生物样品前处理

第四节 生物样品分析的前处理技术

一般要在测定之前进行样品的前处理，即进行分离、纯化、浓集，必要时还需对待测组分进行化学衍生化，从而为测定创造良好的条件。

生物样品进行前处理的目的在于：

1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙（glucuronides）、硫酸酯（sulphates）缀合物等多种形式存在，需要分离后测定药物及代谢物；

2．生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物，也含有Na ＋、K＋、X-等无机化合物］。其中影响最大的是蛋白质，若用HPLC法测定药物浓度时，蛋白质会沉积在色谱柱上发生堵塞，严重影响分离效果。因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，必须进行除蛋白等前处理。

一、常用样品的种类、采集和贮藏

生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（血浆、血清、金血）、尿液、唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脊髓液、精液等。

（一）血样

血浆（plasma）和血清（serum）是最常用的生物样品。

血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。

供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。 由采集的血液制取血浆或血清。

血浆的制备 将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝萦、草酸盐、拘橡酸盐、EDTA、氟化钠等）的试管中，混合后，以2500～3000rpm离心5min使与血细胞分离，分取上清液即为血浆。

血清的制备 将采取的血样在室温下至少放置30min到1h，待凝结出血饼后，用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼，然后以2000～3000rpm离心分离5～10min，分取上清液．即为血清。

血浆比血清分离快，而且制取的量多，其量约为全血的一半。

血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。基于上述原因，现在国外多采用“专用血清”来测定药物的浓度。

血样的采血时间间隔应随测定目的的不同而异。

如进行治疗药物浓度监测（therapeutic drug monitoring，TDM）时，则应在血中药物浓度达到稳态后才有意义。但每种药物的半衰期不同，因此达到稳态的时间也不间，取样时间也随之不同。

采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立即进行分析。如不能立即测定时，应妥善储存。血浆或血清样品不经蒸发、浓缩，必须置硬质玻璃试管中完全密塞后保存。

要注意采血后及时分离出血浆或血清再进行储存。若不预先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时引起细胞溶解从而妨碍血浆或血清的分离或因溶血影响药物浓度变化。

（二）唾液

唾液由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌液混合组成的，平时所说的唾液就是指此混合液。

唾液的相对密度为1.003～1.008；pH值在6.2～7.6之间变动，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的pH值；通常得到的唾液含有粘蛋白，其粘度是水的1.9倍。

唾液的采集应尽可能在剌激少的安静状态下进行。一般在漱口后15min收集。

也可以采用物理的（如嚼石蜡块、橡胶、海绵）或化学的（如酒石酸）等方法剌激，使在短时间内得到大量的唾液。

唾液中含有粘蛋白，唾液的粘度由粘蛋白的含量多少而定。

用唾液作为样品测定药物浓度有几个优点：

1．与采取血样不同，患者自己可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集；

2．采集时无痛苦无危险；

3．有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度

（三）尿液

采用尿样测定药物浓度的目的与血液、唾液样品不同。尿药测定主要用于药物剂量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究，并可推断患者是否违反医嘱用药，同时根据药物剂量回收研究可以预测药物的代谢过程及测定药物的代谢类型（代谢速率，MR）等。

尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类。

采集的尿是自然排尿。尿包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。测定尿中药物浓度时应采用时间尿，时间尿以外的尿不可能推断全尿中药物的排泄浓度和药物总量。因此，测定尿中药物的总量时，将一定时间内（如8h、12h或24h等）排泄的尿液全部储在起来，并记录其体积，取其一部分测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。

采集的尿样应立即测定。若收集24h的尿液不能立即测定时，应加入防腐剂置冰箱中保存。常用防腐剂有：甲苯、二甲苯、氯仿、麝香草酚以及醋酸、浓盐酸等。利用甲苯等可以在尿液的表面形成薄膜，醋酸等可以改变尿液的酸碱性来抑制细菌的生长。保存时间为24～36h，可置冰箱（40C）中，长时间保存时，应冰冻（－20C）。

