细胞凋亡的检测方法

细胞凋亡的体内检测
尽管细胞凋亡在维持多细胞生物机体稳态、生长发育等生命活动中发挥重要作 用。但是不正常的细胞凋亡会导致组织功能紊乱,包括自身免疫疾病、神经退行 性疾病、肿瘤等。肿瘤的治疗方法很多，有效的肿瘤治疗包括通过化疗药物诱导 体内细胞凋亡。 临床上迫切需要非损伤性的方法来检测癌症病人使用药物的效果, 以及对新药药效作出评价。 因此,体内细胞凋亡检测试剂备受瞩目,目前只有处于 临床阶段的体内细胞凋亡检测试剂,常规检测试剂尚未出现。
DNA ladder
原理：细胞凋亡时，由于核酸内切酶被激活，DNA 被切成 50-300kb 大小的片段， 然后进一步分解成约 180bp 的整数倍的寡核酸片段。用琼脂糖凝胶电泳检测显示 梯形条带，而坏死细胞 DNA 则被降解成弥散的条带。
TUNEL法
原理：细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活 ,染色质或 DNA 被核酸 内切酶切割后产生 180 bp～200 bp 的含 3′-OH 末端的片断 ,脱 氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dUTP) 标记到缺 口 3-OH 的末端,依次加入 HRP 抗荧光素抗体和 HRP 显色底物 DAB, 凋亡细胞显色明显 , 而正常细胞没有 DNA 断裂或者只有少量的 DNA 发生断裂,故不被显色。
细胞凋亡意义
细胞凋亡在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演者重要角 色。 其一，有利于清除有害细胞，在研究自身免疫性疾病，病毒 感染和肿瘤的机制中发现自身反应性 T,B淋巴细胞，某些病毒 感染细胞可通过细胞凋亡方式被清除。推测机体利用细胞凋 亡作为一种保护机制。 其二，有利于清除完成正常使命的衰老细胞。人红细胞分化 成熟后是无核有功能细胞，可存活120d,然后自然死亡。
流式细胞术检测
流式细胞分析法可对单个细胞或其它生物微粒进行快速定量分析与分选， 是定量 检 测细 胞凋 亡的 重要 方法 之 一。 流式 细胞 术主 要包 括多 种 方法 ，其 中 AnnexinV/PI 法是目前较为流行的检测细胞凋亡的方法。
优点：分析精确，重复性好，费用低廉，分析速度 快，检测的细胞数量大，可定量分析群体细胞的凋 亡及同时进行其他相关的分析 缺点：不能检测出细胞群体异质性
细胞凋亡的DNA片段化检测
DNA ladder： 优点:经典的检测 细胞凋亡的指标 缺点：DNA凝胶 电泳特异性高但 灵敏度低，不适 于检测凋亡初期 DNA轻微损伤的 检测
TUNEL法 优点：敏感、快速。 特异性强 缺点：局限性，如： 组织固定、处理的过 程本身会改变实验结 果。对细胞凋亡不是 特异的，坏死细胞也 会被标记。
其三，维持器官，组织，细胞数目相对平衡细胞凋亡是同细 胞增殖相反的过程，两者既对立又统一，相互协调。
细胞凋亡检测技术的展望
目前用于体外细胞凋亡检测的方法很多,但每种方法都有自身的局限性。 进行细 胞凋亡检测时,可以根据样本的特点,选择合适的方法或多种方法同时进行检测。 用于体内细胞凋亡检测的试剂处在研究阶段,有意思的是它们的检测原理大都通 过与凋亡细胞表面结合,这和示踪剂在体内滞留时间较短的要求相一致 ,进入细 胞就又多了一层屏障。Allnexinv 及其变体、Sytl 一 CZA 和 APosense 家族的某 些分子的临床应用取决于它们研究的进展。 相信随着对细胞凋亡认识的不断深入 和检测技术的发展,特异性更强、 灵感度更高的体内细胞凋亡检测试剂将会面世。
细胞凋亡的检测方法
报告人：王英 时间：2015 11 27
细胞凋亡的形态特征
细胞核缩小，染色质边缘化，出现凋亡小体。
