生化实验技术课程 学习指南

生化实验技术课程  学习指南
生化实验技术课程  学习指南

生化实验技术课程学习指南

1.课程内容:

生命科学作为二十一世纪发展最为迅速的学科之一,生物化学技术则是其任何研究进展的技术支撑,是现代生物技术的重要组成部分。生化实验手段不仅推动了本学科的进展,而且被生物其他学科利用,促进了各学科的共同发展。生化实验技术的学习已经成为理解近代生命科学的重要基础之一。

本课程学习分基础实验与综合设计两个渐进式技能训练模块进行,其中基础实验内容主要学习生物化学的基本实验技术,包括验证与分析生化物质的6大主要类型(蛋白质、酶、DNA、糖、脂类、维生素等)和生化代谢过程的基本技术方法。内容涉及生化物质的定性、定量分析测定、电泳鉴定和代谢检测等,即课内完成8个实验项目的操作训练;同时鼓励学生自行设计实验内容,达到教学训练目标。

表1基础实验模块教学内容及技能点

综合设计实验模块内容为选取蛋白质、核酸两大类生化大分子物质提取制备和鉴定实验项目为载体,以生物化学理论为指导,设计综合贯穿生化分离检测实验的经典技术为主线的实验内容,学习生化材料预处理、沉淀技术、膜分离技术、层析技术(凝胶、离子交换、亲和析)、电泳技术、化学检测、光学检测等,以及生化产品分析鉴定的实验技术理论与操作方法。教学课时内完成2个大主题方向的实验内容,即蛋白质分离纯化鉴定、基因组提取纯化与PCR 鉴定。学生可自选各方向一个实验项目设计方案并完成操作训练,也鼓励学生选择大纲外感兴趣的实验项目,如多糖、酶等大分子物

质作为实验对象,同样设计并完成操作,达到教学要求的目标。

表2综合设计实验教学内容及技能、知识点

2.学习方法:

本课程基础实验教学采用全程参与、合作讨论、问题式、滚动式教学方法,实验教学改变书本——课堂——教师为中心的传统教学方法,建立以学生为主体、师生互动、全程参与、合作讨论式的教学形式。基础实验整个过程对学生进行强化及严格训练,每个实验项目从查阅资料、实验准备、实验操作、结果分析等整个实验活

动都由学生来完成,整个实验活动的实施主体是学生,实验过程突出学生自我训练为主,全程参与式的实验教学方法。每次课堂实验教师用半节课的时间分次讲解实验的知识要点、关键操作和注意事项。教师作为出题者、组织者、裁判者、实验配合及指导者,引导学生完成整个实验过程,以充分培养学生独立分析问题、解决问题的能力和综合表达能力。督促学生认真预习理解每一个实验内容、设计思路和实验关键,提高实验教学效果。通过对实验结果与实验过程中出现问题的讨论,加深对实验原理与实验理论的理解及实验技能的掌握,提高学生学习能力、分析问题与解决问题能力,并强化实验基础操作能力。

在实验室教师根据教学大纲要求开设实验项目,每个项目配套相应几套实验器材及仪器,保证每组学生一套;同一个实验室同时开设2个实验项目(同一个主题),同一个课堂时间内学生各自进行实验,在学期内轮流完成大纲所规定的全部实验。2个学生为一个小组(实验操作组),共同完成课堂实验操作过程;3-4个小组为1个大组(实验研讨组),共同完成课前试剂配制、课前研讨和课后研讨、汇报交流等内容;每个班级分为4个大组。

学期初在生化实验技术网站(https://www.360docs.net/doc/5010781975.html,/)的在线实验管理平台上发布实验项目→课外组织学生培训实验项目实施流程→学生分组(大组、小组)→实验项目安排→教师网上布置每个实验项目预习讨论思考题→学生查阅资料,项目内容预习→课前网上递交思考题作业→教师批阅→书写实验项目预习报告→学

生课前以大组为单位准备实验材料及试剂→进入实验室实验(教师抽查预习情况→介绍相关四个实验内容重点技术及难点→学生以小组组为单位进行不同的实验项目实验→学期内分段轮回完成大纲规定实验项目)→教师巡回指导、学生互助指导→完成实验报告→课后大组讨论→期中,期末两次全班课堂交流汇报总结。具体见学习流程图1

