凝胶色谱实验讲义

凝胶渗透色谱在聚合物研究中的应用

一、目的要求

1. 掌握凝胶渗透色谱（GPC，gel permeation chromatography）的工作原理并了解其构造。

2. 掌握凝胶渗透色谱仪的基本操作及数据处理方法。

3. 利用凝胶渗透色谱仪测定聚合物的分子量及其分布。

二、原理及仪器构造

1.凝胶渗透色谱的工作原理。

GPC是一种特殊的液相色谱，所用仪器与高效液相色谱仪类似，但

是其色谱柱中的填充相与液相色谱不同，其填充相是具有不同比表面积，孔径分布和孔容的凝胶填料（如葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯凝胶、琼脂糖凝胶等）。GPC的分离过程是基于分子筛效应而进行的。聚合物中分子量小的分子在溶液中的流体力学体积较小因而能够在凝胶颗粒内的孔隙中自由地扩散，但随着分子量的增加其在溶液中的流体力学体积也逐渐增大，当增大到与凝胶中孔隙的尺寸大小相当时，便不能顺利进入到凝胶的内部，分子量更大时便完全不能扩散到凝胶颗粒的内部。如图1所示：

根据这一分子筛效应，可以按照分子尺寸大小的差别来进行分离，

而有机聚合物的分子尺寸大小又与分子量成正相关，也就是说根据这一效应可以将聚合物分子按照分子量大小的差别来进行分离。

图 1

当一个聚合物样品被注入色谱柱时，试样溶液流经凝胶固定相颗粒，其中分子尺寸较大的不能进入凝胶孔隙，既被固定相排斥。因此这些分子便直接流出色谱柱，而他们的色谱峰便最先在色谱图上出现。另外，样品中尺寸最小的分子则能够进入固定相中所有的孔隙并浸入到整个颗粒内部，于是它们通过色谱柱最慢，保留时间最长，其色谱峰在谱图上出现最晚，而中等尺寸的分子只能够进入固定相中部分较大的孔隙，因而以中等流速流过色谱柱。这样便按照分子尺寸的大小，按从大到小的顺序实现了样品中各组分的分离。如图2所示：

图 2

GPC的实验方法是先利用同一组分已知分子量的窄分散性（/≤1.1）聚合物标准试样，在与未知试样相同的条件下得到一系列GPC谱图。然后以标准样的峰位置V e（V e被测标样的洗脱体积）对lgM作图，得到校正曲线，从而建立处理方法。然后根据未知样的V e得到对应的分子量信息。由于大多数的聚合物标样不易获得，通常情况下使用窄分散性的聚苯乙烯作为标准样来获得校正曲线，当被测样品与标准样具有相同或相近的化学结构组成时得到的分子量信息与真实值更为接近，当被测样品与标准样的化学结构组成有偏差时得到的分子量信息仅具有相对意义，且结构组成偏差越大分子量信息与真实值的偏差也越大。

此外从聚合物的GPC曲线的形状（对称、不对称、单峰、双峰等）我们可以粗略地得知该聚合物样品的分子量分布情况，GPC峰的峰宽则可大致反映聚合物的多分散性。通过计算处理（以标准曲线为参考，电脑程序自动完成），可以得到聚合物的数均分子量、重均分子量和z均分子量，进而得到聚合物的多分散性系数d，由此可以获得关于聚合物的多种定性信息。

2. 凝胶渗透色谱仪的基本构造。

GPC仪的组成主要由泵系统、进样系统、凝胶色谱柱、检测系统和数据采集与处理系统这几部分组成。

泵系统：包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和一个高压泵。它的工作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工作状况好坏直接影响着最终数据的准确性。越是精密的仪器，要求泵的工作状态越稳定。要求流量的误差应该低于0.01mL/min。

进样系统：与液相色谱进样系统类似可分为手动和自动两种。

色谱柱：是在一根不锈钢空心细管中加入孔径不同的凝胶颗粒作为填料。每根色谱柱都有一定的相对分子质量分离范围和渗透极限，色谱柱有使用的上限和下限。色谱柱的使用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中凝胶颗粒最大的孔隙的尺寸还大，这时高聚物无法进入凝胶颗粒，全部从凝胶颗粒外部流过，因此无法达到分离不同相对分子质量的高聚物的目的。而且还有堵塞柱子的可能。色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子其流体力学体积比凝胶颗粒最小的孔隙还要小，这时也无法达到分离的目的。所以在使用凝胶色谱仪测定相对分子质量时，必须首先选择好与聚合物相对分子质量范围相配的色谱柱。

检测系统：有示差折光仪检测器、紫外吸收检测器、红外、荧光、电导检测器等。示差折光仪检测器利用溶剂的折光指数与被测样品的折光指数的不同来实现检测，此检测器要求被测样品与溶剂的折光指数要有尽可能大的区别，且此检测器对温度较为敏感，因此检测器与流路系统所处的环境温度必须恒定。紫外吸收检测器则要求被测样品在检测范围内具有特征吸，且在该特征吸收附近溶剂没有强烈的吸收。其他的检

