热休克蛋白70

本科生毕业论文（设计）册

学院生命科学院

专业生物科学

班级（届） 2015届

学生张川

指导教师李东明

任务书编号 2015届103

河北师范大学本科毕业论文（设计）任务书

编号： 2015届103

论文（设计）题目：急性低氧刺激下树麻雀HSP70基因的适应性变化

学院：生命科学院专业：生物科学班级（届）： 2015届

学生姓名：张川学号： 2011012028 指导教师：李东明职称：副教授

1、论文（设计）研究目标及主要任务

研究目标：在急性低氧刺激下，树麻雀肝脏组织中HSP70基因水平的变化。

主要任务：分析低氧刺激对树麻雀HSP70基因水平的影响。

2、论文（设计）的主要内容

热休克蛋白是一种高度保守的应激蛋白，在受到外界刺激时，机体的HSP70会有一定变化，以保护组织器官等。本研究以树麻雀为研究对象，研究其在低氧刺激下肝脏组织中HSP70基因的变化。

3、论文（设计）的基础条件及研究路线

基础条件：本实验室主要研究动物对环境的适应性，具备研究树麻雀HSP70的基础条件，实验室仪器设备齐全，并具有野外取材的条件和能力。

研究路线：将树麻雀放入模拟各种海拔高度低氧的环境生活一定时间，然后提取其肝脏组织，对肝脏组织中HSP70基因的mRNA表达量进行分析对比。

4、主要参考文献

[ 1 ] Welch WJ. Mammalian stress response: cell physiology, struc2 ture / function of stress p roteins, and imp lications for medicine and disease[ J ]. Physiol Rev, 1992, 72 (4) : 1063 - 1081.

[ 2 ] Suzuki k, Sawa Y, Kagisaki k, et a l. Reduction in myocardial apop tosis associated with overexp ression of heat shock p rotein 70 [ J ]. Basic Res Cardiol, 2000, 95 (5) : 397 - 403. [ 3 ] 任宝波,王玉艳,王纯净,等. HSP70 家族的分类及基因结构与功能[J ]. 动物医学进展,2005 , (26) :98 - 101.

[ 4 ] Ishii T ,VdonoH ,Yamano T ,et al. Isolation of MHC class I - restricted tumor antien peptide and its precursors asso2 ciated with heat shock proteins HSP70 , HSP90 and gp96 [J ]. Immunol ,1999 ,162 :1303 - 1309.

[ 5 ] 陈劲松. 热休克蛋白的分子遗传学研究进展[J ] . 国外医学一遗传学分,2001 ,24 (3) 128 - 132.

指导教师：年月日

教研室主任：年月日

河北师范大学本科生毕业论文（设计）开题报告书

本科生毕业论文设计

题目：急性低氧刺激下树麻雀HSP70等基因的适

应性变化

作者姓名张川

指导教师李东明

所在学院生命科学院

专业（系）生物科学

班级（届） 2015届

完成日期 2015 年 4 月 13 日

目录

摘要 (2)

关键词 (2)

1 前言 (2)

2材料与方法 (2)

2.1 样品采集用具 (2)

2.2 样品的采集及处理 (2)

2.3 HSP70基因的克隆 (2)

2.3.1实验药品及仪器 (2)

2.3.2 缓冲液及试剂的配制 (3)

2.3.3 提取RNA (3)

2.3.4 RNA反转录成cDNA (3)

2.4 HSP70的定量分析 (4)

2.4.1 实验仪器及药品 (4)

2.4.2 实验原理 (4)

2.4.3 实时荧光定量PCR (4)

2.4.4 数据处理与分析 (5)

3 结果 (5)

3.1 肝脏总RNA的抽提 (5)

3.2 mRNA的比较 (6)

4 讨论 (6)

5 结论 (7)

参考文献 (7)

英文摘要 (9)

英文关键词 (9)

