，但是，迄今为止仍没有一个国际公认的能够用于分离和鉴定间充质干细胞的表面标志，这造成了制剂细胞成分不均匀、质量难以控制等困难。 因此，开发特异性分离间充质干细胞的新方法是进一步推动间充质干细胞临床应用的必然趋势。按照临床应用的标准开发骨髓、脂肪、脐带等间充质干细胞的特异性分离纯化工艺，建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序对于间充质干细胞的未来应用具有重大的推动作用。 二、项目目标 1. 总体目标： 建立临床级干细胞标准、开发临床级干细胞分离与培养工艺以及建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序等。 2.具体技术指标： 建立1项成体干细胞的临床级分离纯化的关键技术、标准化操作程序和质控标准，实现间充质干细胞治疗产品生产的标准化、规模化运行，质量达到临床应用标准。 三、主要研究内容： 针对干细胞临床应用中所面临的分离、培养、扩增等关键问题，重点确定与国际接轨的临床级干细胞的标准，建立多种临床级干细胞的分离纯化和培养新技术，为实现干细胞产业化奠定基础。
实验室气流粉碎机的正确使用方法
实验室气流粉碎机顾名思义就是一种能够用气流来对物料进行粉碎的大型产品，因为实验室气流粉碎机是由引风机、除尘器、旋风分离器等部分组成的，所以说它的功能相对来说也是更加完善的，尤其是在实验室的废料清理时我们都能看到实验室气流粉碎机的身影。 实验室气流粉碎机生产厂家介绍说，实验室气流粉碎机的是通过将空气压缩后进行过滤且干燥的处理之后，再由特殊的喷嘴对其进行喷射，而经过多股高压气流喷射则会形成一个交汇处，交汇处便是物料的主要粉碎点。因为其内部是光滑且无死角的，所以实验室气流粉碎机的拆洗是十分方便的。所以我们要对其进行定期的保养和维护。 实验室气流粉碎机的应用比较频繁。在使用过程中需要注意一些事项，包括启动和打开过程前的准备工作，维护工作等。下面的实验室气流粉碎机制造商将详细介绍实验室气流粉碎机的操作方法，希望能给大家提供帮助。 1、开机前的准备 检查主机，连接器，管道和阀门是否处于良好状态并正常运行。
2、开机 (1)、打开压缩机电源，除尘器压力阀和主空气阀，打开实验室气流粉碎机的电源开关，打开电源开关。 (2)、从零开始并逐渐将其调整到指定的速度。 (3)、打开风扇，旋风，灰尘，给电机充电，打开总电源箱，设置变频器的频率，然后开始充电。 (4)、可根据分级轮的频率和负载调整成品的粒度。 3、停机和停止的顺序是：变频器- 馈线- 主空气阀- 压缩机- 级叶轮电机- 旋风材料，灰尘开关- 风扇- 总功率- 空气压缩机。 4、维护保养 (1)、电机应定期润滑，但油不应过多，以免轴承温度过高。 (2)、检查叶轮，螺旋输送机和破碎喷嘴的磨损非常重要。
(3)、材料破碎后，应清洗机器内的橡胶粉末，以免堵塞，从而影响破碎效果。 (4)、过滤袋使用一段时间后，应进行清洁或更换。 5、注意事项 (1)、当卸载设备运行时，无法到达卸载出口以避免发生事故。 (2)、叶轮的速度不应超过规定，否则温度过高，叶轮和电机会损坏。 (3)、应定期检查阀门以确保可靠性。
分离线粒体
从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法 所需缓冲液： RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液） 10mM NaCl（Mr=58.44） 2.5mM MgCl2（Mr=20 3.3） 10mM Tris-Cl（PH8.0） 调PH值至7.4 配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。 2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液） 525mM甘露醇（Mr=182.17） 175mM 蔗糖（Mr=342.3） 12.5mM Tris-Cl（PH8.0） 2.5mM EDTA（PH8.0） 调PH值至7.4 配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。 1×MS缓冲液 210mM甘露醇 70mM 蔗糖 5mM Tris-Cl（PH8.0） 1mM EDTA（PH8.0） 调PH值至7.4 配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。 注意事项： 溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。 从细胞中分离线粒体： 1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。 2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。 3．细胞一破碎，立刻加入2ml 2.5×MS缓冲液至终浓度为1×MS。 4．750g离心10min以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。 5．将上清转移至另一离心管中，重沉淀细胞核一次。 6．将上清转移至另一离心管中，10000g离心20min沉淀线粒体。 7．弃上清，用1 ml 1×MS缓冲液重悬沉淀，750g离心10min，取上清，10000g离心20min，弃上清，用适当体积的1×MS缓冲液重悬沉淀。
人表皮干细胞的分离培养
人表皮干细胞的分离培养 【摘要】目的探索人表皮干细胞原代培养方法。方法将皮肤标本进行分离，用DispaseⅡ酶消化表皮皮片后，重悬细胞，接种于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养。表皮干细胞的鉴定采用免疫细胞化学技术检测其表面标记物β1整合素、CK19的表达。对表皮干细胞与角质形成细胞的克隆形成情况进行比较。结果倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况良好，表皮干细胞β1整合素及CK19角蛋白染色阳性。表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞（P＜0.05）。结论采用本方法进行人表皮干细胞的培养较为理想。 【Abstract】Objective The present research was performed to find primary cell culture method of human epidermal stem cells. Methods The skin samples were isolated by Dispase Ⅱ，the cells were seeded in culture flask which was dealed with type IV collagen. The epidermal stem cells were identified by immunocytochemical technique for the detection of integrin β1 and CK19. The cell clone formation of epidermal stem cells and keratinocyte were compared. Results Cell morphology was observed under microscope and good growth status inverted，epidermal stem cells were positive reaction to integrin β1 and CK19 antibody. Epidermal stem cell clone formation rate is higher than that of keratinocytes （P＜0.05）.Conclusion Our results indicate that the method was effective for culture human epidermal stem cells. 