测器主要适用于对该检测器有特殊响应的高聚物和有机化合物。GPC仪的主要组成见图3：

图 3

三、实验仪器及辅助器材

美国Waters公司生产凝胶渗透色谱仪，色谱柱响应范围

500~600000Da，色谱泵型号Waters1515，检测器型号Waters2414，色谱纯四氢呋喃300ml，1ml注射器4只，4ml带盖玻璃样品瓶4个，50μl玻璃进样器1只，一次性医用手套4副，孔径0.45μm有机系针头过滤器4个。

四、实验步骤

1. 标样及待测样的制备。

将标样及待测样品配制成3~5mg/ml的溶液，溶液配制过程中不可剧烈摇动，不可超声助溶。将配制好的溶液静置数小时，使分子链充分舒展。

2. GPC仪的开启及稳定。

打开电脑，然后启动色谱泵及检测器，待检测器初始化完毕后打开测试软件。随后要排除流路中的气泡，此过程分为排除管路气泡和泵内气泡两部分。排除管路气泡：首先逆时针旋转泵中央黑色旋钮一周，然后用塑料注射器手动排除溶剂瓶至泵入口的管路中气泡，然后将旋钮复位。排除泵中气泡：此过程需要用大流速冲洗。首先将流路控制阀调至松弛状态，不然高流速会产生压力过大而损坏色谱柱。然后将软件中泵流速调至5ml/min，持续2~3分钟。冲洗完毕后一定要先停止泵然后将流路控制阀复位。然后根据实验情况设定色谱柱、检测器温度及色谱泵的流速。将仪器置于已设定状态下稳定4到5个小时，然后方可进行测量，在仪器稳定过程中要进行检测池冲洗。

3. 标准曲线的制备，样品测试及数据处理。

在相同的条件下测试窄分布标样与试样并获得色谱图，根据窄分布标样的保留时间及分子量信息制备标准曲线，并依照此标准曲线创建数据处理方法。用已创建的数据处理方法处理试样谱图，从而获得试样的相关分子量信息。

五、分析与思考

1. GPC在什么条件下获得的分子量信息与真值最为接近？什么情况下获得的是相对分子量信息？

答：当制备校正曲线所用的窄分布标准试样与待测试样为同一种类聚合物，且测试所用的条件完全一致时，GPC所获得的分子量信息与真值最为接近。当聚合物标样不易获得，校正曲线参照的是其他物质时，只能得到相对分子量。

2. 用GPC测定具有相同分子量的线性聚合物与支化聚合物时，哪一种聚合物最先从色谱柱中流出？为什么？

答：线性聚合物最先从色谱柱中流出。具有相同分子量的支化聚合物与线性聚合物相比结构更为紧凑，当两种聚合物的分子链在溶液中充分舒展开时，线性聚合物具有较大的流体力学体积，依据GPC原理具有较大的流体力学体积的分子在色谱柱中的保留时间较小，因此线性聚合物最先从色谱柱中流出。

附：GPC操作流程

1 开机顺序

1.1 打开稳压电源及打开电脑。

1.2 电脑稳定后打开色谱泵和检测器。

1.3 检测器初始化完毕后根据具体实验情况设定检测器和柱温箱

温度，点击检测器控制面板Temp℃按钮，进入温度设置界面，

分别设置Det和Col项Set栏温度值，温度值大小取决于具体实验

情况，一般情况下要高于室温5-10℃。

2 仪器预热及实验参数设置

2.1 打开软件，双击Breeze2图标，出现选择项目和系统对话框，

在色谱系统栏中选择GPC项，进入主界面。点击主界面中部水龙

头图标，出现改变流量对话框，将流量A值及变化率分别设置为

1ml/min，升速时间5min。仪器预热时间不少于4小时。

2.2 仪器稳定后点击检测器控制面板shift和purge按钮，检测器自

动调整为检测池冲洗状态。冲洗检测池时间不小于30min，检测

池冲洗完毕后再次点击shift和purge按钮，返回正常流路。

3 进样检测

3.1 点击软件主界面中水龙头图标，根据具体实验情况调整实验

流速及升速速率。待流量值升至实验预设值后点击主界面下方调用方法组编辑器向导图标，出现新方法组：选择仪器方法对话框，选择test GPC项，单击下一步完成设置。

3.2 点击主界面下方左侧平衡系统/监视基线图标，出现设定平

衡/系统监视器对话框，选择平衡/监视器项，监测基线直至基线稳定，然后点击中断正在运行的样品组或单进样图标，终止监测。

3.3 进样口旋钮旋至load状态，点击主界面中单进样图标，出现

定义进样参数对话框，输入样品信息然后点击进样选项，仪器处于待进样状态。用微量进样器抽取20μl过滤后的样品，并注入进样口，将进样口旋钮快速旋至inject状态，开始测试。仪器自动获得图谱。