图1基础实验模块课程教学组织实施流程

综合设计实验模块教学实验采用自主设计、研讨合作式的实验教

学模式,推行以学生自我训练为主、全程参与、科研式的实验教学法。学生可以根据课外学习情况与兴趣自主选择实验内容,自主设计实验方案和选择实验时间,以学生合作完成实验内容为主的学习。实验中从查阅资料、方案设计、实验准备到实验讲解、实验操作、结果分析等整个实验活动都由学生自行完成,整个实验活动的实施主体是学生,教师仅仅是出题者、组织者、指导者与裁判员,起到督促学生认真预习理解每一个实验内容、设计思路和实验关键,提高实验教学效果作用。具体学习流程如图2所示。

图2 综合设计实验模块教学组织实施流程

3.课程学习要求:

1).课前预习:明确实验目的、原理、方法及操作中的注意事项,并写出实验预习报告。完成预习思考题。设计综合及应用设计部分实验学习前,务必对生化实验技术原理与方法部分做好学习,完成课前设疑内容,明确实验目标、查阅资料,写好实验设计方案。

2).实验过程:基础实验按照实验指导书所列步骤和要求实施实验操作,设计综合及应用设计实验项目,鼓励学生综合所学知识开拓创新,运用多种实验方法完成实验目标,也可根据指导书示例进行操作学习。

3).实验结果与分析:真实记录实验结果数据,对结果要认真分析,得出结论;异常的结果要分析并找出原因。坚持实验的严肃性、严格性、严密性。

4).讨论与报告:对实验结果进行分析研讨,写出实验报告或小论文,并汇报交流实验收获和知识拓展情况。

5).注意事项:严格遵守大型精密仪器操作管理及生化实验室规则,防止各种事故发生。

4.课程学习评价:

本课程两模块学习评价采用过程式、多元素评价方式详见表3。

表3 生化实验技术课程成绩构成表

实验研讨成绩20% 15%

实验预习思考题10%

实验设计15%

实验报告10%

实验操作考试20% 15%

实验原理理论考试30% 15%

平时表现与出勤10% 10%

实验小论文30%

自主设计实验:符合学习要求、设计方法与结果具有创新,经审核

可获课程满分。

5.课程学习服务平台与资源:

生化实验技术课程两个模块教学具有国家精品课程网((https://www.360docs.net/doc/5010781975.html,/)平台支持,学习时所需求的资源丰富,每个项目实验都配套制作了实验教学PPT课件、网上学习资料、

实验操作动画演示等学习资源,并具有学生上网学习及提交作业、教师批改功等在线管理功能。

课程主要参考教材:钱国英主编,《生化实验技术与实施教程》浙江大学出版社;陈雅蕙、余瑞元等编写,《生物化学实验原理和方法》,北京大学版社。

2015高级生物化学及实验技术试题答案

高级动物生化试题 问答题: 1. 简述非编码RNA(non-coding RNA)的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA(transfer RNA,tRNA) 结构特征之一是含有较多的修饰成分,核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的,但其功能不清楚。5’末端具有G(大部分)或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环,在这一环的顶端有三个暴露的碱基,称为反密码子(anticodon).反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构,tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息,并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体,同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用,又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能,例如,在没有核糖体或其他核酸分子参与下,携带氨基酸转移至专一的受体分子,以合成细胞膜或细胞壁组分;作为反转录酶引物参与DNA合成;作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA(ribosomal RNA, rRNA) 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA,在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。

他们是核糖体的组分,并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”,蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象,但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明,rRNA并非仅仅起到物理支架作用,多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如:核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构,同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成,与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环,类似tRNA中的二氢尿嘧啶环,称为“D”环。H3和H4,H6和H7,H8和H9,H10和H11之间分别形成Pk1,pK2,pK3,pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成,类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环,称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域(TLD)和mRNA类似域(MLD),TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环,MDL则包括ORF和H5,这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器(如叶绿体,线粒体)中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能,它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时,它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关,是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体,也识别那些延迟停转的核糖体,介导这些有问

