肿瘤基因疫苗研究进展

肿瘤基因疫苗研究进展

基因疫苗是指将编码外源抗原的基因与质粒重组，构建出真核表达载体，导入人或动物细胞后，利用宿主细胞的蛋白质合成系统合成外源抗原蛋白，并诱导机体产生对该抗原的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。[1]肿瘤的治疗目前仍是世界性的难题, 随着免疫学和分子生物学的发展, 肿瘤疫苗的发展经历了肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗三个阶段。

肿瘤基因疫苗也称DNA疫苗, 是目前研究的热点, 主要包括与肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigen，TAAs)有关的全长、表位、独特型(Idiotype，Id)和融合脱氧核糖核酸（Deaxyribonucleic Acid，DNA）疫苗, 能够自主复制的核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）疫苗，与树突细胞（Dendric Cell，DC）相关的肿瘤基因疫苗等。

近年来, 肿瘤基因疫苗在动物基础研究和临床前研究, 甚至I期及II期临床

试验中取得了可喜的成果, 显示出广阔的应用前景。1990年Wolff等[2]首次发现将编码报告基因的DNA质粒直接肌肉注射, 能在肌细胞内获得较持久的蛋白表达。1992年Tang等[3]将表达人生长激素基因的质粒DNA导入小鼠细胞后, 诱导小鼠产

生了特异的抗人生长激素的抗体, 从而提出了基因免疫的概念。1993 年，Ulmer[4]等将可表达甲型流行性感冒（流感）病毒核蛋（Nucleoprotein，NP）的质粒DNA 注射小鼠，发现可有效地保护小鼠抗不同亚型、分离时间相隔34年的流感病毒的攻击。随后的大量动物实验都说明，在合适的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能引起体液免疫。于是，核酸疫苗技术应运而生。随后的几年其在肿瘤综合治疗中显示出很好的应用前景，从而使基因免疫的研究更加深入。

1 肿瘤基因疫苗的免疫学机制

肿瘤基因疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应机理可能是DNA疫苗转染至宿主细胞后, 将其编码的抗原蛋白提呈给免疫系统,诱导MHC-I限制性CD8+ 的CTL和MHC-II限制性的TH以及抗体产生,引起广泛的免疫应答。质粒DNA进入组织后,通过胞饮方式被摄入宿主细胞,在细胞内表达产生抗原蛋白, 细胞将表达蛋白转运至近的抗原提呈细胞(APC), 然后蛋白被多蛋白酶体系降解成为有不同抗原表位的短肽进入内质网腔内, 与MHC-I类分子结合,形成MHC-I肽复合物,递呈给并激活CD8+T细胞, 诱导产生细胞免疫反应。辅助性T细胞( HTL)则诱导和维持CTL效应。动物实验证明了抗原特异性的HTL在CTL清除肿瘤过程中所起的重要作用[2]。而另一些短肽则与MHC-I结合, 形成MHC-II肽复合物, 提呈给CD4+ T细胞使其激活,刺激抗原特异性的B细胞分泌抗体, 产生体液免疫。[5]

2 肿瘤核酸疫苗的构建

核酸疫苗的构建方法是将编码保护性抗原的目的基因片段重组到真核表达载体上，主要包括真核表达载体的选择、外源抗原基因的选择与分析、抗原基因与表达载体的连接与鉴定几个方面。

2.1 载体的选择

构建核酸疫苗的载体主要有重组质粒型载体和病毒载体（包括逆转录病毒），尤以前者较多。质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝地扩增，而在动物细胞内则能高效表达，但不复制，也不含有向宿主细胞基因组内整合的序列，一般以PBR322 或PUC 质粒为基本骨架，带有细菌复制子，真核生物的启动子（有的含

增强子）和多聚腺苷酸（PolyA）加尾信号，如pcI、pSV2、pRSV、pcDNA3.0、pcDNA3.1、pcDNA4.0、pBK、pEGFP、pCMV-β半乳糖苷酶等。

