组蛋白翻译后修饰的类型

组蛋白和组蛋白翻译后修饰通过影响染色质的结构来调控基因的表达，目前已成为表观遗传学研究的焦点之一。

染色质是一系列核小体相互连接成的念珠状结构。核小体的核心是由组蛋白H2A 、H2B、H3 、H4各两个分子构成的八聚体, 在八聚体的表面缠绕有圈的双螺旋DNA。相邻的两个核小体之间由DNA连接, 称为纤丝(fiber), 在纤丝部位结合有组蛋白分子H1。在组蛋白H1存在时,核小体之间紧密接触,形成直径为10nm的纤维状结构。这就是染色体构型变化的一级结构。在染色质中, DNA 和组蛋白是染色质的稳定成分,组蛋白与DNA的含量之比接近 1∶1 。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分,通过带正电荷的氨基末端区域与带负电荷的DNA骨架相互作用, 对基因的表达有重要调控作用。

染色体活性调控的一个重要的机制是组蛋白的可逆共价修饰，通常容易发生在组蛋白

H3和H4的N端尾部，组蛋白H2A和H2B的N和C末端，包括甲基化，乙酰化，磷酸化，ADP-核糖基化，泛素化和小分子类泛素化修饰，这些翻译后修饰可改变组蛋白与DNA之间的相互作用，影响调控复合物与染色质结合的能力及染色质重塑，进而影响着细胞的多种功能。

⒈甲基化

组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histonemethyltransferase，HMT）完成的。甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化，这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性。甲基化的作用位点在赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的侧链N原子上。组蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位Lys，H3的第2、l7、26位及H4的第3位Arg都是甲基化的常见位点。研究表明·，组蛋白精氨酸甲基化是一种相对动态的标记，精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关。相反，赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控中一种较为稳定的标记。例如，H3第4位的赖氨酸残基甲基化与基因激活相关，而第9位和第27位赖氨酸甲基化与基因沉默相关。此外，H4—K20的甲基化与基因沉默相关，H3—K36和H3—K79的甲基化与基因激活有关。但应当注意的是，甲基化个数与基因沉默和激活的程度相关。

⒉乙酰化

组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，是由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶协调进行。组蛋白乙酰化呈多样性，核小体上有多个位点可提供乙酰化位点，但特定基因部位的组蛋白乙酰化和去乙酰化是以一种非随机的、位置特异的方式进行。乙酰化可能通过对组蛋白电荷以及相互作用蛋白的影响，来调节基因转录。早期对染色质及其特征性组分进行归类划分时就有人总结指出：异染色质结构域组蛋白呈低乙酰化，常染色质结构域组蛋白呈高乙酰化。最近有研究发现，某些HAT复合物含有一些常见的转录因子，某些HDAC复合物含有已被证实的阻遏蛋白。这些发现支持了高乙酰化与激活基因表达、低乙酰化与抑制基因表达有关的看法。

3.磷酸化

组蛋白H3在有丝分裂过程中，两个丝氨酸残基Ser10和Ser28发生了磷酸化作用。Ser10磷酸化组蛋白H3首先出现在G2晚期的核周缘，Ser28磷酸化组蛋白H3紧随其后出现，两个位点的磷酸化在中期到达高峰，并扩展到染色体的所有部分。当细胞有丝分裂进入后期和末期，组蛋白H3Ser28的磷酸化逐渐消退，而组蛋白H3Ser10磷酸化的荧光信号也逐渐从染色体上消失，此时在纺锤体中央部位出现Ser10磷酸化H3.研究结果表明，组蛋白H3Ser10和Ser28的磷酸化与细胞有丝分裂染色体的凝集和解凝集过程有着时间和空间上的相关性。Ser10和Ser28这两个位点发生磷酸化作用，可使组蛋白H3氨基末端的正电荷数降低，改变了组蛋白一DNA间的相互作用，这可能是导致染色质变构凝集的原因之一。根据激光共聚

焦显微分析表明，在有丝分裂后期和末期，Ser10磷酸化组蛋白H3的荧光信号出现在中体位置，在纺锤体中央形成梯状区带，随后凝集成点状成直线排列，和分开的两套染色体形成“三明治”样结构。