《生物制药技术》实验指导-实验三、四

《生物制药技术》实验指导 实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定(验证型) 实验目的: 掌握薄层层析的原理,四环素族抗生素的定性鉴定方法。 实验原理: 层析(色谱,chromatograpby)是相当重要、且相当常见的一种技术,在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相,把液体(与上述液体不相混合的)或气体作为移动相的系统中(根据移动相种类的不同,分为液相层析和气相层析二种),使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动,利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差,将它们彼此分离开的定性与定量分析方法,称为层析,亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等,或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析(column chromatography),在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物(硅胶、纤维素和淀粉等)作为固定相的称为薄层层析(thin layer chromatography),或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质(试料)间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的,有时常见到其中间类型。此外,近来也应用亲和层析,即将与基质类似的化合物(通常为共价键)结合到固定相上,再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。 分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质,这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解,但分配系数不同,展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时,在一定温度下达到平衡后,溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数,称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时,它们就能被分离开。分配系数大的移动快(阻力小)。 薄层层析是以薄层材料为支持物,在密闭容器中,样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时,可利用适当的显色剂,或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作,各成分呈斑点状移动到各自的位置上,再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能,通过薄层图谱与对照品的图谱相比较,除了能鉴出有效成分或特征成分外,还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速,能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性,现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一,层析后进行显色,并绘制层析图谱,根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。 材料、试剂和器材: 仪器和设备: 玻璃层析缸;层析板(薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售);吹风机;紫外投射仪;离心机(1.5ml转子) 试剂:

八种常用生化实验步骤

实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)是体外克隆基因的重要方法,它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因,同时完成了基因在体外的克隆,是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增,具体可分为三个主要过程:一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂,形成单链DNA分子,温度为94℃,时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃,时间1min。三、延深。升高温度,在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP,实现模板的扩增,温度为72℃,时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟,使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后,在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分: 1)热稳定性DNA聚合酶:Taq DNA聚合酶是最常适用的酶,商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2)寡核苷酸引物:寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3)脱氧核苷三磷酸(dNTP):标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸,即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间,高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用,可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4)二价阳离子:一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶,由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合,因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5)维持PH值的缓冲液:用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间,标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时,反应体系的温度将下降1个多单位,致使缓冲液的PH值接近7.2。 6)一价阳离子:标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl,它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7)模板DNA:含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中,闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液(20mmol/L,PH 8.0) Tap DNA 聚合酶 5端引物(20μmol/L)及3端引物(20μmol/L) 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪(Bio-Rad公司)移液枪(0.5-10μL 5-50μL)枪头微量移液管 一、实验操作 1)按照以下次序,将各成分加到微量离子管内混合: 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl

污水处理生化调试技术方案

污水处理生化调试技术方案 一污泥的培养 方法有同步与异步培养与接种,同步是培奍与驯化同时进行或交替进行,异步是先培后驯化,接种是利用类似污水的剩余污泥接种。 活性污泥可用糞便水经曝气培养而得,因为粪便污水中,细菌种类多,本身含有的营养丰富,细菌易于繁殖。?通常为了缩短培菌周期,我们会选择接种培养。?先说粪便水培菌?具体步骤:?将经过过滤的粪便水投入曝气池,再用生活污水或河水稀释,至BOD约为300-400,进行连续曝气。这样过二,三天后,为补充微生物的营养物质和排除由微生物产生的代谢产物,应进行换水,换水根据操作情况分为间断和连续操作。?1.间断操作:?当第一次加料曝气并出现模糊的活性污泥绒絮后,就可停止曝气,使混合液静止沉淀,经1-1.5小时后排放上清液,把排放的上清液约占总体积的60-70%。?然后再加生活污水和粪便水,这时的粪便水可视曝气池内的污泥量来调整,这样一直下去,直至SV达到30%。一般需2周,水温低时时间要延长。 在每次换水时,从停止曝气,沉淀到重新曝气的总时间要控制在2小时之内为宜?成熟的污泥应具有良好的混凝,沉降性能,污泥内有大量的菌胶菌和终生?纤毛类原生动物,如钟虫,等枝虫,盖纤虫等,并可使污水的生化需氧量去除率达90%左右 2.连续操作:?在第一次加料出现绒絮后,就不断地往曝气池投加生活污水或河水,添加粪便水的控制原则与间断投配相同。往曝气池的投加的水量,应保证池内的水量能每天更换一次,随着培奍的进展,逐渐加大水量使在培养后期达到每天更换二次。在曝气池出水进入二次沉淀池后不久(0.5-1)就开始回流污泥,污泥的回流量为曝气池进水量的50%?驯化的方法:可在进水中逐渐增加被处理的污水的比例,或提高浓度,使生物逐渐适应新的环境开始时,被处理污水的加入量可用曝气池设计负荷的20-30%,达到较好的处理效率后,再继续增加,每次以增加设计负荷的10-20%为宜,每次增加负荷后,须等生物适应巩固后再继续增加,直至满负荷为止。?如果被处理工业污水中,缺氮和磷以及其它营养物时,可根据BOD:N:P为100:5:1的比例来调整。?个人认为在此阶段,必要的超赿管路要具备,工艺没设计的可用消防管代替。 而且各种分析要跟上去,和种参数需及时测定,特别是镜检,因为有经验的人可能通过镜检和数据就可以很好的完成任务,另外良好的心理素质也比较重要,有些现象要果断处理,有些则需等侍再认定上面是异步法,同步就是在污泥培养过程中,不断加入工业污水,使污泥在增长过程中逐渐适应工业污水的环境,这样虽可缩短培养和驯化的时间,但在这一过程中发生的问题,又缺实践经验则难以判断问题出在哪一个环节上。 若有条件,就是接种培养,这样可缩短时间,若是相似的污水的污泥,更可提高驯化效果。 二、试运行