2.2 外源抗原基因的选择和分析

构建核酸疫苗的外源抗原基因可以是单个基因、完整的一组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段或数段核苷酸序列。目前肿瘤核酸疫苗主要从病毒诱导的肿瘤抗原、发育肿瘤抗原、理化致癌剂诱发的肿瘤抗原三方面着手，寻找特异性肿瘤抗原基因，已经建立了癌胚抗原和转移黑色素瘤等近50 种基因疫苗。

2.3 外源抗原基因与表达载体的连接及鉴定

外源抗原基因与表达载体的连接，即克隆进入表达载体内时，必须考虑外源基因开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）的完整性、方向、插入位置及表达基因信使（Message）RNA（mRNA）起始部位的Kazaka序列等因素。鉴定主要有酶切、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和测序鉴定。

3 肿瘤核酸疫苗的作用机理

核酸疫苗常用皮肤、肌肉、静脉接种重组DNA，均可产生保护性免疫应答。一般认为，含抗原基因的核酸疫苗被导入宿主骨骼肌细胞或皮肤细胞后，可在细胞内表达相应的蛋白质抗原，经加工后形成的多肽抗原可与宿主细胞主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）I类和Ⅱ类分子结合，并被提呈给宿主的免疫识别系统，从而可引起特异性体液和细胞免疫应答。肌细胞吸收和表达源DNA 的效力较高，这可能与肌细胞本身的结构特点有关。肌细胞可形成多核细胞，含有肌质网；骨骼肌和心肌还具有11 小管系统，该系统含有细胞外液并能伸入到细胞内部。Wolff等[6]认为，肌肉细胞通过其特有的T 小管管状系统和细胞膜穴样内陷，将外源基因纳入，在该基因携带的强启动子作用下表达相应蛋白。表达产物分别与MHCⅠ、Ⅱ类分子结合，递呈到细胞表面，与MHC Ⅰ类分子结合的短肽激活CD8+ T 细胞［细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）］，与MHCⅡ类分子结合的短肽则激活CD4+ T 细胞［辅助性T 细胞（T Helper Cell，Th 细胞）和炎性T 细胞］，而分泌到细胞外的抗原则被带有相应抗体的B细胞捕捉，并在TH 细胞分泌的细胞因子作用下转化为浆细胞，大量产生抗体。

4 肿瘤DNA 疫苗的应用

4.1 前列腺特异性膜抗原疫苗

前列腺癌由于其具有能表达一系列的TAA和其解剖部位的易接触性等特点，而适于基因免疫治疗，尤其适于肿瘤核酸疫苗（DNA 疫苗）治疗的临床研究。在诱导肿瘤特异性免疫应答的研究中，选择免疫原性强、特异性好的肿瘤抗原编码基因，是构建高效性、靶向性抗肿瘤疫苗的基础，而前列腺特异性膜抗原（Prostate Specific Membrane Antigen，PSMA）是具有较高的前列腺癌特异性的TAA[7]。汪波[8]等用脂质体转染法，分别将PSMA-pcDNA3.0质粒和pcDNA3.0 质粒转染至

SP2/0细胞，G418筛选后获得了稳定生长的阳性克隆细胞株，建立了稳定表达PSMA 的小鼠肿瘤细胞模型。通过进一步的实验发现，PSMA基因疫苗能诱导实验组小鼠产生特异性体液及细胞免疫应答，且有明显的抑瘤效应[9]。

4.2 人黏蛋白（Mucin，MUC）1 基因疫苗

人MUC 1是一种高糖基化、高分子量的糖蛋白。由胞外段、跨膜段、胞内段组成。正常情况下广泛分布于人的消化道、呼吸道、胰腺、泌尿生殖道、乳腺等多种上皮细胞，对正常人体的上皮组织起润滑和保护作用，同时介导信号转导和细胞黏附。由于MUC 1与肿瘤的发生发展密切相关，该分子已被用于多种肿瘤的生