4.泛素化

组蛋白H2A在1975年被首次发现有泛素化修饰, 其泛素化修饰位点是高度保守的赖氨酸残基119 (K119)位点。研究发现在大量高等真核生物中H2A总量的5%~15%被泛素化,除了在芽殖酵母中没有发现泛素化的组蛋白H2A(ubiquitinated-H2A,uH2A)以外, 在许多组织

和细胞中都发现有多聚泛素化(polyubiquitination)的H2A。研究还发现, 组蛋白H2A的泛素化能够促进组蛋白H1与核小体的结合,促进多聚梳群蛋白(polycomb group protein)的沉默,还在X染色体失活的起始过程中有重要作用。除了H2A以外,组蛋白H2B也可以被泛素化修饰。尽管染色质中泛素化的组蛋白H2B量并不多,约占1%~2%,但是在从芽殖酵母到人类的真核生物中广泛分布。研究还发现H2B的123位赖氨酸的泛素化还能影响H3的79位赖氨酸的甲基化。

5.组蛋白的其他修饰方式

相对而言，组蛋白的甲基化修饰方式是最稳定的，所以最适合作为稳定的表观遗传信息。而乙酰化修饰具有较高的动态，另外还有其他不稳定的修饰方式，如腺苷酸化、ADP核糖基化等等。这些修饰更为灵活的影响染色质的结构与功能，通过多种修饰方式的组合发挥其调控功能。所以有人称这些能被专识别的修饰信息为组蛋白密码。这些组蛋白密码组合变化非常多，因此组蛋白共价修饰可能是更为精细的基因表达方式。

另外，研究发现H2B的泛素化可以影响H3K4和H3K79的甲基化，这也提示了各种修饰间也存在着相互的关联。

蛋白翻译后修饰(研究生高级生化)

蛋白翻译后修饰(齐以涛老师) 上课老师没说重点 1.蛋白的概念:由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。 2.蛋白后修饰概念和意义（ＰＰT4-5） 3.蛋白后修饰种类 1．切除加工 2. 糖基化 3.羟基化 4.甲基化 5．磷酸化?６．乙酰化?7．泛素化 200. … ８.类泛素化?９.…? 磷酸化修饰１.概念: 磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的,至少有3０%的蛋白被磷酸化修饰 2.作用位点：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化氨基酸,大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。

３.实例(MＡＰK途径): 分裂原活化的蛋白激酶（MAPK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶（MＡＰＫK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶(MAＰKＫK)。在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPＫ级联系统(MAＰK casｃade），通过ＭAPＫＫK-MAPＫK－ＭAＰＫ逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。具体过程如下： ?MＡPKKＫ位于级联系统的最上游,能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化?ＭAPKKK磷酸化后变为活化状态,可以使MAＰKK磷酸化 ?ＭAPKＫ始终存在于细胞质中，MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将ＭAＰK激活 ?MAＰK被磷酸化后有3种可能的去向: (1）停留在细胞质中,激活一系列其它的蛋白激酶 (2)在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化 (3)进入细胞核,通过磷酸化转录因子，调控基因的表达

