肿瘤血管基础知识

1923年,Zimmermann提出了"周细胞"(Pericyte)这一名词[1].周细胞又称Rouget 细胞,它位于多种组织的毛细血管附近,从层次上与动、静脉的血管平滑肌细胞(SMC)相连接,和内皮细胞(EC)一起构成了微血管和组织间隙的屏障.是维持内环境稳定的重要因素.周细胞是一种多能细胞,可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、软骨细胞、SMC 等;它有收缩能力,调节微循环的灌流量和通透性;周细胞和EC相互作用,参与血管形成和创伤愈合;合成和释放构成基底膜和细胞外基质的结构物质等等.而且,在许多微血管病变中可以看到周细胞结构功能的改变.因此,周细胞功能失调和许多微血管相关疾病有着一定的关联.

周细胞是微循环血管壁细胞成分之一。内皮细胞、周细胞和基底膜构成了微循环和组织间液的屏障，对于维持内环境的稳定起着重要作用。周细胞具有收缩功能，是一种多能细胞，它还参与血管形成和创伤愈合等。周细胞功能异常和数目改变是许多微血管疾病的重要特征之一。

1 肿瘤的血管生成及其调控

1.1肿瘤的血管生成过程血管生成又叫血管新生化(neovascularization),是指活体组织在已存在的微血管床上芽生(sprouting)出新的毛细血管为主的血管系统的过程.肿瘤的发生、发展可分为无血管期(avascular stage)或血管前期(prevascular stage)和血管期(vascular stage)[8].无血管期肿瘤主要依靠周

围组织的弥散作用来获取营养物质和排泄代谢产物，从而限制了其生长,故无血管期肿瘤细胞多处于休眠状态，甚至可长时间地潜伏在组织中而无明显进展.如果没有血管生成，肿瘤的直径一般只能达到1 -2mm，因为实体组织中的氧，只能从毛细血管向外放射状弥散150-200μm,超出此范围的细胞便会因缺乏营养而死亡[9].动物试验证实，植于大鼠皮下的星形细胞瘤在直径达1-2mm 之前，瘤内无血管存在[10].实体瘤生长至约2mm时才开始诱发微血管增生，并进入血管期.促使肿瘤由无血管期向血管期转变的因素有缺氧、缺营养、pH值呈酸性、NO 升高等[11] .血管生成是实体瘤由休眠到增生状态过度的标志之一.在血管期，肿瘤内出现新的毛细血管并促使肿瘤细胞分裂、生长和转移，其中肿瘤血管来源于血管生成、血管套叠式生长和内皮祖细胞.肿瘤血管生成的方式有二种：一是处于无血管期的肿瘤细胞团在缺氧等因素的作用下,使瘤细胞和巨噬细胞等产生大量的血管生成因子而诱导血管生成；二是肿瘤细胞依赖宿主组织已存在的血管生长，继而出现瘤内血管消退，然后再以第一种方式发生血管生成.

血管生成的具体过程非常复杂，主要包括下列过程：(1) 内皮细胞和周细胞在血管生成因子的作用下激活而产生血管生成表型. (2) 源血管(包括微静脉和毛细血管)舒张、通透性增加、内皮细胞伸展，纤维蛋白外渗至源血管周围导致其环境改变，以基质金属蛋白酶为主的蛋白酶使源血管基底膜降解. (3) 内皮细胞作定向增生、迁移并形成毛细血管芽，周细胞环绕内皮细胞增生、迁移.

(4) 新生血管形成并逐渐连通，即肿瘤微血管的分化和

成型而形成功能性血管. [12,13]1.2 肿瘤的微血管特点肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组织，但分布上并不均一，大多数肿瘤新生的微血管主要分布在肿瘤生长活跃的边缘.血管生成最活跃、微血管密度最高的区域叫“血管热点区”(hot spots).Weidner et al [14]报道在大多数血管热点区，显微镜观察到的微血管数量与转移呈正相关，与生存期呈负相关.肿瘤新生的微血管分支多紊乱，管腔较不规则，主要表现为狭窄、扩张或扭曲.新生的微血管呈血窦状、条索状，管壁薄，甚至仅有一层内皮细胞,且内皮细胞比较幼稚，细胞间常有裂隙，缺乏基底膜，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连.微血管内可出现周细胞的增生，但常缺乏完整的平滑肌层.这些结构特点可导致其通透性增高，也是肿瘤发生转移的途径之一.当然，其高通透性还与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的高表达有关.此高通透性常常引起肿瘤周围的水肿区.此外，内皮细胞的幼稚、增生、肥大、基底膜的增厚和肿胀，血管管腔的狭窄，使得这些微血管供氧能力降低.