物学治疗。罗刚等[10]通过实验证明，MUC1 基因DNA 疫苗能够诱导小鼠产生抗MUC1 特异性抗体，诱导产生杀伤表达MUC1 细胞的CTL，为MUC1 基因疫苗用于膀胱肿瘤生物治疗提供了一定的实验依据。袁时芳[11]等在小鼠实验中发现，MUC1 基因疫苗可诱导小鼠产生特异性CD8+T 淋巴细胞及体液免疫应答。

4.3 黑色素瘤抗原疫苗

黑色素瘤的化疗效果很差，有效率＜25％而黑色素瘤的免疫治疗开展较早，取得的经验也较丰富。Triozzi 等经动物实验证实，无论是重组蛋白疫苗，还是DNA 疫苗都获得了抗肿瘤免疫反应。研究表明，黑色素瘤抗原（Melanoma Antigen, MAGE）-3的单表位疫苗能够诱导机体产生黑色素瘤特异性的CTL，并使肿瘤消失。黑色素瘤及其转移瘤的抗原表达变异很大，如36％的原位黑色素瘤和76％的转移肿瘤表达MAGE-3。另外，约有50％的黑色素瘤表达酪氨酸激酶。因此，单表位的DNA 疫苗难以对付黑色素瘤抗原的高度变异性，多表位DNA 疫苗可以攻击黑色素瘤的多个靶抗原，以防止黑色素瘤因肿瘤抗原表达的差异而逃逸。

4.4 癌胚抗原（Carcino-embryonic Antigen，CEA）

疫苗 CEA 是最早发现的TAA，属于胚胎性癌蛋白。CEA 已作为肿瘤标志物，用于一些肿瘤的辅助诊断与监测。近年，以CEA为靶点的肿瘤免疫治疗, 特别是在CEA肿瘤疫苗的研究方面取得了很大进展。黄爱强等[12]从肿瘤组织中成功地获取了CEA 互补（Complementary）DNA（cDNA），所构建的pVCEA2 重组质粒能在体外培养细胞中同步表达CEA和白细胞介素（Interleukin，IL）-2蛋白分子。同样，Facciabene 等的实验也证实，编码CEA 的重组体，在小鼠体内诱导了CEA 特异性的体液和细胞免疫反应，这为进一步体内实验研究基因治疗CEA 阳性肿瘤提供了新的途径。王代友等[13]采用逆转录（Reverse Transcription，RT）-PCR技术、基因重组技术，成功地克隆了CEA 基因并构建了其基因疫苗，为进一步研究CEA 基因疫苗抗肿瘤的实验打下了基础。

4.5 根据病毒相关抗原构建的DNA

疫苗由病毒引起的肿瘤或与病毒密切相关的肿瘤约占人类肿瘤的15％，其肿瘤细胞抗原多为病毒的产物。根据这一特点，构建编码病毒抗原的DNA 疫苗免疫机体后，其表达的特异性病毒抗原将诱导产生特异性抗体和CTL 反应，可以杀死肿瘤细胞，使肿瘤退缩。任会均等通过实验发现，负载肿瘤相关病毒抗原基因的冻融DC 疫苗，保持了功能成熟DC的形态特征，且能诱导高效的特异性抗肿瘤免疫应答。宋朝君等构建了针对肿瘤抗原B 细胞受体相关蛋白（B-cell

Receptor-associated Protein，BAP）31的全长基因疫苗，以其免疫C57BL/6 鼠，可诱导特异性体液和细胞免疫反应，其中构建的P-L-BAP31基因疫苗各项免疫反应均优于P-BAP31。