生化实验基本原理及技术

生物化學實習 1 緒論 (一) 原理 1. 光依據其波長來分類: (1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光 2. 光通過溶液時,特定波長的光被吸收,眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。 核黃素會吸收450nm 的光,紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。

第一單元 生化實驗基本原理及技術 2 圖1-1光譜儀 光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物,主要原理是基於兩個物理定律:1.柏朗定律;2.比爾定律 。 1. 柏朗定律:每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值,被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值,每一單位厚度溶液若吸收10%的光,則光經過每一單位厚度溶液時,其強度即減少10%。 I =I 0 ? e -αι I :穿透光強度 I 0:入射光強度 α :溶液吸光係數 ι:光路徑長度 柏朗定律中以對數為底轉換公式,將吸光係數α轉換成比例常數K → log 10 I 0 / I =K ι log 10 I 0 / I = 吸光值(absorbance ;A) 或光密度值(optical density ; OD)

生物化學實習 3 2. 比爾定律:光經過吸光物質所產生的吸光值,與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。 比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。 K =εc ε:消光指數 c :吸光物質濃度 I = I 0? 10-εc ι log 10 I 0 / I = A =log 1010εc ι= εc ι 當ι(光路徑長度)=1 cm 時 log 10 I 0 / I = A =log 1010εc = εc 特定溶質在特定波長下,消光係數ε為一常數。因此,當吸光物質的濃度變成兩倍,於相同的光路徑下,被吸收的光量也會變成兩倍。 圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉,pH 7.06,1公分 光路徑(light path)的條件下測定 波長 吸 光 值

《分子生物学检验技术》实验指导

《分子生物学检验技术》实验指导 【实验目的】 把握动物组织DNA提取的方法; 把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。 【实验原理】 获得相当纯度和完整性的基因组DNA,可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此,DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求:①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染;③排除RNA分子的污染和干扰。 DNA以核蛋白形式存在于细胞中,提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离,又要保持DNA分子的完整。本实验中,用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS)消化破裂细胞膜、核膜,并使组织蛋白变性沉淀,DNA从核蛋白中游离分开;为操纵组织中脱氧核糖核酸酶(DNase)对DNA的降解,加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)以除去兴奋该酶的金属离子,SDS也能使DNase变性失活;蛋白酶K可水解蛋白质,消化D NA酶;分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质,接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染;最后用无水乙醇沉淀DNA,得到欲提取的基因组DNA。

260nm处DNA有最大吸取峰,测DNA的A260,可运算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸取峰,可测定A260nm/A280nm比值,检测DNA的纯度,该比值介于1.8~2.0之间。 【实验器材和试剂】 1、动物 小白鼠 2、设备 移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等;751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。 3、试剂 (1)基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技公司):包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K (7)生理盐水,4℃贮存 (8)无水乙醇、70%乙醇 【操作步骤】 1、制备肝匀浆 迅速处死小白鼠,称取新奇肝脏组织50 mg,用预冷生理盐水洗去血液,滤纸吸干后剪碎组织,将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨,同时加入300 μl Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管,加入1.5 μl蛋白酶K,漩涡震荡10 s,55℃孵育直到组织溶解(约1小时)。 2、提取DNA (1)加入1.5 μl RNase A,颠倒混匀,37℃孵育15-60 min。

生化制品技术实验指导

《生化制品技术》实验大纲 一、实验目的 本实验是《生化制品技术》课程的配套实验,目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。 二、适用专业及层次 适用于生物制药技术专业学生 三、实验内容和学时分配