1.3 肿瘤血管生成的调控肿瘤的血管生成过程受多种血管生成因子(angiogenic factors)和血管生成抑制物(angiogenesis inhibitors)的调控，并由二者之间的平衡所决定，即所谓的“平衡与失衡”理论[15].血管生成因子包括成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)家族，VEGF家族及其受体，血管生成素(angiopoietins, Ang)家族及其受体，表皮生长因子，血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF)-β等

[16,17].其中，VEGF和Ang家族是已知的特异性作用于内皮细胞的极为重要的生长因子[18,19].内源性血管生成抑制因子包括血小板因子4(platelet factor -4,PF-4), 血小板反应蛋白(thrombospondin, TBS)，泌乳素16 000片段、干扰素a-2a，金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)，胎盘增生相关蛋白(placental proliferin-related protein)，IL-2，血管抑素( angiostatin)和内皮稳定素(endostatin)等[20,21] .

1. 引言

肿瘤血管系统的一个基本的特性就是缺少血管体系，这表明发生在正常血管发展过程中的形态学的再塑性过程在肿瘤的血管发生中或是受损的或是没有发生[1-3]。生理条件下以及肿瘤的组织血管化作用是由血管发生和/或血管发生引起的。从已存在的血管上萌芽出新的血管定义为血管发生[4，5]，而出生后的血管发生是内皮前体细胞形成新的血管的过程[6-8]。

新生血管发展整个复杂过程中的主要步骤包括内皮细胞的迁移和增殖过程以及毛细血管的形成[9]。随后的基底膜的发生和内皮周细胞，毛细血管周细胞和大血管的平滑肌细胞整合入血管壁都是导致血管成熟的血管再塑性过程中的基本步骤[1，10-12]。这个成熟过程的结束是由小血管和大血管形成，可以满足例如形成流体静力压、血管渗透能力和组织灌注率等功能需要的血管体系的形

成。目前血管发生研究的注意力主要集中于内皮细胞的迁徙、增殖和毛细血管的形成。相应的肿瘤抗血管生成治疗也主要针对内皮细胞的这些特性。然而，血管壁的结构稳定作用的机制目前我们了解甚少，但是在最近几年中已经成为血管研究中的非常重要的热点[1-3，11，13-18]。对血管稳定作用是否影响和怎样影响肿瘤生长和转移这个问题就更知之甚少。此外，对于像肿瘤、糖尿病、黄斑变性、各种血管畸形、炎症和局部缺血组织的最终血管再通这些一系列以血管异常为主要特征疾病，血管稳定过程的调节看起来都是重要的。

2. 肿瘤组织中的血管稳定和血管成熟

正常的一个成熟血管床由分化后的大血管和微血管等血管组成，这包括动脉、静脉、小动脉、小静脉和末端毛细血管。除了被肿瘤侵犯包含的已存在的血管外，不管是恶性肿瘤还是良性肿瘤中，这样一种已分化的血管床

“血管稳定”都没有存在肿瘤中[1，3，19]。

“血管成熟”、

或“血管正常化”这些术语既用于不同的也用于同样的血管结构状态。由McDonald和其同事进行的详细研究证明大部分肿瘤血管系统已经存在基底膜和内皮周细胞。由于缺乏进一步分化和周细胞的规则地整合进入血管壁和血管壁成分的重排，肿瘤血管系统的基底膜和内皮周细胞仍然保持结构的不成熟[11，13]。此外，与正常血管系统相比，肿瘤血管系统也存在结构的不正常。因而，