5影响肿瘤基因疫苗效果的因素

5.1 质粒结构和基因序列

以CpG为核心的核苷酸序列在基因免疫中发挥了佐剂的作用。这些含未甲基化的以CpG核心的回文结构被称为免疫刺激DNA 序列( ISS ), 如5. GACCGTC3.、5. AGCGCT3.,它们在脊椎动物中出现的几率很小, 而常出现于细菌基因组中。因此, 脊椎动物能分辨质粒DNA 中非甲基化的CpG为核心的序列, 产生免疫激发。CpG 核心的序列可以显著提高抗肿瘤单克隆抗体在小鼠中的抗瘤效果。Weiner等[14]

将含CpG为核心的DNA 同一种抗淋巴瘤抗原免疫小鼠, 使小鼠能抵抗攻毒试验。CpG 序列的这种免疫激活功能主要通过刺激B细胞增殖和激活单核巨噬细胞系统、DCs和T 细胞, 介导释放多种细胞因子, 如IL-12、TNF-A、IFN-A、IFN-B、IFN-C

等, 增强体液免疫和以TH1 为主的细胞免疫反应。真核表达载体是DNA疫苗的主体, 应用高效的表达载体能促进抗原肽的进一步表达和增强免疫应答的强度。真核表达载体pC I-neo由于带有CMV的启动子和源于球蛋白基因的内合子序列, 被认为是表达能力最强的质粒之一。启动子的类型直接影响到质粒DNA在体内表达外源蛋白的水平, 因而要引入强有力的启动子, 能保证DNA的有效表达并诱导免疫应答。

5.2 基因佐剂对免疫应答的影响

细胞因子可以改变免疫应答的强度, 许多细胞因子能增强常规诱导的免疫反应。在DNA疫苗接种后, 给予少量的IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IFN、GM-CSF等, 可显著增加抗体的效价。IL-15可提高T 细胞对抗原的反应, 房文亮等构建了柯萨奇病( CVB3) VP1的DNA疫苗,与IL-15表达质粒共同注射小鼠, 结果显示共同免疫使抗体滴度显著升高, 小鼠的生存时间也明显延长。显示IL-15基因对CVB3 VP1 DNA 疫苗诱导的免疫应答和免疫保护有一定的增强作用。低剂量的

IL-15[(25～100)×103U/L]可以维持NK细胞的杀伤活性并促进NK细胞增殖[15]。

IL-18可通过CD4+T 细胞和NK细胞引起潜在的抗瘤效应。江文正等[16]构建了HIV-1核心蛋白gag、外膜蛋白gpl20的融合表达质粒pVAXGE和编码IL-18的真核表达质粒pVAXII-18。将两者共同肌注射免疫BALB/c系小鼠, 结果显示联合免疫组小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平均显著高于单独免疫组, IL-18 发挥了明显的免疫佐剂作用。GM-CSF可以提高粒细胞、巨噬细胞活性, 增强MH C-I类、MHC-II类分子和B7的表达以及抗原提呈细胞的成熟和功能。这些表明细胞因子在基因免疫中起到一个免疫佐剂的作用。共刺激分子也是一种免疫佐剂, 它能使髓源性APCs或非专职APCs更易提呈抗原,提高DNA 疫苗产生TH 1型免疫反应。另外,磷酸钙与磷酸铝也可发挥佐剂作用。将磷酸钙磷酸铝与HBV DNA疫苗混合注入小鼠肌肉, 抗体效价显著提高,增强了免疫效应。

6 应用现状及展望

由于核酸疫苗具有许多独特的优点，所以基因疫苗的研究成为疫苗研究领域的热点之一，特别是其联合免疫的优点极为诱人。但毕竟其研究与发展的历史比较短暂，仅十几年的时间。因此，不可避免地存在着许多问题，如有效目的基因的选择、完美载体的构建、目的基因的高效表达、应用对象、安全性、免疫耐受性、抗原进入机体后表达难以调控、婴儿免疫后因代谢太快而无法持续表达和污染等，这些都是核酸疫苗发展尚待解决的问题。但相信随

着基础研究和临床应用的进一步深化，这些问题都将会得到圆满的解决。

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