实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。 二、实验原理 乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中,合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白(caseins),酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出,但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质,可先将pH降至4.8,或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠,将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇,这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右,能使乳蛋白素沉淀析出,部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后,即可得粗乳蛋白素。 三、实验器材 烧杯(250ml和100ml)、玻璃试管(10mm×100mm)、离心管(50ml)、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。 四、试剂和材料 脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L (pH4.6)、乙醇。 五、操作步骤

1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白 (1)将50ml牛乳倒入250ml烧杯中,于40℃水浴中加热并搅拌。 (2)向上述烧杯中缓缓加入(约10min内分次加入)10g无水硫酸钠,再继续搅拌10min(或加热到40℃,再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液,直到pH达到4.8左右,将悬浮液冷却至室温,放置5min)。 (3)将溶液用细布过滤,分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中,倾于布氏漏斗中,过滤出去乙醇溶液,抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出,在表面皿上摊开以除去乙醇,干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素 (1)将制备酪蛋白操作步骤(3)所得滤液置于100ml烧杯中,一边搅拌,一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。 (2)将溶液倒入离心管中,6000r/min离心15min,倒掉上层液。 (3)在离心管内加入10ml去离子水,振荡,使管内下层物重新悬浮,并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5~9.0(以pH试纸或pH计判定),此时大部分蛋白质均会溶解。 (4)将上述溶液以6000r/min离心10min,上层液倒入50ml烧杯中。 (5)将烧杯置于磁搅拌加热板上,一边搅拌,一边利用pH计以0.1mlo/L 盐酸调整pH至3±0.1。 (6)将上述溶液以6000r/min离心10min,倒掉上层液。取出沉淀干燥,并称重。 六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量,并与理论产量(3.5g)相

运动生物化学实验指导

运动生物化学实验指导 实验一实验基本技术操作 一、实验目的 (一)了解实验室规则及注意事项。 (二)学习运动生物化学实验常用仪器的使用及清洗方法。 (三)学习721型分光光度计的使用方法。 二、实验原理 运动生物化学是研究人体运动时体内的化学变化。运动生物化学的实验方法基本上是化学的方法,用定量及定性的分析方法来观察机体内物质代谢的规律,所以实验时必须做到定性的洁净及定量的精确,因此实验取样要准确、样品要无污染。 对于相同物质和相同波长的单色光来说,溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。配制各种浓度的CuSO4溶液,然后在780nm波长下比色,测定各种浓度的CuSO4溶液吸光度值,并制作曲线图。 三、实验器材 试管、CuSO4溶液、蒸馏水、721分光光度计、移液管、吸耳球等。 四、实验步骤 (一)玻璃仪器的清洗。 (二)使用移液管的移液操作及721分光光度计的使用。 取4支大试管,编号,按表7-1进行操作: 表7-1 CuSO4溶液的测定 以CuSO4溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,将3种不同浓度的CuSO4溶液的光密度值分别点在坐标纸上,通过3点绘制成曲线图,并对实验结果进行分析。 五、注意事项 (一)玻璃仪器清洗后注意检查,管壁不能留有水珠。 (二)使用移液管吸取液体时一定要缓慢平稳,不要太快、太猛。 六、作业与思考 (一)玻璃仪器的清洗有哪些基本要求? 实验二血红蛋白的测定 血红蛋白(Hb)是红细胞中的一种重要蛋白质,1分子的Hb是由4分子的亚铁血红素和1分子的珠蛋白结合而成的。 Hb的主要生理功能是运输氧气(O2)、二氧化碳(CO2)和对酸性物质(H+)起缓冲作用,参与体内的酸碱平衡调节。运动时机体需氧增加,故血红蛋白增加,有利于为组织提供氧气,促进物质的有氧代谢和带走CO2,而且也能起中和酸性的作用。如果血红蛋白下降,氧供应减少,影响运动能力。 运动员安静时血红蛋白值与正常人没有明显差异。一般人Hb的正常值男性为120-160g/L;女性110-150g/L。临床上常用判断贫血的标准,即成年男性低于120 g/L;成年女性低于110 g/L;而14岁以下的少年、儿童,不论男女,均以低于120 g/L作为贫血。

生化实验五大技术

生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:(图1-1光吸收示意) 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率,L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:

可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法; 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中,在电场的作用下,向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带,用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比,与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大,带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远,质点所带净电荷越多,电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压),博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂,琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小,消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快,电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球