组蛋白翻译后修饰的类型

组蛋白翻译后修饰的类型组蛋白和组蛋白翻译后修饰通过影响染色质的结构来调控基因的表达，目前已成为表观遗传学研究的焦点之一。染色质是一系列核小体相互连接成的念珠状结构。核小体的核心是由组蛋白H2A 、H2B、H3 、H4各两个分子构成的八聚体, 在八聚体的表面缠绕有圈的双螺旋DNA。相邻的两个核小体之间由DNA连接, 称为纤丝(fiber), 在纤丝部位结合有组蛋白分子H1。在组蛋白H1存在时,核小体之间紧密接触,形成直径为10nm的纤维状结构。这就是染色体构型变化的一级结构。在染色质中, DNA 和组蛋白是染色质的稳定成分,组蛋白与DNA的含量之比接近 1∶1 。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分,通过带正电荷的氨基末端区域与带负电荷的DNA骨架相互作用, 对基因的表达有重要调控作用。染色体活性调控的一个重要的机制是组蛋白的可逆共价修饰，通常容易发生在组蛋白 H3和H4的N端尾部，组蛋白H2A和H2B的N和C末端，包括甲基化，乙酰化，磷酸化，ADP-核糖基化，泛素化和小分子类泛素化修饰，这些翻译后修饰可改变组蛋白与DNA之间的相互作用，影响调控复合物与染色质结合的能力及染色质重塑，进而影响着细胞的多种功能。 ⒈甲基化组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histonemethyltransferase，HMT）完成的。甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化，这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性。甲基化的作用位点在赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的侧链N原子上。组蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位Lys，H3的第2、l7、26位及H4的第3位Arg都是甲基化的常见位点。研究表明·，组蛋白精氨酸甲基化是一种相对动态的标记，精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关。相反，赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控中一种较为稳定的标记。例如，H3第4位的赖氨酸残基甲基化与基因激活相关，而第9位和第27位赖氨酸甲基化与基因沉默相关。此外，H4—K20的甲基化与基因沉默相关，H3—K36和H3—K79的甲基化与基因激活有关。但应当注意的是，甲基化个数与基因沉默和激活的程度相关。 ⒉乙酰化组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，是由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶协调进行。组蛋白乙酰化呈多样性，核小体上有多个位点可提供乙酰化位点，但特定基因部位的组蛋白乙酰化和去乙酰化是以一种非随机的、位置特异的方式进行。乙酰化可能通过对组蛋白电荷以及相互作用蛋白的影响，来调节基因转录。早期对染色质及其特征性组分进行归类划分时就有人总结指出：异染色质结构域组蛋白呈低乙酰化，常染色质结构域组蛋白呈高乙酰化。最近有研究发现，某些HAT复合物含有一些常见的转录因子，某些HDAC复合物含有已被证实的阻遏蛋白。这些发现支持了高乙酰化与激活基因表达、低乙酰化与抑制基因表达有关的看法。 3.磷酸化组蛋白H3在有丝分裂过程中，两个丝氨酸残基Ser10和Ser28发生了磷酸化作用。Ser10磷酸化组蛋白H3首先出现在G2晚期的核周缘，Ser28磷酸化组蛋白H3紧随其后出现，两个位点的磷酸化在中期到达高峰，并扩展到染色体的所有部分。当细胞有丝分裂进入后期和末期，组蛋白H3Ser28的磷酸化逐渐消退，而组蛋白H3Ser10磷酸化的荧光信号也逐渐从染色体上消失，此时在纺锤体中央部位出现Ser10磷酸化H3.研究结果表明，组蛋白H3Ser10和Ser28的磷酸化与细胞有丝分裂染色体的凝集和解凝集过程有着时间和空间上的相关性。Ser10和Ser28这两个位点发生磷酸化作用，可使组蛋白H3氨基末端的正电荷数降低，改变了组蛋白一DNA间的相互作用，这可能是导致染色质变构凝集的原因之一。根据激光共聚

蛋白翻译后修饰(研究生高级生化)

蛋白翻译后修饰（齐以涛老师）上课老师没说重点 1.蛋白的概念：由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。 2.蛋白后修饰概念和意义（PPT4-5） 3.蛋白后修饰种类 1. 切除加工 2. 糖基化 3. 羟基化 4. 甲基化 5. 磷酸化 6. 乙酰化 7. 泛素化 8. 类泛素化 9. … 200. … 磷酸化修饰 1.概念：磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的，至少有30%的蛋白被磷酸化修饰

2.作用位点：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化氨基酸，大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。 3.实例(MAPK途径)：分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶（MAPKK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶（MAPKKK）。在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPK级联系统（MAPK cascade），通过MAPKKK-MAPKK-MAPK逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。具体过程如下： ?MAPKKK位于级联系统的最上游，能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化?MAPKKK磷酸化后变为活化状态，可以使MAPKK磷酸化?MAPKK始终存在于细胞质中，MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将MAPK激活