二、生物祥品分析前处理技术

（一）去除蛋白质

在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。去除蛋白法有以下几种。

1.加入与水相混溶的有机溶剂

可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。

2.加入中性盐 加入中性盐，

使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。

3.加入强酸

当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。 。

4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂

当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有CuSO

4

-

NaWO

4、ZnSO

4

-NaOH等。离心分离后所得的上清液pH分别为5.7～7.3和6.5～7.5。

5.酶解法

在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。它不仅可使组织酶，并可使药物析出。枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH活圈（PH7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃具有最大活力。

酶解法的优点是：可避兔某些药物在酸及高温下降解：对与蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检测时，无需再进行过多的净化操作。酶解法的主要问题是不适用于在碱性下易水解的药物。

（二）缀合物的水解

尿中药物多数呈缀合状态。一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸甙缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。为了测定尿液中药物总量，无论是直接测定或萃取分离之前，都需要将缀合物中的药物释出。有些药物仅需较温和条件即可使药物游离，有些则需较剧烈的方法，常用酸水解或酶水解的方法。

（三）分离、纯化与浓集

提取法是应用最多的分离、纯化方法。提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微量组分----药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集。提取法包括液-液提取法和液-固提取法。

1.液-液提取法（liquid-liquid extraction，LLE）

多数药物是亲脂性的，在适当的溶剂中的溶解度大于水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析用样品。

最常用的溶剂是乙醚和氯仿等。

液-液提取法的优点在于它的选择性，这是依赖于有机溶剂的选择；药物能与多数内源性物质分离；而且在使用非专属性的光谱法分析时，这是一个很大的优点。

液-液提取法的缺点在于乳化现象的产生。乳化作用能引起药物的损失，从而导致较低的回收 。

２.液-固提取法（liquid-solidｅｘｔｒａｔｉｏｎ，ＬＥＳ）

液－固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法。也可以认为是规模缩小的柱色谱法。这种方法是应用液相色谱法原理处理样品。

最大的优点为处理样品速度快、并在室温下操作，尤其适用于处理挥发性及对热不稳定药物。

常用于填充柱的担体大致分为两类：

第一类为亲水性的硅藻土等，

第二类常用疏水性的活性炭、聚苯乙烯或Ｃ

化学键硅胶等，它们可从样品中吸附亲脂性药物，然后用有机溶剂分离药物。

１８

（四）化学衍生化

分离前将药物进行化学衍生化的目的是：

（１）使药物变成具有能被分离的性质；

（２）提高检测灵敏度；

（３）增强药物的稳定性；

（４）提高对光学异构体分离的能力等。

、－ＮＨ 等。

药物分子中含有活泼Ｈ者均可被化学衍生化，如含有－ＣＯＯＨ、－ＯＨ、ＮＨ

２、

测定方法的效能指标

任何一种分析测定方法，根据其使用的对象和要求，都应有相应的效能指标。一般，常用的分析效能评价指标包括：精密度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性与范围、重现性、耐用性等；对于生物样品中药物分析方法评价的标准与上述的评价指标相比较，有共同之点也有特殊的要求。测定方法的效能指标可以作为对分析测定方法的评价尺度，也可以作为建立新的测定方法的实验研究依据。下面分别作简要、介绍：

一、精密度

精密度（precision）系指用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。它们越接近就越精密。在药物分析中，常用标准差（S）或相对标准差（RSD）表示：

1．标准（偏）差（standard deviation，SD或S）

2．相对标准（偏）差（rdative standard deviation，RSD），也称变异系数（coefficient of variation，CV）。

生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内（或日内）精密度及批间（或日间）精密度。

批内精密度（within－run precision）：是同一次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品各7～10份，每种浓度的样品按所拟定的分析方法操作，一次开机后，一一测定。计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批内精密度也可视为日内精密度（with－in－day precisiｏn）。

所得RSD应争取达到5％以内［17－181，但不能超过10％。

批间精密度（between-run precision）：是不同次测定的精密度。通常采用高、中、低三种浓度的同一样品，每种浓度配制7～10份，置冰箱冷冻。自配制样品之日开始，按所拟定的分析方法操作，每天取出一份测定，计算每种浓度样品的SD值及RSD值。批间精密度也可视为日间精密度（day to day precision）。

所得RSD应控制在15％以内。

二、准确度

准确度（Ａccuracy）是指测得结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。由于“其实值”无法准确知道，因