生化制品技术实验指导教学内容

生化制品技术实验指 导

《生化制品技术》实验大纲 一、实验目的 本实验是《生化制品技术》课程的配套实验,目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。 二、适用专业及层次 适用于生物制药技术专业学生 三、实验内容和学时分配

实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。 二、实验原理 乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中,合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白(caseins),酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出,但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质,可先将pH降至4.8,或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠,将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇,这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH 调至3左右,能使乳蛋白素沉淀析出,部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后,即可得粗乳蛋白素。 三、实验器材 烧杯(250ml和100ml)、玻璃试管(10mm×100mm)、离心管(50ml)、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。 四、试剂和材料 脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L (pH4.6)、乙醇。 五、操作步骤 1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白

(1)将50ml牛乳倒入250ml烧杯中,于40℃水浴中加热并搅拌。 (2)向上述烧杯中缓缓加入(约10min内分次加入)10g无水硫酸钠,再继续搅拌10min(或加热到40℃,再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液,直到pH达到4.8左右,将悬浮液冷却至室温,放置5min)。 (3)将溶液用细布过滤,分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中,倾于布氏漏斗中,过滤出去乙醇溶液,抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出,在表面皿上摊开以除去乙醇,干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素 (1)将制备酪蛋白操作步骤(3)所得滤液置于100ml烧杯中,一边搅拌,一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。 (2)将溶液倒入离心管中,6000r/min离心15min,倒掉上层液。 (3)在离心管内加入10ml去离子水,振荡,使管内下层物重新悬浮,并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5~9.0(以pH试纸或pH计判定),此时大部分蛋白质均会溶解。 (4)将上述溶液以6000r/min离心10min,上层液倒入50ml烧杯中。 (5)将烧杯置于磁搅拌加热板上,一边搅拌,一边利用pH计以 0.1mlo/L盐酸调整pH至3±0.1。 (6)将上述溶液以6000r/min离心10min,倒掉上层液。取出沉淀干燥,并称重。 六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量,并与理论产量(3.5g)相比较。求出实际获得率(%)。

生化试验技术

生化试验技术 绪论 1.生物体内某一组份,大致可分为五个基本阶段: (1)确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法。 (2)制备物物理化学性质稳定性的预备试验。(3)材料处理及抽提方法的选择。 (4)分离纯化方法的摸索。(5)获得制备物以后,均一性的测定。 2 1 2 (1)呈色法;(2)色谱法;(3)光谱法;(4)电泳法;(5)核磁共振波谱法。 (6)其他:如电子显微镜观察。 理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速,能及时指导分离制备工作。 3 3.好的分析鉴定方法必须满足以下要求: 1)特异性和专一性强;2)重现性好;3)准确度大;4)灵敏度高;5)手续简便。4.制备物的理化性质及稳定性的预试验是对一个未知物质分离制备实验设计的基础。5.材料的处理: 1)选材:(1)工业生产:材料来源丰富、含量高、成本低; (2)未知物质:只要达到实验目的即可。 2)预处理:保证材料的纯净; 3)组织破碎方法:(1)机械法:组织捣碎机,匀浆器,研钵和研磨、压榨机 (2)物理法:(1)反复冻融法(2)急热骤冷法: (3)超声波处理(3)化学及生物化学法:(1)自溶法(2)酶解法(3)表面活性剂处理⑷溶胀法6.使生物活性物质保持活性,主要措施常有如下几点: 1)采用缓冲液。2)加入保护剂。3)抑制水解酶的破坏 4)一些特殊的措施:引起生物大分子变性的因素,如紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等均应避免,有的还要求提取时无氧等。 第一章 1.蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法? 1)溶解度不同:如盐析、有机溶剂分级沉淀法; 2)分配系数不同:如分配层析法3)吸附性不同:如吸附层析法; 4)在电场中运动速度不同:如电泳法5)沉降系数或密度不同:如离心法; 6)分子量不同:如凝胶过滤层析法、SDS-PAGE法; 7)生物学特性不同:如亲和层析法; 2.蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项? 蛋白质的分离提取的一般步骤为:一般来说,蛋白质的制备包括以下过程:

生物化学实验报告

实验一糖类的性质实验 (一)糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 (一)α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸(硫酸、盐酸)作用下,脱水生成糠醛及糠醛衍生物,后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性,故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 莫氏试剂:5%α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g,溶于95%酒精中,总体积达100 mL,贮于棕色瓶内。用前配制。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 1%淀粉溶液100 mL %糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管,分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、%糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂,充分混合。倾斜试管,小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL,慢慢立起试管,切勿摇动。 观察记录各管颜色。 (二)间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下,酮醣脱水生成羟甲基糠醛,后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢,只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时,才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 塞氏试剂:%间苯二酚-盐酸溶液1000 mL,称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中,再用蒸馏水稀至1000 mL。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 4、实验操作