急性低氧刺激下

树麻雀HSP70基因的适应性变化

作者：张川指导教师：李东明

摘要：氧是动物生命活动中不可或缺的元素。在低氧或缺氧刺激下，动物组织细胞会受到损害或死亡。热休克蛋白70（HSP70），是一种高度保守的应激蛋白。在各种理化因素的刺激下，HSP70对细胞内的蛋白质具有稳定性，以保护有机体组织和结构少受损害。目前，针对HSP70的研究主要集中于哺乳动物，对鸟类的研究尚少。本研究以树麻雀(Passer montanus)为研究对象，研究其在急性低氧条件下(不同低氧程度和不同处理时间)肝脏中HSP70 mRNA的表达量的高低。实验数据显示，树麻雀肝脏组织处的HSP70 mRNA的表达量在3km-8h组和3km-24h组中呈上升趋势，但并无显著性。在3km-8h组和6km-24h组中，树麻雀肝脏组织处的HSP70 mRNA的表达量有不同程度的降低。但通过LSD多重比较只有6km-24h低氧处理组显著低于其他组。

关键词：热休克蛋白70（HSP70）；急性低氧刺激

1 前言

热休克蛋白是一种高度保守的应激蛋白。正常情况下，热休克蛋白表达并不多，而在机体受到外界刺激时，热休克蛋白迅速大量表达，维持细胞内蛋白质的稳定，减少有机体组织结构的损害。在热休克蛋白中，又以热休克蛋白70（HSP70）诱导表达最多。目前，研究发现HSP70对动物的心肌保护具有很重要的作用。在低氧刺激下，它能维持心肌的正常心律，减少心肌受损面积，减小心肌因缺血而坏死的范围。同时，还能增加有机体组织结构的耐受性。不过，就目前而言，这些研究大多集中于哺乳动物，而对同样是高等动物的鸟类的研究却很少。本研究是以树麻雀为研究对象，研究其在不同低氧程度及不同处理时间后，肝脏中HSP70 mRNA的表达量，以增加对HSP70的了解。

2材料与方法

2.1 样品采集用具

解剖刀、圆头剪、解剖镊、尖头剪、止血钳、冰盒、液氮罐（10升）、苯巴比妥、模拟低压低氧舱。

2.2 样品的采集及处理

采用雾网法捕捉野生树麻雀，测量体重等各项指标后，放入低压氧舱适应15分钟，根据不同处理时间和不同低氧程度进行低氧处理，分为五组：对照组（N=9）、3km-8h组（N=6）、3km-24h组(N=8)、6km-8h组(N=5)、6km-24h组(N=7)。

低氧处理后，注射麻醉剂（苯巴比妥，7.5μl/g体重），断头处死，迅速获取麻

雀肝组织置于液氮中速冻保存后，移至-80℃超低温冰箱备用，用于提取总RNA。

2.3 HSP70基因的克隆

2.3.1实验药品及仪器

实验仪器：匀浆器（sigma）、吸头(Axygen)、振荡器（生工）、1.5ml EP管（Axygen）、

移液器（艾本德）、0.2ml PCR管（Axygen）、高速冷冻离心机（艾本德）、超净工作台、

恒温水浴锅（DK-8D，一恒）、电子分析天平（AE240）、高压灭菌锅（LDZX-50KBS，申安）、电泳仪（DYY-6D，六一）、凝胶成像分析系统（TU-190，AlPha）、超微量分光光

度计（ND-1000，Thermo Fisher）、梯度PCR仪（ABI）。

实验药品：Trizol、琼脂糖、无水乙醇、焦碳酸二乙酯、LB培养基、PEASY-Blunt SimPle Cloning Kit（CB111-01，北京全式金）PEASY-T1 Cloning Kit（CT101，北京

