美国药典细菌内毒素法27版中文
生物检测实验
<85> 细菌内毒素检测
?本文中部分内容与欧洲药典和/或日本药典的相应的内容是一致的，那些不一致的内容则用符号（??）标明。?
本文提供一种检测或定量可能出现在样品中的细菌内毒素的实验，它使用从鲎（美洲鲎或东方鲎）的循环阿米巴细胞的抽提液中制备的鲎试剂。?1
细菌内毒素实验有两种技术：基于凝胶形成的凝胶法和光度测定法。后一种方法包括浊度法——基于一内源性基质断裂后的浊度变化；和显色基质法——基于一个带有生色团的合成肽断裂后颜色的变化。除非文中另有说明，否则可用上述方法中的任何一种。若检测结果存在争议，除非文中另有说明，以凝胶法结果为准。
在凝胶法技术中，反应的终点是将供试品稀释液与平行稀释的参考内毒素进行直接比较得到的，内毒素的量用USP内毒素单位（USP-EU）表示。[注：1 USP-EU等于1 IU 的内毒素]
由于有专门制备的浊度法或显色法鲎试剂，因此也可按照要求使用这些检测方法。这些试验方法要求先建立一条标准回归曲线，供试品的内毒素含量通过该曲线求得。试验过程包括将内毒素和对照溶液与鲎试剂的反应管按照预先设定的时间恒温孵育，以及在适当波长用分光光度计读取吸光度。在终点浊度法检测中，孵育期结束时应立刻读取读数；在终点显色法检测中，在到达预先设定的反应时间时，添加酶停止反应试剂使反应停止后再读取读数。在动态浊度和显色法中，在整个反应期间始终对光密度的进行测定，而百分比值是通过这些读数来确定的。
器械和玻璃用具
所有玻璃用具和耐热材料应置于热空气烤箱中有效除热原，?2通常使用的最少时间和最低温度为30分钟，250℃。如果使用塑料用具，如微孔板和自动加样器配套的吸头之类的，应确认其不含可测内毒素并不会干扰试验。 [注：在这一章中，“管”这个词泛指其它任何容器，如微量孔板的孔]
?1除了内毒素，鲎试剂也与某些β-葡聚糖反应，一些经过处理而制备的鲎试剂不会与β-葡聚糖反应，对于含有葡聚糖的样品的检测应用此类试剂。
?2关于灭活内毒素的有效性实验的过程，见灭菌和无菌验证中的干热灭菌。使用灵敏度不小于0.15EU/ML的鲎试剂。
内毒素标准品原液和内毒素标准品溶液的制备
美国药典（USP）的参考内毒素的指定效价为每瓶
10,000个 USP 内毒素单位 (EU)。每瓶内毒素参考品用5mL细菌内毒素检查用水复溶?3，用旋涡混合器间歇混合30分钟制成原液，并用这个原液制备适当的稀释系列。将原液置于冰箱中保存作为以后制备稀释液之用，但保存时间不得超过14天。使用前用旋涡混合器强力混合至少3分钟。每一步稀释至少混合30秒，然后才能用它进行下一步稀释。不要贮存内毒素参考品的稀释液，因为没有数据证明吸附作用不会使其失去活性。
预备试验
使用复核过标示灵敏度的鲎试剂。
细菌内毒素试验结果是否有效，必须从待检的产品或溶液、洗剂或抽提液中取样，并充分证明它们本身对反应没有抑制、增强作用，否则视为对实验有干扰作用。可用指定的三种检测方法中所叙述的抑制或增强试验来进行验证。试验应设置适当的阴性对照。如果鲎试剂的来源、生产方法或配方发生改变时，都要重新进行验证试验。
供试品溶液的制备
用细菌内毒素检查用水溶解或稀释药品或抽提医疗器械来制备供试品溶液。某些物质或产品用其它水性溶液溶解、稀释或抽提可能更合适。如果有必要，调节待检溶液（或稀释液）的pH值以使鲎试剂和供试品的混合物的pH值在鲎试剂生产商指定的pH值范围内。这通常适用于pH值为6.0-8.0之间的产品。可用酸、碱或鲎试剂生产商推荐的合适的缓冲液调节pH值，酸和碱可用原液或固体物加细菌内毒素检查用水于无内毒素的容器中进行制备。缓冲液必须经过
验证确认无可测的内毒素和干扰因子。
?3注射用灭菌水或与所用鲎试剂在灵敏度限值内不反应的其它水。
最大有效稀释倍数(MVD)的确定
最大有效稀释倍数是供试品被允许的最大稀释倍数，在此稀释倍数下可确定内毒素限值。它适用于注射液或非经肠道的以溶解或稀释形式给药的药品溶液，或者以重量计算给药剂量的药品如果给药量与按体积计算的给药量有差异。计算MVD的等式如下:
供试品溶液的浓度和λ定义如下，当内毒素限值浓度以体积表示(EU/mL)时, 用限值除以λ来计算MVD倍数, λ是鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）；当内毒素限值浓度以重量或活性单位（EU/mg或EU/U）表示时，用限值乘以供品溶液浓度或依据标签上的说明复溶的供试品浓度（mg/mL或单位/mL），视乎哪个更合适，然后将乘积除以λ来得出MVD倍数。由此获得的 MVD 倍数即是制备有效的供试液的最大稀释倍数。
内毒素限值的建立
依据剂量来定义，非经肠道药品的内毒素限值等于K/M?4, K 是人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，M是人每公斤体重每小时的最大注射剂量。