在一些最近的出版物中并不赞成在“正常化”这个概念使用中把血管稳定和血管成熟分开使用。特别必要的是在此领域要避免这一概念的进一步混淆。因而，我们建议使用“血管成熟”定义为大血管和微血管的正确分化为血管床的过程，而新血管完成由或多或少的内皮间结构、基底膜和一层内皮周细胞的结构状态称之为“血管稳定作用”。血管稳定作用是成熟过程中的一步，但是这一阶段中血管依然需要几步重新塑形的步骤才能成熟。不过，肿瘤的一部分血管能够明显地达到血管形态发生阶段，但是不能进入进一步的血管成熟阶段。因而，区分这些过程不仅仅是一个技术问题，更进一步意义上说，这对更好地理解肿瘤血管生物特性和肿瘤抗血管生成治疗都是非常重要的。

3. 血管稳定和肿瘤生长

通常大家认为，肿瘤血管是不稳定的和不正常渗漏的[19，20]。大分子的外渗提供了一种基质扩大了血管芽苞的形成的可能[19]。许多出版物也认为肿瘤血管床是由不同形态发生血管结构组成。无论是哪种类型的肿瘤，肿瘤组织中的肿瘤血管基本上存在三种类型：

（1）仅由内细胞无或仅存在未充分形成的基底膜，但没有整合内皮周细胞形成的

新生血管芽苞（图1A）。

（2）固定在部分形成的基底膜和部分排列的内皮周细胞上由内皮细胞排列成的毛细血管（图1B）和（3）毛细血管（图1C）和具有基底膜及其固定在上面的内皮细胞和内皮周细胞或少量整合了少量平滑肌细胞的较大直径的血管（图1D）。只有最后一种的血管结构被认为是稳定的。哪一种血管类型在肿瘤中占统治地位显然依赖肿瘤内的微环境。然而，我们要说明的是在人Leydig（睾丸间质细胞）细胞肿瘤，尽管存在非常高的血管密度，这种非常低度恶性肿瘤的大部分血管是稳定的[16]。根据这些数据，我们假定血管稳定可能不利于肿瘤的生长和转移。在一个肿瘤中调控血管的过程如此复杂，使得研究肿瘤组织中调节血管稳定的分子机制是困难的。过去4-5 年中的数据的累积增加这一问题显著性的关注[11，14，21，22]。相应的，我们把近来在抗血管生成治疗下肿瘤血管的部分正常化称作“正常化”[2，15]。这引起这样的假设，抗肿瘤血管生成治疗可能会打开改善放疗和化疗效果上的一个“治疗窗口”[2，15]。我们显示了血管形成抑制剂内皮抑素稳定了新血管芽苞，猜测这将会使新血管从生成血管向静止的表型转换（图2A，B）。另一方面，血管形成素－1（Ang1）的过表达，通过整合内皮周细胞进入血管壁和显示促血管生成特性作为新初生血管的重新塑形和稳定的基本因素，抑制了肿瘤的生长而不是促进它的生长[22]。近来研究发现的那些被强调的数据显示，一种能够结合血管形成素－1 位点的包含孤立纤维蛋白素原样受体的切去顶端的血管

形成素－1 变异单体和血管形成素－1，均能稳定血管，避免异常的血管渗漏和降低血管密度[23]。血管形成素－1 和内皮抑素的共同点看起来都能重新塑造和稳定新生血管，而它们的差异在于如内皮细胞的迁移和管腔的形成等中发挥不同的功能。内皮抑素阻断了内皮细胞的迁移，减少了血管内皮细胞生长因子诱导的内皮管腔的形成[14]，而血管形成素－1 则是都增强这些作用[24，25]。血管稳定影响到血管渗透性和血流的功能。血管形成素－1 阻断了血管内皮细胞生长因子诱导的血管渗漏[26]。我们目前的数据显示内皮抑素通过稳定血管壁（Nomi and Schuch 等，待发手稿）阻止了血管内皮细胞生长因子和凝血酶原激活因子介导和肿瘤诱导的异常血管渗漏。对抗血管内皮细胞生长因子或凝血酶原激活因子，内皮抑素保护了内皮细胞间的连接和基底膜以及在内皮细胞和内皮周细胞间的直接接触。我们最近的证据显示的治疗中应用的内皮抑素明显地集聚在肿瘤血管壁内，在正常组织中却没有集聚[27]这表明了内皮抑素在新生血管结构调整中的作用。另有发现支持这一观点，通过减少血管通透性过高，内皮抑素显示可以阻断血管内皮细胞生长因子诱导的视网膜剥离[28]。更有近来的研究证据支持这一点，缺乏内皮抑素前体物质-胶原18 的人工破坏特定基因的鼠表现出升高的血管渗透性或血管渗漏[29]。显然，血管形成素－1 和内皮抑素协同作用于血管壁的稳定和减少血管渗漏。最终，这两种因子遏制了试验肿瘤的的肿瘤生长和转移[22，30]。近来一篇文章显示了血管渗漏对肿瘤生长的重要性。可能是由于稳定了内皮屏障，通过一种影响一氧化氮合酶的因子