生物化学实验思考题

生物化学实验思考题

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生物化学实验考试试题

细胞破碎 1 常用的细胞破碎的方法有哪些? 机械法:研磨,高速捣碎机;物理法:反复冻溶,超声波破碎,压榨法;化学与生物化学法:自溶,溶胀法,酶解法,有机溶剂处理。 2 有机溶剂法破碎细胞原理,常用的有机溶剂有哪些? 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等 3酶法破碎细胞原理:酶分解作用 4反复冻融法破碎细胞原理:通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用 层析技术 1.什么叫层析技术? 层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别(分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相,其中一个是固定相,另一个是流动相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 2、按层析过程的机理,层析法分哪几类?按操作形式不同又分哪三类? 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 3.指出常用层析技术的应用范围。 凝胶层析法:⑴脱盐;⑵用于分离提纯;⑶测定高分子物质的分子量;⑷高分子溶液的浓缩离子交换层析法:主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质,也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子 高效液相层析法:⑴液-固吸附层析;⑵液-液分配层析;⑶离子交换层析 4.SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么? 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。 5.用SephadexG25脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰?蛋白质 6.相对分子量为8万和10万的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开?为什么?不能,分子量差距太小。 7.将分子量分别为a(90000)、b(45000)、c(110 000)的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析,正常情况下,将它们按被洗脱下来的先后排序。c、a、b 8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高?离子交换层析较高。 9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6),在pH4条件下,这两种氨基酸那一种与CM(阳离子交换剂)结合的紧密?如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱,那种氨基酸先洗脱出来?Ala 10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些? 用水灌注、不能有气泡。 11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则

生化制备技术实验操作指导

生化制备技术实验操作指导 温州大学生命与环境科学学院 2012年2月

实验须知 1.实验室规则 (1) 实验课须遵守实验室开放时间,应自觉遵守课堂纪律,严禁在实验室吃东西、大声喧哗等行为。每组成员可按个人时间协作完成实验过程,但必须每位成员都参与到实验当中,并由组长预先提交实验分工安排书,交予指导教师作为签到依据。 (2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯净, 严防混杂污染。 (3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验室。实验仪器为配套使用,不可随意调换。每组组长在实验进行之前及结束之后负责对仪器和耗材进行清点,及时反映问题。 (4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。使用精密仪器时, 应严格遵守操作规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。 (5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告, 实验课程完全结束后由学习委员收齐交给教师。 (6) 仪器损坏时, 应如实向教师报告, 认真填写损坏仪器登记表。 (7) 实验出现问题,不建议盲目重做,应及时总结原因,给出合理解释。实验课不完全以最终实验结果为评分依据,更重要的是考察分析问题和解决问题的能力。 (8) 每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。 2.实验记录 实验课前应认真预习实验内容,将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。实验记录本要标明页码,不能随意撕掉任何一页。实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的现象、结果和得出的数据,应及时直接记在记录本上,绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。 3.实验报告的书写 实验结束后,应及时整理和总结实验结果, 写出实验报告。 (1)标题 标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验室条件。 (2)实验目的 (3)实验原理

生化试验基本技术

第二章生化实验基本技术 第一节离心分离技术 离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一,也是生化实验室中常用的分离、纯化的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多,按照使用目的,可分为两类,即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料,每次分离样品的容量比较大,后者则主要用于研究纯品大分子物质,包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质,每次分析的样品容量很小,根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测),能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。这两类离心机由于用途不同,故其主要结构也有差异。 一、离心原理 离心技术的主要原理就是将样品放入离心机转头的离心管内,离心机驱动时,样品液就随离心管做匀速圆周运动,于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同,在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同,由此便可以得到相互间的分离。 (一)离心力和相对离心力 离心力的单位为g,即重力加速度(980.6cm/S2),离心力的大小可根据离心时的旋转速度V(r/min 每分钟转数,revolution per minute)和物体离旋转轴中心的距离r(cm)按下式计算:g=r×V2×1.118×10或按下式计算所需的转速:()r 89445 =。 ? V/ g 离心技术是根据微小颗粒物质在离心场中的行为建立并发展起来的。离心机的转头能够以稳定的角速度做圆周运动,从而产生一个强大的辐射向外的离心力场,它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度,使之受到一个外向的离心力,其定义为: F = mω2r 式中:F为离心力的强度;m为沉降颗粒的有效质量;ω为离心转子转动的角速度,其单位为rad/s;r为离心半径(cm),即转子中心轴到沉降颗粒之间的