?MAPK被磷酸化后有3种可能的去向：（1）停留在细胞质中，激活一系列其它的蛋白激酶（2）在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化（3）进入细胞核，通过磷酸化转录因子，调控基因的表达 4.功能和意义: 一：调节酶蛋白及生理代谢 ①糖分解代谢中糖原磷酸化酶活性的调节，被磷酸化的酶具有活性，去磷酸化的酶无活性 ②磷酸化或去磷酸化使胞内已存在酶的活性被激活或失活，调节胞内活性酶的含量二:调节转录因子活性转录因子通常包含DNA结合结构域和转录激活结构域.转录因子在转录激活结构域或调控结构域发生磷酸化，直接影响其转录活性. c-Jun转录激活结构域的两个丝氨酸残基磷酸化，正调控c-Jun的转录活性. 三：调节转录因子核转位 ?TGF-b与其I型、II型受体结合，结合后的TGF-b I型受体识别R-Smad包括Smad2和Smad3，作用于C末端的丝氨酸使其磷酸化而被激活，激活后的R-Smad与Smad4结合转入细胞核内，发挥转录调节活性 ?NF-kB与其抑制因子IkB形成复合体时存在于胞质。当IkB磷酸化、

蛋白翻译后修饰组学实验方法

PTMScan? Proteomics Kit Protocol UNPARALLELED PRODUCT QUALITY,VALIDATION,AND TECHNICAL SUPPORT Pharma Services Department ■ptmscan@https://www.360docs.net/doc/596970603.html, Web ■ https://www.360docs.net/doc/596970603.html,/proteomics