非经肠道药品的内毒素限值在其他文中有给出，以单位表示，如EU/mL、 EU/mg 或 EU/生物活性单位。
凝胶法技术
凝胶法技术是根据鲎试剂在出现内毒素时会产生凝胶的原理来定量检测内毒素的方法。在标准条件下,能使鲎试剂产生凝胶的内毒素的最低浓度为鲎试剂的标示灵敏度。为确保该实验的精确性和有效性，应进行标示灵敏度的复核试验和干扰试验，在“凝胶法预备试验”中介绍了这两个试验。
?4除了鞘内给药（K=0.2USP-EP/公斤体重）外，任何给药途径的K都等于5 USP-EU/kg。对于非鞘内给药的放射性药品，其内毒素限值=175/V，V为每毫升的最大推荐剂量；对于鞘内给药的放射性药品，其内毒素限值=14/V。对于按每平方米体表面积给药的药品（通常为抗癌产品），内毒素限值公式为K/M，
22）/ 70kg
λ
供试品溶液浓度
内毒素限值?
=
MVD
凝胶法预备试验
鲎试剂灵敏度复核试验—每批鲎试剂至少取1支样品来复核标示灵敏度。用细菌内毒素检查用水将USP内毒素参考标准品溶解制成一个2倍稀释系列，即2λ, λ, 0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准品溶液, λ定义如上。4个浓度的内毒素标准品溶液分别重复4管检测并设置阴性对照管。当使用新批号的鲎试剂或当试验条件发生了可能影响试验结果的变化时，须进行鲎试剂标示灵敏度复核试验。
将一定量的鲎试剂和等量（如0.1mL）的各浓度内毒素标准溶液分别加入每支检测试管中混合，如果使用装有冻干鲎试剂的单次试管或安瓿，可将溶液直接加入试管或安瓿中，根据鲎试剂生产商的建议将反应混合物恒温孵育一段时间（通常是37±1℃，60±2分钟），避免振动。将每支试管轮流从恒温箱中直接取出并轻轻翻转180?观察结果，如果内容物形成坚实凝胶并在试管翻转后不从管壁滑脱，则记为阳性；如果未形成完整的凝胶，则结果为阴性。最低浓度的标准品溶液的所有重复管都为阴性结果时，试验才为有效试验。
终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。按下式计算反应终点浓度的对数平均值然后求此平均值的反对数：
终点浓度的几何平均值 = antilog (∑e/f)
式中∑e 为所用稀释系列的终点浓度的对数值之和，f 为重复试管数。终点浓度几何平均值为鲎试剂灵敏度的测定值(EU/mL)。如果该值在0.5λ～2λ之间，则该批鲎试剂的标示灵敏度符合规定，可以用于试验。凝胶法干扰试验—按表1制备溶液A, B, C 和 D 并用不超过MVD稀释的不含有可检测到的内毒素供试品溶液进行抑制/增强试验，操作方法同上述鲎试剂标示灵敏度的复核项下。溶液B和 C 的终点浓度几何平均值的计算与该检测中使用的等式相同。
溶液 A: 无可测内毒素的待检供试品溶液溶液 B: 实验干扰对照
溶液 C: 鲎试剂灵敏度复核对照
溶液 D：阴性对照（检查用水）
当任何有可能影响检测结果的条件改变时应重新进行试验。如果该试验中溶液A和D所有重复管都为阴性结果，而且溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内，则认为此次试验有效。
如果用溶液B所测得的试剂灵敏度在0.5λ～2.0λ之间，则供试品溶液在所使用的试验条件下没有干
如果供试品在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释后，再重复干扰试验。使用高灵敏度的鲎试剂可对供试品进行更大倍数的稀释，这有助于消除干扰。
干扰可用适当的方法来排除，例如中和、透析或加热。为了证明所选择的处理方法有效消除了干扰而不
且已经过选定的方法处理制备的供试品溶液进行下述试验。
凝胶法限量试验
对内毒素限值有要求时使用这种检测方法。
方法—按表2制备溶液 A, B, C 和 D，按照凝胶法预试验项下的鲎试剂标示灵敏度复核试验步骤进行试验操作。
表 2 凝胶法限量试验的溶液制备
溶液* 内毒素浓度/添加了内毒素的溶液重复管数
A 无/稀释的供试品溶液 2
B 2λ/稀释的供试品溶液 2
C 2λ/细菌内毒素检查用水 2
D 无/细菌内毒素检查用水 2
*用不超过最大有效稀释倍数和凝胶法预试验项下的干扰试验中所述的处理方法来制备溶液 A 和阳性产品对照溶液B，阳性对照溶液B和C中含有相当于2λ浓度的标准内毒素。阴性对照溶液D为细菌内毒素检查用水。
结果判断—当阳性对照溶液B和C中所有重复管均为阳性结果以及阴性对照溶液D所有重复管均为阴性结果时，试验方为有效。如果溶液A的两支重复管均为阳性时，供试品不符合规定。
如果溶液A中一管为阳性结果另一管为阴性结果，则需重复此试验，重复试验中，如果溶液A的两管均为阴性结果，则该供试品符合规定。如果用小于MVD的倍数稀释供试品其检测结果为阳性，则该试验可重复进行，但稀释倍数不得大于MVD。