【Key words】Epidermal stem cell；Culture；Identification 表皮干细胞具有无限增殖的能力，在组织工程皮肤的研究中具有重要的作用，本文就表皮干细胞的原代培养进行探讨。 1 材料与方法 1. 1 主要试剂DMEM培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM），单克隆抗体β1整合素，单克隆抗体CK19，Ⅳ型胶原，DispaseⅡ酶，胎牛血清（FBS），表皮细胞生长因子，0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）。 1. 2 实验设备CO2恒温培养箱，无菌超净工作台，倒置相差显微镜，普通光学显微镜。 1. 3 方法 1. 3. 1 原代培养严格无菌操作，切取5×5 mm2左右的皮肤标本，标本源自本院4月龄自愿引产胎儿包皮，切取前分离皮下组织，将分离得到的皮肤组织用含青-链霉素的PBS冲洗3次，切成小皮块后置于含 2.5 mg/ml DispaseⅡ酶的DMEM培养基中4℃过夜，培养基中含有青霉素（100 U/ml）及链霉素（100 μg/ml），第二天分离表皮和真皮层，收集表皮皮片，37℃条件下0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化15 min，胎牛血清终止消化，轻轻吹打，200目
实验四 线粒体的分离与观察
实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：
干细胞分离培养步骤
家兔BMSC分离培养步骤 1.麻醉、备皮、消毒、铺巾：取1只4-5周龄新西兰幼兔，速眠新肌肉注 射(0．1～0．2mL／kg)麻醉。仰卧固定于操作台上，褪毛，备皮，2%碘酒、75%酒精（或碘伏）常规消毒，铺洞巾(洞巾孔洞应控制在lcm左右，以利于减少污染)。 2. 在双侧踝关节处环形剪开皮肤，再纵行剪开皮肤至骶尾部，分离肌肉、 筋膜等软组织至见骨膜，电锯离断踝关节、膝关节及髋关节，获取家兔股骨和胫骨（桡骨）,置于装有PBS液的无菌盒内。（亦可从髂前上棘穿刺抽取骨髓） 3．用PBS液体清洗骨组织3-4遍，去除杂物、血迹后，在超净工作台上，无菌条件下剥离骨周围的肌肉软组织，用眼科剪从股骨和胫骨的干骺端打开骨髓腔，用含有适量肝素( 625 U/mL)的DMEM 液冲洗骨髓腔，收集冲洗液约 6 ～ 8 mL。吸管反复吹打后，1 500 r/min，离心5 min，弃上清。加入 DMEM 培养基重悬，将上述细胞重悬液按照1∶ 1 的比例缓慢滴加到密度为 1. 073 g/mL 的PercoⅡ分离液中，1 500 r / min 离心 20 min。离心后管内容物分为 3 层，收集中间乳白色云雾状的单个核细胞层，加入 DMEM 培养液稀释混匀，1 500 r/min 离心 5 min，洗涤 2 ～ 3 次，去除多余的脂肪细胞及组织液。用含双抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，以 2. 0 × 10^5个/cm2的细胞密度接种于25cm^2培养瓶中，置于37 ℃，5%、饱和湿度的孵箱中培养。 4. 48小时后首次半量换液，去除浮物及其它非贴壁细胞（如造血干细胞），后每隔3天换液一次。 5. 7-10天后，待细胞融合长满至80%以上时用0.25%胰蛋白酶消化传代。 经过第一次传代后，骨髓间充质干细胞大约能占60%左右，并且呈漩涡状生长；一般经过3次左右传代后，骨髓间充质干细胞大约能占90%左右。
核与线粒体分离提取方案
线虫细胞核和线粒体提取 N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。 1.细胞核分离 细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。 方法如下： 1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合 2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。 3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。 4.以10000rpm短暂离心5-10秒。 5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中 6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次 7.用棉布过滤匀浆 8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。 10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。 11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。 12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。 核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。 13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。 14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。 分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。 2.线粒体提取 查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下： 1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。 2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。 3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。 4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。 5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。 6.小心地清除上清液 7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破