S i g n a l i n g T e c h n o l o g y , I n c . o l o g y ? a n d P T M S c a n ? a r e t r a d e m a r k s o f C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y , I n c . R e v . 08/14/14 v e r s i o n 3 PTMScan ? Kit Protocol Cell Lysis and Protein Digestion A. Solutions and Reagents NOTE: Prepare solutions with RODI or equivalent grade water. 1.Urea Lysis Buffer: 20 mM HEPES pH 8.0, 9 M urea, 1 mM sodium orthovanadate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate. NOTE: The Urea Lysis Buffer should be prepared prior to each experiment. Aliquots of the Urea Lysis Buffer can be stored in the -80°C freezer for up to 6 months. NOTE: Dissolving urea is an endothermic reaction. Urea Lysis Buffer preparation can be facilitated by placing a stir bar in the beaker and by using a warm (not hot) water bath on a stir plate. 9 M urea is used so that upon lysis, the ?nal concentration is approximately 8 M. The urea lysis buffer should be used at room temperature. Placing the urea lysis buffer on ice will cause the urea to precipitate out of solution. 2.DTT solution, 1.25 M (see stock solutions for preparation) 3.Iodoacetamide solution: Dissolve 95 mg of iodoacetamide (formula weight = 18 4.96 mg/mmol) in water to a ?nal volume of 5 ml. After weighing the powder, store in the dark and add water only immedi-ately before use. The iodoacetamide solution should be prepared fresh prior to each experiment. B. Preparation of Cell Lysate, Suspension Cells 1.Grow approximately 1-2 x 108 cells for each experimental condition (enough cells to produce approxi- mately 10-20 mg of soluble protein). NOTE: Cells should be washed with 1X PBS before lysis to remove any media containing protein contaminants. Elevated levels of media-related proteins will interfere with the total protein determination. 2.Harvest cells by centrifugation at 130 rcf (g), for 5 min at room temperature. Carefully remove supernatant, wash cells with 20 ml of cold PBS, centrifuge and remove PBS wash and add add 10 ml Urea Lysis Buffer (room temperature) to the cell pellet. Pipet the slurry up and down a few times (do not cool lysate on ice as this may cause precipitation of the urea). NOTE: If desired, the PTMScan ? protocol may be interrupted at this stage. The harvested cells can be frozen and stored at -80°C for several weeks. https://www.360docs.net/doc/596970603.html,ing a microtip, sonicate at 15 W output with 3 bursts of 15 sec each. Cool on ice for 1 min C. Peparation of Cell Lysate, Adherent Cells 1.Grow 1-2 x 108 cells for each experimental condition (enough cells to produce approximately 10-20 mg of soluble protein). The cell number corresponds to approximately TEN 150 mm culture dishes (depending on the cell type), grown to between 70-80% con?uence. NOTE: Cells should be washed with 1X PBS before lysis to remove any media containing protein contaminants. Elevated levels of media-related proteins will interfere with the total protein determination. 2.Take all 150 mm culture dishes for one sample, remove media from the ?rst dish by decanting, and let stand in a tilted position for 30 seconds so the remaining medium ?ows to the bottom edge. Remove the remainder of the medium at the bottom edge with a P-1000 micropipettor. Wash each dish with 5 ml of cold PBS. Remove PBS as described above. 3.Add 10 ml of Urea Lysis Buffer (at room temperature) to the ?rst dish, scrape the cells into the buffer, let the dish stand in tilted position after scraping the buffer to the bottom edge of the tilted dish. Remove the medium from the second dish as above. Transfer the lysis buffer from the ?rst dish to the second dish using a 10 ml pipette, then tilt the ?rst dish with the lid on for 30 sec and remove remaining buffer from the dish and collect. Scrape cells from the second dish and repeat the process until the cells from all the dishes have been scraped into the lysis buffer. Collect all lysate in a 50 ml conical tube. NOTE: DO NOT place Urea Lysis Buffer or culture dishes on ice during harvesting. Harvest cells using Urea Lysis Buffer at room temperature. During lysis, the buffer becomes viscous due to DNA released from the cells. 4.The yield will be approximately 9-12 ml lysate after harvesting all the culture plates. NOTE: If desired, the PTMScan ? protocol may be interrupted at this stage. The cell lysate can be frozen and stored at -80°C for several weeks. https://www.360docs.net/doc/596970603.html,ing a microtip, sonicate at 15 W output with 3 bursts of 15 sec each. Cool on ice for 1 min between each burst. Clear the lysate by centrifugation at 20,000 rcf (g) for 15 min at 15oC or room temperature and transfer the protein extract (supernatant) into a new tube. NOTE: Lysate sonication fragments DNA and reduces sample viscosity. Ensure that the sonicator tip is submerged in the lysate. If the sonicator tip is not submerged properly, it may induce foaming and degradation of your sample (refer to the manufacturer’s instruction manual for the sonication apparatus). D. Reduction and Alkylation of Proteins 1.Add 1/278 volume of 1.25 M DTT to the cleared cell supernatant (e.g. 36 μl of 1.25 M DTT for 10 ml of protein extract), mix well and place the tube into a 55oC incubator for 30 min.2.Cool the solution on ice brie?y until it has reached room temperature (tube should feel neither warm nor ice-cold by hand). 