凝胶法半定量试验
本方法是通过确定终点浓度来量化供试品溶液中的细菌内毒素。
方法—按表3制备溶液A、B、C和D。按照凝胶法预试验项下的鲎试剂标示灵敏度复核试验步骤进行试验操作。
释倍数。用细菌内毒素检查用水将已通过干扰试验的四管供试品溶液再进行1, 2, 4和 8倍稀释。也可用其它适当的稀释倍数。
溶液 B: 含浓度为2λ的标准内毒素的溶液A(产品阳性对照)
溶液C: 分别含浓度为2λ, λ, 0.5λ和 0.25λ的标准内毒素的两个细菌内毒素检查用水系列，每个系列4个浓度
溶液 D: 细菌内毒素检查用水 (阴性对照)
计算与说明—当试验符合以下条件时才为有效试验： (1) 阴性对照溶液D的两支重复管均为阴性结果(2) 样品阳性对照溶液B的两支重复管均为阳性结果(3) 溶液C的终点浓度的几何平均值在0.5λ～ 2λ范围内。
要计算溶液A的内毒素浓度，可将每一终点对应的稀释倍数乘以λ计算出每个稀释系列的每支重复管的终点浓度，供试品溶液的内毒素浓度即是各重复管的终点浓度的几何平均值（公式用“凝胶法预试验”项下鲎试剂灵敏度复核试验中的公式）。如果试验中
用的是稀释过的供试品溶液，计算其原始供试品溶液的内毒素浓度时，可以用原始浓度乘以各自的稀释倍数。如果供试品溶液在有效试验中结果均为阴性，内毒素浓度应记为小于λ (如果是稀释的样品，其检测结果浓度记为小于λ乘以供试品的最小稀释倍数)。如果所有结果为阳性，内毒素浓度应记为等于或大于最大稀释倍数乘以λ (例，表3中初始稀释倍数乘以8乘以λ)。
如果内毒素浓度小于各品种正文中规定的浓度时，供试品符合规定。
光度测定法
浊度法测定浊度的增长，根据所使用的检测原理，该方法分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是基于反应混合物的内毒素浓度与其在恒温孵育结束时的浊度（吸光度或透光率）之间的量化关系；动态浊度法是一种测定反应混合物的浊度达到某一预先设定的吸光度所需的反应时间或浊度增长速率的方法。
显色基质法检测由内毒素与鲎试剂反应时从特定的显色肽中释放出来的生色团。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是基于内毒素浓度与其在恒温孵育结束时释放的生色团之间的量化关系。动态显色法是测定反应混合物的颜色达到某一预先设定的吸光度所需的反应时间或检测颜色增长速率的方法。
所有的光度测定法都是在鲎试剂生产商推荐的恒温温度下进行，通常是37±1℃。
光度测定法的预试验
为了确保浊度法和显色法的精确性和有效性，需要进行预试验来证实标准曲线的可靠性和供试品溶液对反应没有抑制或增强作用。当任何有可能影响试验结果的条件改变时，要求对试验方法重新验证。
校验标准曲线的可靠性—用标准内毒素溶液制备至少三个浓度的稀释液来建立标准曲线，根据所用鲎试剂供应商的指导（关于体积比例、孵育时间、温度、pH值等）进行试验，每个标准内毒素浓度至少做三个重复管。如果动态法中要求的范围大于两个对数数量级，则应该在标准曲线范围内添加额外标准品来支持每个对数数量级的递增，在鲎试剂生产商指定的范围内，相关系数|γ|的绝对值必须大于或等于0.980。干扰试验—选定一个内毒素标准曲线的中点或接近中点的浓度，按表4制备溶液A, B, C 和 D ，按照所使用的鲎试剂的说明书进行溶液A, B, C 和 D 的试验(比如供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的体积比例、恒温孵育时间等)，每种溶液至少做两个重复管。
用含有添加内毒素的供试品溶液的平均内毒素浓度减去没有加内毒素的供试品溶液的平均内毒素浓度来计算添加的内毒素的平均回收率。为了确认在检测条件下没有干扰，在减去未加内毒素的溶液中任何可检测到的内毒素浓度后，添加到供试品溶液中的内毒素浓度测定值必须在已知的添加内毒素浓度的50%～200%之间。当内毒素回收率超出指定范围时，应按凝胶法干扰试验中的方法消除干扰因素。重复凝胶法干扰试验验证处理的有效性。
表 4. 光度技术抑制/增强试验的溶液制备
溶液内毒素浓度加入内毒素的溶液重复管数
A 无供试品溶液不少于2
B 标准曲线的中点浓度供试品溶液不少于2
C 至少3个浓度 (λ为最低浓度) 细菌内毒素检查用水
D 无细菌内毒素检查用水不少于 2
溶液A: 稀释倍数不超过MVD的供试品溶液
溶液 B: 已添加浓度等于或接近标准曲线的中点浓度的内毒素，与溶液 A有相同稀释倍数的供试品溶液。溶液 C: 光度技术预试验项下“标准曲线的可靠性试验”中所述的验证方法所用标准内毒素溶液(阳性对照系列)。
溶液 D: 细菌内毒素检查用水 (阴性对照)
光度技术操作程序
按照分光光度法预试验项下的干扰试验中所述的程序进行操作。
分光光度法中的计算