此，通常采用回收率试验来裴示。生物药物分析中，常用标准添加法来计算回收率，即取已准确测定药物含量P（present）的真实样品（如人血浆样

品等），再加入药物标准品已知量A（added），混合物作为测定液，其测定值为M（meａｓuｒed）。测定液要配制成高、中、低三种浓度，每个浓度测定3～5次，求出每种浓度的平均测定值Ｍ，且RSD应符合要求。由于预先要准确测定样品中原含有的药物量P，因此也应测定3～5次，求其平均值Ｐ，且RSD应符合要求。

按上式计算出的回收率，其结果越接近100％表明分析方法准确度越高。生物样品分析时，一般控制回收率范围应为85％～115％（样品药浓≥200μg／L〉及80％～120％（样品药浓<200μg／L）。

制剂的含量测定时，采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法作回收试验及计算RSD，还应作单独辅料的空白测定。每份均应自配制模拟制剂开始，要求至少测定高、中、低三个浓度，每个浓度测定三次，共提供9个数据进行评价。回收率的RSD一般应为2％以内［18］。

三、检测限

检测限（limit of detection, LOD）是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时，所需样品中．药物的最低浓度,无需定量测定.LOD是一种限度检验效能指标，它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白（本底）值的高低。要根据采用的方法来确定检测限。当用仪器分析方法时，可用已知浓度的样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度S与噪音（或背景信号）强度N，以能达到S／N＝2或S／N=3时的样品最低药浓为LOD；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差（即38空或3S空）作为检测限的估计值口。为使计算得到的LOD值与实际测得的LOD 值一致，可应用校正系数（ｆ）来校正，然后依之制备相应检测限浓度的样品，反复测试来确定ωD。如荧光光谱法测定时，检测限＝f·38f，根据此式计算出的LOD，再通过制备相应检测限浓度的标准品溶液的测定，以验证实际测得的LOD与上式计算结果相符。如用非仪器分析方法时，即通过已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。

四、定量限

定量限（limit of quantitation, LOQ）是指在保证具有一定可靠性（一定准确度和精密度）的前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的最低浓度。它反映了分析方法测定低药物浓度样品时具有的可靠性。它与上述的检测限的差别在于定量限要定量测定某一药物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低浓度应该符合一定的精密度和准

确度的要求。确定定量限的方法也因所用方法不同而异。当用非仪器分析方法时，与上述检测限的确定方法相同；如用仪器分析方法时，则往往将多次空白试验测得的背景响应的标准差（即空白标准差）乘以10，作为定量限的估计值，继之，再通过分析适当数量已知接近定量限或以定量限制备的样品来验证。

五、选择性

选择性（selectivity）是指在样品介质中有其他组分共存时该分析方法对供试物质准确而专属的测定能力。它与专属性（specificity）的含义稍有不同。

专属性是指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号：选择性则可对多种化学成分产生不同响应，而主要成分的响应可与其它响应区分。

因此，选择性是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的量度。

在药物分析中，考察一个分析方法的选择性时，应着重考虑杂质、降解产物、相关化合物以及制剂辅料等其他组分是否对被测药物的测定有干扰。一般，通过添加上述物质的样品与未曾添加的样品所得分析结果进行比较而确定。

在生物药物分析时，考察一个方法的选择性应着重考虑：

（1）内源性物质的干扰：可取空白样品（如空白血浆）试验。色谱分析时，要求药物和内标峰附近无干扰峰；光谱分析时，要求药物的测定波长处应无杂质吸收或荧光。

（2）代谢产物是否会干扰原药的测定响应值，可用给药数次后病人的尿液（含代谢物）来进行试验［2］。若药物在体内代谢情况为已知，且可获得代谢物标准品，则可将其加入空白样品以及加入实际样品中，验证是否有干扰。

（3）在临床药物监测时要考虑同时服用药物的干扰。将同时服用的药物加入空白样品中以及加入含药物的实际祥品中J观察得到的色谱图和比较测定结果，判断是否对药物测定有干扰。色谱分析除可用色谱图表明同时服用药物不干扰外，还可以分别列出这些药物的保留时间，显示有无干扰。