3.Add 1/10 volume of iodoacetamide solution to the cleared cell supernatant, mix well, and incubate for 15 min at room temperature in the dark. E. Protease Digestion Protease Digestion Reference Table: ?Recommended Motif [pSQ] Kit 12235PTMScan ? Mono-Methyl Arginine [mme-RG] Kit Trypsin*5565 PTMScan ? Phospho-PKA Substrate Motif (RRXS*/T*) LysC* ?Recommended * For LysC-digested material, there is a second digestion performed after the StageTip puri?cation of enriched peptides (see the protocol after StageTip Puri?cation). A secondary trypsin digest is also recommended for enriched methylated tryptic peptides. Please visit https://www.360docs.net/doc/596970603.html,/services/ptmscan_kits.html for an updated version of the table. NOTE: Alternative proteases such as GluC, chymotrypsin, and others can be used in addition to the protease treatments outlined above to expand the coverage of modi?ed peptides from each Motif Antibody. When considering the use of additional protease treatments it should be compatible with the respective Motif Antibody by not cleaving residues within the designated sequence motif. Protease treatments that generate larger proteolytic peptides may not be ideal if the resulting peptides do not ionize well in the mass spectrometer. 1.Dilute 3-fold with 20 mM HEPES pH 8.0 to a ?nal concentration of 2 M urea, 20 mM HEPES, pH 8.0. For example, for 10 ml of lysate add 30 ml 20 mM HEPES pH 8.0. F. Trypsin Digestion 1.Add 1/100 volume of 1 mg/ml trypsin-TPCK (Worthington) stock in 1 mM HCl and digest overnight at room temperature with mixing. 2.Analyze the lysate before and after digest by SDS-PAGE to check for complete digestion. 3.Continue through the Sep-Pak, IAP , and StageTip protocols prior to LC-MS analysis of enriched peptides. G. LysC Digestion A. Solutions and Reagents Reagents Not Included: 1.HEPES (Sigma, H-4034) 2.Sodium pyrophosphate (Sigma, S-6422) 3.β-glycerophosphate (Sigma, G-9891) 4.Urea, Sequanal Grade (Thermo Scienti?c, 29700) 5.Sodium orthovanadate (Sigma, S-6508) 6.Iodoacetamide (Sigma, I-6125) 7.Dithiothreitol (American Bioanalytical, AB-00490)8.Trypsin-TPCK (Worthington, LS-003744) 9.Trypsin (Promega, V5113) 10.Lysyl Endopeptidase, LysC (Wako, 129-02541)11.Tri?uoroacetic acid, Sequanal Grade (Thermo Scienti?c, 28903)12.Acetonitrile (Thermo Scienti?c, 51101)13.Sep-Pak ? Classic C18 columns, 0.7 ml (Waters, WAT051910)14.Burdick and Jackson Water (Honeywell, AH365-4) NOTE: Prepare solutions for cell lysis, Sep-Pak puri?cation, and IAP enrichment with RODI or equivalent grade water. Prepare solutions for subsequent steps with HPLC grade water (Burdick and Jackson water). Stock Solutions: 1.200 mM HEPES/NaOH, pH 8.0: Dissolve 23.8 g HEPES in approximately 450 ml water, adjust pH with 5 M NaOH to 8.0, and bring to a ?nal volume of 500 ml. Filter through a 0.22 μM ?lter (as used for cell culture), use for up to 6 months.2.Sodium pyrophosphate: Make 50X stock (125 mM, MW = 446): 1.1 g/20 ml. Store at 4°C, use for up to one month. 3.β-glycerophosphate: Make 1000X stock (1 M, MW = 216): 2.2 g/10 ml. Divide into 100 μl aliquots and store at -20oC. 4.Sodium orthovanadate (Na 3VO 4): Make 100X stock (100 mM, MW = 184): 1.84 g/100 ml. Sodium orthovanadate must be depolymerized (activated) according to the following protocol: a. F or a 100 ml solution, ?ll up with water to approximately 90 ml. Adjust the pH to 10.0 using 1 M NaOH with stirring. At this pH, the solution will be yellow. b. B oil the solution until it turns colorless and cool to room temperature (put on ice for cooling). c. R eadjust the pH to 10.0 and repeat step 2 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0 (usually it takes two rounds). Adjust the ?nal volume with water. d. S tore the activated sodium orthovanadate in 1 ml aliquots at -20°C. Thaw one aliquot for each experiment; do not refreeze thawed vial. 5.Dithiothreitol (DTT): Make 1.25 M stock (MW = 154): 19.25 g/100 ml. Divide into 200 μl aliquots, store at -20oC for up to one year. Thaw one aliquot for each experiment. 6.Trypsin-TPCK: Store dry powder for up to 2 years at -80oC. Para?lm cap of trypsin container (Worthington) to avoid collecting moisture, which can lead to degradation of the reagent. Prepare 1 mg/ml stock in 1 mM HCl. Divide into 1 ml aliquots, store at -80oC for up to one year. 7.Lysyl Endopeptidase (LysC): Store dry powder up to 2 years at -80oC. Para?lm cap of LysC con- tainer to avoid collecting moisture, which can lead to degradation of the reagent. Prepare 5 mg/ml stock in 20 mM HEPES pH 8.0. Divide into single use aliquots, store at -80oC for up to one year.