临床生物化学实验原理、方法及检测介绍

临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术 中国中医研究院广安门医院临床检测中心 生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。 一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。 一、实验反应原理及分析方法(理论依据) 二、实验检测技术(手段)生化仪的分析技术。 三、质量控制程序(质量保证)室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。 四、临床意义(目的)咨询服务、异常结果的解释。 实验反应原理及分析方法(理论依据) 一个生物化学实验的反应原理设计,首先要找出所检测的化学特性,如测定体液(首先是血液)中酶的含量血液中除少数酶(如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等)含量较多外,血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克(Pg)水平,要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量(不论其有无活性)而用化学方法测定只能测定酶的催化活性,间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性,在临床上已普遍应用测定酶蛋白,同时还可以测定三大代谢的产物,如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比,因此只有当酶反应为一级反应时,才能准确测定底物含量,(如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等)。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。 临床化学方法的分类 特别是自动生化仪方法的特点 以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定,这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点,特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。 在一般比色法中,手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度,但由于很难控制测定时间和反应温度,很难准确记录反应过程中吸光度变化,因此,毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法,都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时,吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。 但自从自动生化仪出现后,从根本上改变了上述情况。通过各项先进技术,人们可以精确测定反应的动态过程。并可以准确计算任何一段反应时间内的反应速率,这样大大开阔了临床化学家对方法选择。除经典的终点法外还可以进行动态测定。这样不仅缩短了操作时间,大大提高了工作效率,还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定。如测定酶反应的初速 度(V o )等等。测酶初速度(V o )只能用分光光度法。 因此,用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解。 生化自动分析仪特点: 1 精确测定反应的动态过程; 2 准确计算任何一段反应时间内的反应速率; 3 除经典的终点法外还可以进行动态测定。 分析方法的分类

《生物制药技术》实验指导-实验一

《生物制药技术》实验指导 实验一金霉素链霉菌培养基的制备(验证型) 实验目的: 1、学会培养基的配制 2、掌握灭菌方法。 实验原理: 金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)亦称“金色链霉菌”,放线菌门(Actinobacteria),放线菌纲(Actinobacteria),放线菌目(Actinomycetales),链霉菌科(Streptomycetaceae),链霉菌属(Streptomyces)。在固体培养基上产生金色色素,故名。其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3~5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。菌落开始为白色,长孢子后变青色。在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。抗菌素工业上用以生产金霉素。 放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。放线菌在土壤中分布最多,大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。多数情况下,泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。放线菌大都好氧,属于化能异养,菌丝纤细,分枝,常从一个中心向周围辐射生长。因其生长具辐射状,故名放线菌。放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝,并在菌丝末端产生外生的分生孢子,有些种类甚至形成孢子囊,因而曾被误认是真菌。但其菌落较小而致密,不易挑取。不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用,可产生抗菌素,现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种,其中,有50多种抗生素已经广泛地得到应用,如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病;有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶;有的用于农业生产,如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。 四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。抗菌谱极广,包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。四环素早在1948年即开始用于临床,至今已有50余年历史。现在四环素已被收入中国药典2005版,还被收入美国、英国、日本等许多国家的药典。上世纪70~80年代四环素产销处于全盛时期,我国有上百家企业生产,临床用量很大。多年来由于四环素类的广泛应用,临床常见病原菌对金霉素耐药现象严重。1950年,国外有报道四环素族药物引起牙着色,病因是在牙的发育矿化期服用四环素族药物,可被结合到牙组织内,使牙着色。四环素还可在母体通过胎盘引起乳牙着色。其后又后续报道四环素沉积于牙、骨骼以至指甲等,而且还能引起釉质发育不全。在这方面,国内直至70年代中期方引起注意。自20世纪80年代后期起,因细菌耐药性增加以及新的抗生素大量上市等原因,四环素产销逐渐萎缩,市场疲软。因为副作用大,只外用,用于治疗结膜炎、沙眼。 材料、试剂和器材: 试剂: NaBr母液(100 g/L) KCl母液(100 g/L) M-促进剂母液(2.5 g/L) 器材:

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