全式金）、TransScriPt First-Strand cDNA Synthesis SuPPer Mix（AT301，北京全

式金）、TransStart FastPfu DNA Polymerase（AP221，北京全式金）、高纯质粒小提

试剂盒、E.Z.N.A. Total RNA Kit Ⅱ(R6934-01,OMEGA)。Axygen PreP DNA 凝胶回收

试剂盒（AP-GX-50）Extaq DNA Ploymerase（Takara）、Trans 5a感受态细胞（JC-PD002,

北京全式金）。

2.3.2 缓冲液及试剂的配制

50×TAE：将242gTris溶于900ml ddH2O中，加入57.1ml冰醋酸和100ml 0.5mol/L EDTA 二钠盐，定容至1L，高温高压灭菌；

0.1% DEPC水溶液的制备：将0.1%的DEPC加入ddH2O中，密封并搅拌15h后，高温高压灭菌，4℃冷藏备用；

O定容1L，10g氯化钠，高温高压灭液体LB培养基（1L）：5g酵母粉，10g蛋白胨，ddH

2

菌，常温保存备用；

AmP+抗性液体LB培养基：将100mg/ml的AmPicillin以1:1000加入液体LB培养基中，4℃保存备用；

AmP+固体LB培养基： 5g酵母粉，10g蛋白胨，ddH

O定容1L，10g氯化钠，加入10g Agar，

2

高温高压灭菌，降温后将100mg/ml的AmPicillin按照1:1000的比例加入，倒板，4℃保存备用。

2.3.3 提取RNA

（1）准备好无菌匀浆器、枪头、移液器、1.5ml EP管等，用酒精把超净台擦拭

干净，打开紫外灯，灭菌15分钟以上；

（2）分次从-80℃超低温冰箱中取出5个实验组的肝脏样品，放入液氮中备用；

（3）利用Total RNA Kit Ⅱ(R6934-01,OMEGA)，按操作步骤提取RNA；

（4）用超微量分光光度计检测提出的RNA浓度及纯度，分装出反转录样品，其余RNA 分装后放入-80℃超低温冰箱保存以备用。

2.3.4 RNA反转录成cDNA

（1）使用TransScriPt First-Strand cDNA Synthesis SuPPer Mix，按要求加样，混匀后按照说明书要求进行实验；

（2）反应产物即为树麻雀肝组织cDNA，放入4℃冰箱备用；

2.4 HSP70的定量分析

2.4.1 实验仪器及药品

实验仪器：进口吸头、移液器（EPPendorf）、96孔板（Axygen）、进口1.5ml EP管、封板膜（ABI）、恒温水浴锅、灭菌锅、超净工作台、实时定量PCR仪（MX3005P）、超微量分光光度计。

实验药品： TransStrat ToP Green qPCR SuPerMix（AQ131，北京全式金），焦碳酸二乙酯（DEPC；E174，Amresco）。

2.4.2 实验原理

Real-time PCR是将带有荧光的基团加入到整个PCR的反应体系中，当反应体系中的荧光基团与双链DNA结合时，发出荧光。通过反应体系中荧光强度变化，可以全程监测PCR产物的扩增，完成对模板定量分析的目的。Ct值表示每个反应中的荧光信号到达所设定阈值所经历的循环数。以β-actin作为内参，每次实验单个样本重复3次，PCR结束后得到扩增曲线和Ct值。溶解曲线是实时荧光定量PCR的主要参数，当它只存在一个较为集中的主峰时，实验的结果是真实可信的。

2.4.3 实时荧光定量PCR

(1) 将2.3.4中所得cDNA稀释10倍备用。

(2) 设计实时荧光定量PCR引物：

Sense 5′GCCGCAAGTATGATGACCCC 3′;

Antisense 5′TGGGCTTGCCTCCCTCATT 3′ ;

β-actin Sense： 5' -CTACGAAGGCTATGCCCTCCCC-3';

β-actin Anti-sense：5'-CCTCTCGGCTGTGGTGGTGAAG-3'。

(3) 在冰上按(表1 )配制实时荧光定量PCR所用混合液，并加入96孔板中。

(4) 使用MX3005P实时定量PCR仪进行PCR反应，反应程序如(表2 )。

表1 实时荧光定量PCR反应体系的组成和加样量

反应组分加样量

2×TransStarTM ToP Green qPCR

10μl

SuPerMix

Passive Reference Dye II（50×）0.4μl

Forwars Primer（10μM）0.4μl

Reverse Primer（10μM）0.4μl

cDNA模板1μl

ddH2O 7.8μl

2.4.4 数据处理与分析

用2-△△Ct 方法计算出HSP70 mRNA 的表达量。首先计算实验组与对照组3个平行样品的平均Ct 值，其中△Ct 是每个实验组Ct 值减去内参基因β-actin Ct 值。△△Ct 为实验组每组△Ct 值减去对照组△Ct 值。用SPSS 软件分别对不同海波不同低氧时间的肝脏组织HSP70 mRNA 表达量进行单因素方差分析，并分析其统计学意义，针对有较显著差异的，再利用LSD 法进行多重比较。图示由GraPhPad Prism5.0软件生成。

表2 Real-time PCR 反应条件

步骤

温度 时间 预变性

94℃ 30s PCR 反应

94℃ 5s 收集荧光

60℃ 30s 3 结果

3.1 肝脏总RNA 的抽提

提取的肝脏总RNA 浓度和纯度用超微量分光光度计、电泳进行检测。本次提取的肝脏总RNA 浓度为2000 ng/μl 左右，质量较好，可进行后续的实时定量PCR 实验。