-Cavtratin（凯绰琳），从而阻断了血管通透性过高，减少了活体内肿瘤的生长。但这又提出了一个问题是不是血管稳定是抗血管生成和抗肿瘤血管生成的本质？如果答案是，血管稳定又怎样抑制了肿瘤生长？稍微违反直觉的考虑一下，正如我们所显示的内皮抑素这些现有证据表明，血管稳定可能是逆转肿瘤诱导的异常血管渗漏和减少血管生成潜能的关键(Nomi and Schuch 等, 待发手稿) [14]。对不同试验和人类的形态学评价揭示肿瘤血管的稳定改变了与血管相关的肿瘤细胞的结构以及伴随的肿瘤坏死的增加。在肿瘤的边缘区域，肿瘤细胞群被一团高密度的未稳定血管网络包围（图3A），这里没有看到坏死区域。与此相反，在那些部分稳定血管系统的肿瘤区域，只有包围稳定血管周围5－9 层肿瘤细胞呈圆筒状存活，而远离这些区域的肿瘤细胞则坏死（图3B，C）。由这样稳定的大直径血管分枝的小血管则发现退化了（图3D）。有趣的是，这样有稳定血管和肿瘤坏死的区域大部分发现在恶性肿瘤的中心而在象睾丸间质细胞瘤或良性前列腺异常增生中则没有发现。在几个实验性肿瘤中，我们观察在内皮抑素抗肿瘤血管生成的治疗下到从肿瘤中心向肿瘤边缘区域显著的具有稳定血管和肿瘤坏死的区域，重点指出了在血管生成抑制、血管稳定和肿瘤抑制的潜在关系。

4. 血管稳定与血管灌注

基于这些观察，我们假定血管稳定不仅改变了肿瘤组织的血管渗透性，也改变了肿瘤组织的血管灌注和血流。使用活体显微镜检查实验性肿瘤新生血管形成的功能性

观察中表明肿瘤血管连续地达到一种稳定态。在这样有大直径肿瘤血管，血流和组织灌注显著得提高和使大血管更大同时伴随着小血管的退缩[32]。因此，我们认为稳定化血管的优先灌注导致了未稳定血管的灌注不足。这将随后导致未稳定血管周围肿瘤组织的血供不足从而导致肿瘤坏死（图4）。另外，因为未稳定血管的功能缺失，它们的灌注不足可能会导致它们的退化。这又将促进肿瘤的进一步坏死。伤口愈合的研究证据也支持这一点，因为在内皮抑素治疗下瓦解的血管的数目显著增加而没有耽搁伤口的愈合[33]。从这些讨论的数据中我们可以得到这样的假设，血管稳定作用可能起到了抗血管生成和抗癌的本质，而本质上没有正常组织的血管。因为血管建立了对抗肿瘤细胞通过的屏障，血管稳定作用也可能通过血管壁减少了肿瘤的转移潜力。此外，正如R. Jain[2]所说，血管稳定可能提高了如化疗或放疗这些确定的治疗过程的效果，可能会打开“治疗的窗口”。. 结论

总之，把非稳定的血管转变成稳定血管以及直接针对新生血管芽孢的治疗策略的建立可能是抗癌治疗的新途径。仍然需要进一步的工作来了解血管稳定与失去稳定的机理和它们影响肿瘤生长和转移的作用。另外，研究由于肿瘤细胞诱导的潜在补偿机制也是必要的。对这些过程的进一步认识将帮助我们提高抗肿瘤血管生成治疗的疗效。