GPI锚——一种复杂的蛋白质翻译后修饰

第４２卷第２期２０１９年６月一一一一一辽宁师范大学学报(自然科学版)J o u r n a l o fL i a o n i n g N o r m a lU n i v e r s i t y ( N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n )一一一一一V o l ．４２一N o ．２J u n ．一２０１９一一收稿日期:２０１８Ｇ１２Ｇ２５基金项目:国家自然科学基金资助青年项目(３１３０１８８０);辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目(L J Q ２０１５０５７);大连市高层次人才创新支持计划项目(２０１５R ０６７)作者简介:李庆伟(１９５５Ｇ),男,辽宁大连人,辽宁师范大学教授,博士,．E Ｇm a i l :l i q w＠２６３．c o m 一一文章编号:１０００Ｇ１７３５(２０１９)０２Ｇ０２１５Ｇ０８一一D O I :１０．１１６７９/l s x b l k ２０１９０２０２１５ G P I 锚一种复杂的蛋白质翻译后修饰李庆伟１,２,一宋一涛１,２,一勾一萌１,２,一滕洪明１,２,一卢佳丽１,２ (１．辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连一１１６０８１;２．辽宁师范大学七鳃鳗研究中心,辽宁大连一１１６０８１ )摘一要:糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(g l y c o s y l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l Ｇa n c h o r e d p r o t e i n s ,G P I ＧA P s )是一种在真核生物细胞膜表面普遍存在的蛋白质,最大特点是没有跨膜结构域和胞质尾区,通过翻译后修饰产生的G P I 结构锚定在细胞膜上．G P I 锚结构复杂, 由磷酸氨基乙醇联结部二核心糖链和磷酸肌醇尾组成．核心糖链中的甘露糖二葡萄糖胺二磷酸肌醇残基可不同程度地被磷酸氨基乙醇和其他糖类修饰．尽管被精确解析出的G P I 锚结构还较少,但已在分子水平上证明G P I 锚具有非常多样的生物学功能, 如信号传导二细胞黏附二蛋白质转运和免疫反应等等．近年来,由于实验技术的进步,G P I 锚的相关研究也在逐步深入．对G P I 锚独特的翻译后修饰及其功能的最新研究进行分析归纳．关键词:糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白;G P I 锚结构;G P I 锚功能; 信号传导中图分类号:Q ５３９一一一文献标识码:A 自１９８５年被发现以来,糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(g l y c o s y l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l Ｇa n c h o r e d p r o Ｇt e i n s ,G P I ＧA P s )是在真核动物中独有的蛋白质翻译后修饰,越来越受到人们的重视[１Ｇ７]．独特而复杂的翻译后修饰可通过糖基化磷脂酰肌醇结构[８Ｇ９],连接在某些缺乏跨膜结构域和胞质尾区的蛋白质羧基末端,从而将此类蛋白质定位在细胞质膜的胞外侧,最终在信号传导二细胞黏附二蛋白质转运和免疫反应等方面发挥作用．不同于一般的翻译后修饰,G P I 锚结构复杂, 由磷酸氨基乙醇联结部二核心糖链和磷酸肌醇组成(图１),而核心糖链中的甘露糖二葡萄糖胺二磷酸肌醇残基还可以不同程度地被磷酸氨基乙醇和其他糖类修饰[１０Ｇ１１]．这种复杂结构决定了G P I 锚的功能并不局限于细胞质膜插入．本文对近年来G P I 锚结构和功能的研究进行分析归纳．１一G P I 锚的发现２０世纪７０年代,从蜡状芽孢杆菌中分离出了一种磷脂酶,该酶可以从组织中释放碱性磷脂酶(A l k a l i n e p h o s p h o l i p a s e ,A P a s e )[１２],因此,这种酶被命名为磷脂酰肌醇Ｇ磷脂酶(P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l Ｇs p e c i f i c p h o s p h o l i p a s eC ,P I ＧP L C )．在之后的几年里,陆续有研究者发现,经过P I ＧP L C 处理后的小鼠组织,还可释放出５?Ｇ核苷酸酶[１３]和红细胞乙酰胆碱酯酶[１４]．人们开始意识到,某些蛋白是以共价键形式,通过磷脂酰肌醇结合在细胞膜表面的．直到１９８５年,G P I 锚定蛋白的基本结构才被发现[１５]．起初,受限于复杂的分离纯化过程,G P I 锚定蛋白鉴定的通量一直很低．随着纳升液相二高分辨质谱等分析仪器的发展,以及蛋白序列数据库的完善,批量鉴定G P I 锚定蛋白也成了可能[９]．２００３年,J e n s e n 等[１６]

第5章-蛋白质翻译后修饰

Chapter V Chapter V Post‐translational Modification Of Proteins

One gene more proteins One gene, more proteins https://www.360docs.net/doc/596970603.html,

?蛋白质翻译后修饰（PTM）是指蛋白质在翻译中或翻译后经历的个共价加工过程，即通过1个或几个氨基酸残基加上修饰的一个基团或通过蛋白质水解剪去基团而改变蛋白质的性质。 ?从定义的角度，可以如下理解蛋白质翻译后修饰： 1. 对某氨基酸的修饰包括共价连接简单的官能团（如乙酰基或磷酸基） 1对某一氨基酸的修饰包括和引入一些复杂结构，如脂类和糖类。 2. 将已经结束翻译的转录本产物切割成成熟的形式，如信号肽或活性肽的加工等。 3. 氨基酸的交联，如丝氨酸和酪氨酸。