细胞凋亡和坏死的区别
---细胞凋亡是一种主动的，程序性的死 亡过 --不造成炎症和自体损伤
--细胞坏死指细胞在各种致损伤因素作用下无
序死亡的过程 -形态特征为细胞胀大，胞膜破裂，胞浆内容 物外泄 -局部导致炎症反应
缺点：但 TUNEL 法也有局限性。如 : 组织固定、处理的过程 本身会改 变检测结果 , 对细胞凋 亡不是特异性的 , 坏死细胞 也会被标记。
ELISA 法 应用 ELISA 方法也可以检测 DNA 片段化,在凋亡的早期 DNA 发生断裂,核小体释放 进入细胞质中,核小体是染色质的基本单元 ,通过 ELISA 检测凋亡细胞释放到细 胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度。
ELISA检测法 优点：此法既可 定性，又可定量。 且适合检测大量 样本，且灵敏度 高。
线粒体膜电位的检测
线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧质子的不对称分布而形成的电化 学梯度,在细胞凋亡过程中常因膜孔道大小的改变及转膜电位的降低 来调节细胞凋亡。 线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期事件。 而且 一旦线粒体膜电位耗散,凋亡就不可逆转。线粒体膜电位变化的检测 属于电化学的方法,使用时需始终保持平衡染液 p（ Hoechst33342 、Hoechst33258 和 DAPI 等） 与 DNA 的 A-T 碱基区进行非嵌入式结合， 从而使细胞核着色， 在紫外光激发时会出现明显的荧光。 通过荧光显微镜可观察到细 胞染色质的形态学变化及膜结构与通透性的改变。
优点： 简便易行， 可用于细胞涂片或滴片定性观察细胞凋亡现象。 缺点：观察凋亡细胞的形态特征耗时费力，所以不使用大量凋亡 样本的检测。
钙离子浓度变化检测
凋亡的调控由十分复杂的信号网络系统控制，目前已知有三条主要 信号通路：线粒体通路，内质网通路，死亡受体通路。这些信号通 路大部分与钙离子有关，最终都能激活凋亡执行者Caspases3,水解 各种细胞成分而使细胞凋亡。在钙离子信号与肿瘤细胞形成的三条 通路中，存在相互促进，互为因果的促凋亡蛋白酶，加速了肿瘤细 胞的凋亡。虽有关钙离子信号调控细胞凋亡的证据越来越多，但是 钙离子如何激活这些凋亡调节因子的分子机制现在仍不清楚。一旦 完全认识了Ca与细胞凋亡的关系，必将为凋亡研究带来突破性进展， 为疾病特别是肿瘤细胞的治疗提供新的思路和手段。 优点：由于流式细胞术不能检测出群体细胞的异质性，但钙离子浓 度变化检测能对多项生化指标进测定，固该法由较高的优越性。
体内检测
AnnexinV Synaptotagmin I-C2A ApoSese
体内检测-试剂盒
细胞凋亡检测方法
体外检测
细胞凋亡的形态学检测 细胞凋亡的 DNA 片段化检测(DNA ladder , TUNEL 检 测法, ELISA 检测法) 细胞凋亡的线粒体膜电位的检测 细胞凋亡的相关基因的检测( 凋亡促进基因的表达检 测,凋亡抑制基因的表达检测) 细胞凋亡的流式细胞术检测 细胞凋亡的钙离子浓度变化的检测
综述目的
过量或过少的细胞凋亡均对机体有害。人类 和动物的好多疾病的发生都与细胞凋亡有 密切关系，若能恰当的加速或阻断细胞凋亡， 可为有效防控凋亡相关疾病提供新的治疗 途径。因此细胞凋亡的检测是开展凋亡研究 的关键步骤。
近年来有不少综述著作分别介绍了植物发育过程中的 细胞凋亡，环境胁迫下诱导的细胞凋亡、植物细胞凋 亡的机理以及发育调控、在植物发育中的细胞凋亡作 用、植物细胞凋亡与活性氧及抗氧化代谢的关系等， 但对细胞凋亡的检测方法则很少报道。本文主要从以 下几方面对检测细胞凋亡的技术加以阐述。