间充质干细胞分离与培养
文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提 要:目的 摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法 采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果 以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论 建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1 材料与方法 1.1 骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2 不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3 不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4 比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5 培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001
化工原理实验教材
雷诺演示实验 一、 实验目的 1观察流体流动时的不同流动型态 2观察层流状态下管路中流体的速度分布状态 3熟悉雷诺准数（Re ）的测定与计算 4测定流动型态与雷诺数（Re ）之间的关系及临界雷诺数 二、 实验原理 流体在流动过程中由三种不同的流动型态， 即层流、过渡流和湍 流。主要取决于流体流动时雷诺数 Re 的大小，当Re 大于4000时为 湍流，小于2000时为层流，介于两者之间为过渡流。影响流体流动 型态的因素，不仅与流体流速、密度、粘度有关，也与管道直径和管 三、实验装置 雷诺演示实验装置如图1.1所示，其中管道直径为20 mm 型有关，其定义式如下： Re 二 dap 式中：d 管子的直径 m u 流体的速度 m/s p 流体的密度 3 kg/m 流体的粘度 Pa ? s i.i-i
图1.1雷诺演示实验装置图 1 —有机玻璃水槽； 2 —玻璃观察管； 3 —指试液； 4 , 5 —阀门； 6 —转子流量计 四、实验步骤 1 了解实验装置的各个部件名称及作用，并检查是否正常。 2打开排空阀排气，待有机玻璃水槽溢流口有水溢出后开排水阀调节红色指示液，消去原有的残余色。 3打开流量计阀门接近最大，排气后再关闭。 4打开红色指示液的针形阀，并调节流量（由小到大），观察指示液流动形状，并记录指示液成稳定直线，开始波动，与水全部混合时流量计的读数。 5重复上述实验3?5次，计算Re临界平均值。 6关闭阀1、11,使观察玻璃管6内的水停止流动。再开阀1,让指示液流出1?2 cm后关闭1,再慢慢打开阀9,使管内流体作层流流动，观察此时速度分布曲线呈抛物线形状。 7关闭阀1、进水阀，打开全开阀9排尽存水，并清理实验现场。 五、数据处理及结果分析 1实验原始数据记录见下表:
组织线粒体提取
从动物组织中粗提线粒体 一、实验目的： 从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。 二、实验准备 Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具 三、实验步骤： 1．实验前一天小鼠禁食过夜。线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。 2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml预冷的IBc烧杯中； 3．预冷的IBc洗去多余的血液。洗4-5次至IBc澄清。 4．冰上将肝脏剪碎 5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器 6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间 7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃ 8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃ 9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃ 10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬 11．7000g，离心10min 4 ℃ 12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。用1ml移液管重悬避免出现气泡。 13．转移至14ml离心管，置于冰上。线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。 14．Bradford法测定线粒体浓度。 四、试剂配方 Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml 10 ml 0.1M Tris–MOPS 1 ml 0.1M EGTA/Tris 20 ml 1M sucrose 100 ml ddH2O，pH 7.4 储液： 1 M sucrose： 342.3 g sucrose 1L ddH2O Mix, 20 ml分装-20 C保存. 0.1MTris/MOPS： 12.1 g Tris； 500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4 C. 0.1 M EGTA/Tris： 38.1 g EGTA； 500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C. 五、注意事项 1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性； 2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬，线
伯努利方程实验
化工原理实验（2010年国防工业出版社出版的图书）： 本书为化工原理实验教材,内容包括化工实验数据的测量及处理、化工实验常用参数测量技术、化工原理基础实验、演示实验、计算机处理实验数据及实验仿真、化工原理实验常用仪器仪表这六部分。其中,化工原理基础实验包括流体阻力测定实验、流量计标定实验、离心泵性能测定实验、过滤实验、传热实验、精馏实验、气体的吸收与解析实验、干燥实验。演示实验包括伯努利方程实验、雷诺实验、旋风分离器性能演示实验、边界层演示实验和筛板塔流体力学性能演示实验。计算机处理实验数据及实验仿真,包括应用Excel 进行数据和图表处。 目录： 绪论1 第一章化工实验数据误差分析及数据处理3 1. 1实验数据的误差分析3 1. 1. 1测量误差的基本概念3 1. 1. 2间接测量值的误差传递6 1. 1. 3实验数据的有效数字与记数法10 1. 2实验数据处理11 1. 2. 1列表法12 1. 2. 2图示(解)法13 1. 2. 3数学模型法15 第二章化工参数测量及常用仪器仪表29