六、线性与范围

分析方法的线性是在给定范围内获取与样品中供试物法度成主比试验结果的能力。换句话说，就是供试物浓度的变化与试验结果（或测得的响应倍号：成线性关系。

所谓线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而正成线性的供试物浓壁的变化范围，其最大量与最小量之间的间隔，可用mg／L～mg／Ｌ，μg ／ml～μg／ml等表示。

线性与范围（linearity and range）的确定可用作图法（响应值Y／浓度x）或计算回归方程（Y＝a＋bX）来研究建立。测定样品时所有生物药物分析方法都必须同时作标准曲线。每次作标准曲线时，方法应与分析方法考核时完全一致。标准浓度应包括一定梯度的5～8个浓度（非线性者如免疫分析可适当增加），每个浓度只需测定一次（免疫分析可测定两次并取均值）；标准曲线应覆盖样品可能的浓度范围，对于含量测定要求一般浓度上限为样品最高浓度的120％，下限为样品最低浓度的80％（但应高于LOQ）；目前仍广泛采用相关系数（r）表示标准曲线的线性度，并控制ｒ≥０.９９００。对照品的LOQ必须包括在线性范围内。

七、重现性

分析方法的重现性（ruggedness）是指利用相同的方法在各种正常实验条件下对同一样品进行分析所得结果的重现程度。所谓各种正常实验条件，包括不同的实验室、不同的分析人员、不同的仪器、不同批号的试剂、不同的测试耗用时间、不同的分析温度、不同的测定日期等等。分析方法重现性的测定是通过在不同实验室由不同的实验者（操作和环境条件虽有差别但仍在规定的分析参数内）对同一样品的分别测试而获得的。重现性即是指在不同实验室中使用此种分析方法的精密度。

八、耐用性

分析方法的耐用性（robustness）是评价其保持不受参数微小变差影响的能力，并可作为正常使用的一个可靠性指标。

九、与参比方法测得结果的相关程度的比较

由于生物样品中含有许多干扰测定的杂质，特别是与原型药物相似的代谢物常对药物的测定有影响。因此，除考察选择性外，有时还用参比方法对实际生物样品同时测定并进行比较。比较试验时，取若干份实际样品（如病人服药后采取的血样），用一个已证明有相当专属性和可靠性的方法与新建立的方法同时进行测定，以参比方法测得的药浓为横坐标（Ｘ），以新建立方法测得的药浓为纵坐标（Ｙ）作成散布图（scatter diagram）,并求出直线回归方程（ｙ＝ａ+ｂｘ）及相关系数（ｒ）

ｒ最大值为1，表示两法完全相关（结果完全吻合）；r＝0时，表示两法完全不相关。一般要求两法的相关系数r≥0.95，而相关直线的斜率（b）应接近于1。

下面以HPLC法测定血清中链霉素浓度为例

新方法测定血清中链霉素，是在碱性条件下与茚三酮柱后衍生产生荧光，用离子对－HPLC法、荧光检测器检测；并用荧光偏振免疫测定法（fluorescence polarization immunoassay, FPIA）作为参比方法对照，结果表明两法相关性良好，如图3－7。

评价一种分析方法的效能，并不一定对上述各项指标都有要求。一般，根据方法的使用对象有所区别。大体上有以下四种情况：

1.用于原料药中主要组分或制剂中有效组分含量测定的方法：除了检测限和定量限二项指标外，对精密度、准确度、选择性、线性与范围、耐用性等均应有所要求；

２.用于原料药中杂质测定或制剂中降解产物测定的方法又可分为两种：①用于含量测定：②用于限度检查。

对于①法的要求是：除检测限和精密度指标不必要求外，对准确度、选择性、线性与范围、定量限、耐用性等均应有所要求；

对于②法的要求是：只对检测限、选择性和耐用性三项指标有所要求，其余均无需要求。

3.用于溶出度测定的方法及药物释放度测定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余项目均不作要求。

４.用于生物样品中药物测定的方法，对精密度、准确度、检测限、选择性、可测线形范围、定量限、对生物样品的耐用性以及与参比方法测得结果的相关程度的比较等指标应有所要求。