3.2 mRNA 的比较

目的基因HSP70和内参基因β-actin 的溶解曲线均达要求（图1、2）。通过扩增曲线图可知，内参基因β-actin 在34个循环后达到荧光阈值，目的基因HSP70在38个循环后达到荧光阈值（图3、4）。

图1 HSP70内参基因的溶解曲线 图2 HSP70目的基因的溶解曲线

图3 HSP70内参基因的扩增曲线 图4 HSP70目的基因的扩增曲线

循环

单因素方差分析，树麻雀在不同低氧处理组无显著差异，（F4,30=2.122，P=0.103）。

LSD多重比较中，树麻雀肝脏组织中HSP70的mRNA表达量在6km-24h低氧处理后显著低于对照组（p=0.013）、3km-8h组（p=0.046）和3km-24h组（p=0.025）。

3km-8h组树麻雀肝脏组织的HSP70 mRNA表达量比起对照组有微量增加，3km-24h组又比3km-8h组要多。且都比6km-8h，6km-24h组的HSP70 mRNA表达量要多。不过，结果并不显著。而在6km-8h组与6km-24h组中，树麻雀肝脏组织中HSP70 mRNA的表达量呈下降趋势，均都低于对照组，并且6km-24h组具有显著性（图5）。

图5 树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA表达量

4 讨论

通过单因素方差分析实验数据可知，在低氧刺激下，树麻雀无显著性差异。在3km-8h 组中，树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA的表达量与对照组相比，有微量增加。而3km-24h组HSP70 mRNA表达量多于3km-8h组。说明在3km低氧处理下，树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA表达量会随着时间增加，而缓慢的增加。根据LSD多重比较可知，在6km-24h组中，树麻雀肝脏处HSP70 mRNA表达量与对照组、3km-8h组和3km-24h组相比，有显著减少，可能是长时间的深度低氧处理，树麻雀肝脏组织细胞，有一部分损伤，故肝脏组织总的HSP70 mRNA表达量有大量减少。在6km-8h组中，树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA的表达量相对于对照组也有小幅减少。树麻雀在进行急性低氧处理时，刚开始有一定程度的增加，随着低氧程度和处理时间增加肝脏组织受损，造成树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA的表达量减少。

HSP70作为一种应激蛋白，动物在低氧刺激下，其表达量应有显著增加。而研究显示树麻雀肝脏组织HSP70 mRNA表达量却并非如此，甚至在6km-8h组和6km-24h组中有不同程度的降低。可能是物种不同，对低氧的刺激的感受也有所不同。我们猜测，在6km海拔高度急性低氧刺激时，树麻雀肝脏组织可能有一部分损伤，故损伤部分不能表达HSP70 mRNA，而在存活的肝脏组织细胞中，HSP70 mRNA的表达量可能有所增加。这还需要进一步的实验验证。

5 结论

在急性低氧刺激下，树麻雀随着刺激强度和时间的增长无显著差异。在急性低氧应答过程中，树麻雀肝脏组织中的HSP70 mRNA表达量在3km海拔高度的低氧刺激下随时间增长而增加；在6km海拔高度的低氧刺激下HSP70 mRNA表达量随时间增长而减少。

参考文献：

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Adaptive changes during acute hypoxia stimulate HSP70 gene

passer montanus

Abstract: Oxygen is the animal life activities indispensable element. Under hypoxic or anoxic stimulation of animal tissue cells damage or death. Heat shock protein 70 (HSP70), is a highly conserved stress proteins. In the stimulation of a variety of physical and chemical factors, HSP70 protein in cells are stable to protect the organization and structure of organisms do less damage. Currently, research on HSP70 focused on mammals, yet little research on birds. In this study, the passer montanus as the research object, which (to varying degrees of hypoxia and different processing time) liver expression of HSP70 mRNA level in acute hypoxic conditions. Experimental data show that the expression of HSP70 mRNA in liver tissue of the passer montanus in the

3km-8h group and the 3km-24h group is rising, but not significantly. In the 3km-8h group and 6km-24h group, the expression of HSP70 mRNA in liver tissue of the passer montanus has a different degree of reduction. But by LSD multiple comparisons only 6km-24h hypoxia treatment group was significantly lower than other groups.

Keywords: heat shock protein 70; hypoxia

河北师范大学本科生毕业论文（设计）评议书