?可以说，蛋白质组中任一蛋白质都能在翻译时或翻译后进行修饰。不同类型的修饰都会影响蛋白质的电荷状态、疏水性、构饰不同类型的修饰都会影响蛋白质的象和（或）稳定性，最终影响其功能。 ?诸多实例表明蛋白质的修饰都采取一种可逆模式‐“开”或“关” 的状态行或者调节蛋白质的功能或者作为个真实的分的状态进行，或者调节蛋白质的功能，或者作为一个真实的分子开关。 ?目前已发现300多种不同的翻译后修饰，主要形式包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、羧基化、核糖基化以及二硫键的配对等。等

?加入官能团乙酰化—通常于蛋白质的N末端加入乙酰。磷酸化—加入磷酸根至Ser、Tyr、Thr或His。糖化—将糖基加入Asn、羟离氨酸、Ser或Thr，形成糖蛋白。烷基化加入如甲基或乙基等烷基。 — 甲基化—烷基化中常见的一种，在Lys、Arg等的侧链氨基上加入甲基。生物素化—主要有组蛋白的生物素酰化修饰，由羧化全酶合成酶与组蛋白直接相互作用完成，以及生物素附加物令赖氨酸残基酰化。以及生物素附加物令赖氨酸残基酰化谷氨酸化—谷氨酸与导管素及其他蛋白质之间建立共价键。甘氨酸化—一个至超过40种甘氨酸与导管素的C末端建立共价键。异戊二烯化—加入如法呢醇及四异戊二烯等异戊二烯。硫辛酸化—附着硫辛酸的功能性。磷酸泛酰巯基乙胺基化—像在脂肪酸、聚酮、非核糖体肽链及白氨酸的生物合聚酮成中，从乙酰辅酶A加入4‘磷酸泛酰巯基乙胺基。硫酸化—将硫酸根加入至酪氨酸。硒化 C末端酰胺化 ‐‐‐‐‐‐‐‐

组蛋白翻译后修饰的类型汇编

组蛋白翻译后修饰的类型

组蛋白翻译后修饰的类型组蛋白和组蛋白翻译后修饰通过影响染色质的结构来调控基因的表达，目前已成为表观遗传学研究的焦点之一。染色质是一系列核小体相互连接成的念珠状结构。核小体的核心是由组蛋白H2A 、H2B、H3 、H4各两个分子构成的八聚体, 在八聚体的表面缠绕有 1.75圈的双螺旋DNA。相邻的两个核小体之间由DNA连接, 称为纤丝(fiber), 在纤丝部位结合有组蛋白分子H1。在组蛋白H1存在时,核小体之间紧密接触,形成直径为10nm的纤维状结构。这就是染色体构型变化的一级结构。在染色质中, DNA 和组蛋白是染色质的稳定成分,组蛋白与DNA的含量之比接近 1∶1 。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分,通过带正电荷的氨基末端区域与带负电荷的DNA骨架相互作用, 对基因的表达有重要调控作用。染色体活性调控的一个重要的机制是组蛋白的可逆共价修饰，通常容易发生在组蛋白H3和H4的N端尾部，组蛋白H2A和H2B的N和C末端，包括甲基化，乙酰化，磷酸化，ADP-核糖基化，泛素化和小分子类泛素化修饰，这些翻译后修饰可改变组蛋白与DNA之间的相互作用，影响调控复合物与染色质结合的能力及染色质重塑，进而影响着细胞的多种功能。 ⒈甲基化组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histonemethyltransferase，HMT）完成的。甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化，这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性。甲基化的作用位点在赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的侧链N原子上。组蛋白H3的第4、

组蛋白翻译后修饰的类型

蛋白翻译后修饰(研究生高级生化)

组蛋白翻译后修饰的类型

蛋白翻译后修饰(研究生高级生化)

蛋白翻译后修饰组学实验方法

GPI锚——一种复杂的蛋白质翻译后修饰

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第5章-蛋白质翻译后修饰

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