2. 1温度测量29 2. 1. 1热膨胀式温度计29 2. 1. 2热电偶式温度计33 2. 1. 3热电阻式温度计35 2. 1. 4温度计的校验和标定36 2. 2压力测量37 2. 2. 1液柱压力计38 2. 2. 2弹性压力计40 2. 2. 3压强(或压强差)的电测方法42 2. 2. 4压力计的校验和标定43 2. 3流量测量43 2. 3. 1差压式流量计43 2. 3. 2转子流量计46 2. 3. 3涡轮流量计48 2. 3. 4流量计的校验和标定50 第三章化工原理基础实验51 实验一流体阻力测定实验51 实验二流量计标定实验60 实验三离心泵性能测定实验65 实验四过滤实验71 实验五传热实验77 实验六精馏实验86
线粒体分离及功能测定
组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）： Components Final concentration Tris-HCl 50mM pH7.4 NaCl 150mM EDTA 2mM EGTA 2mM Triton X-100 0.2% NP-40 0.3% PMSF 100uM NaVO3 1mM NaF 250mM Leupeptin 10ug/ml Aprotinin 2ug/ml DTT 1mM 组织线粒体的分离 1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓 冲液中， 2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分， 3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎， 4) 4℃，电动匀浆机，600rpm 上下3 次， 5) 1000g 4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中， 6) 重复上面步骤一次， 7) 10,00Og 4℃离心10min,沉淀即为线粒体， 8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次， 9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours）， 10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。 分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法) 低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentration Hepes(KOH) 20mM pH7.2 Sucrose 210mM Mannitol 70mM EDTA 1mM EGTA 1mM
组织线粒体分离试剂盒
组织线粒体分离试剂盒 简介： 线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。 Leagene 组织线粒体分离试剂盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离动物组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒可用于从动物软组织(如脑、肝脏)和硬组织(心肌、骨骼肌)中提取线粒体，对于采用该试剂盒提取硬组织线粒体效果不佳者，建议采用Leagene 硬组织线粒体分离试剂盒。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 低温离心机、匀浆器 2、 PBS 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重，用预冷的PBS 清洗1次，冰上剪成3mm 2大小的组织碎片。 2、匀浆裂解：加入Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF ，至PMSF 浓度为1×)，置于冰浴上Dounce 匀浆器中，匀浆10～20次。 不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 3、离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。注：如需获得纯度更高的线粒体，可 编号 名称 CS0010 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml RT 试剂(D): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份
组织线粒体分离试剂盒
组织线粒体分离试剂盒 简介： 组织线粒体分离试剂盒(Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离动物组织中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于SDS-PAGE 、Western 、双向电泳等蛋白分析。该试剂盒可用于从动物软组织(如脑、肝脏)和硬组织(心肌、骨骼肌)中提取线粒体，对于采用该试剂盒提取硬组织线粒体效果不佳者，建议采用Leagene 硬组织线粒体分离试剂盒。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、清洗：取新鲜组织(不宜采用冻存的组织)，迅速称重50～100mg ，用预冷的PBS 清洗1次，冰上剪成3mm 2大小的组织碎片。 2、匀浆裂解：加入预冷的Mitochondria Lysis buffer(如需获得细胞浆蛋白，应提前加入PMSF ，至PMSF 浓度为1×)，置于冰浴上Dounce 匀浆器中匀浆。 不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。 3、离心以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。 4、上清液转移至一干净离心管离心。 5、弃上清，沉淀为线粒体，如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀。 6、保存：弃上清，用适当缓冲液悬浮沉淀。如果用于线粒体酶活性或功能的分析，线粒体沉淀应重悬于Mitochondria Stock buffer ；如果用于线粒体蛋白的分析，获得的细胞浆蛋白应保存于1×Protein Stock buffer ，即按细胞浆蛋白：Protein Stock buffer (5×)=1:4比例混合；如果用于双向电泳，应使用恰当的保存液。 编号 名称 CS0203 50T Storage 试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃ 试剂(B): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃ 试剂(C): Protein Stock buffer (5×) 10ml RT 试剂(D): PMSF(100×) 1.5ml -20℃ 使用说明书 1份