用阳性对照组C生成的标准曲线计算溶液A每支平行管的内毒素浓度，如果符合下述三项要求，则认为试验有效。(1) 对照系列C的结果符合分光光度法项下的标准曲线的可靠性试验中所述的有效要求； (2) 用溶液B的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度计算出内毒素回收率在其对数值的50%～200%范围内；
(3)阴性对照系列Ｄ的结果不超过所用的鲎试剂说明书中规定的空白限值。
分光光度法结果说明
如果溶液A中的所有重复管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数和浓度后，其结果小于产品的内毒素限值，则供试品符合规定。
细菌内毒素检查方法
细菌内毒素检查方法综述 【关键词】细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值 细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查［1］，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细菌内毒素检查法作一综述。 1 方法、机理及影响因素 1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法［2］。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定［1］。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2 /Mg2 离子浓度和pH等因素的影响［3］。同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。淘金者https://www.360docs.net/doc/745468291.html, 1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。 图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略） 2 影响细菌内毒素检查的因素 2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。
细菌内毒素
细菌内毒素检查法 一、细菌内毒素检查法的定义： ●本法是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机理，以判断供试品中的细菌内毒素限度是否符合规定的一种方法。 二、背景介绍： ●1、细菌内毒素 ●2、热原 ●3、鲎 1、细菌内毒素 ●细菌内毒素是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，当其死亡或菌体裂解时释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质 特性： ●（1）.致热性：内毒素作用人体细胞，使之释放内源性热原，刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应。 ●（2）.耐热性：需250度干热30分钟才能彻底灭活。 ●（3）.分子极性：多糖链亲水，脂肪链疏水，在水中呈不均匀分布。 ●（4）.鲎反应：能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶。 2、热原 2.1热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质 2.2 细胞分裂素（IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ） 内源性热原｛ 产生细胞分裂素的物质 内毒素热原 外源性热原｛非内毒素热原（病毒、细菌、真 菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素） 2.3热原和内毒素的关系： 2.3.1热原是否就是内毒素？ 在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。 3、鲎 3.1鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有―活化石‖之称。又具有很高的药用价值。 3.2鲎试剂 鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。鲎血液颜色呈蓝色，是因为鲎血浆的主要成分是血蓝蛋白。这种蓝色血液的提取物——―鲎试剂‖。鲎试剂是由海洋生物鲎的血液提取物制成的―鲎试剂‖，能够准确、快速地检测人体是否因细菌感染而致病；鲎试剂在制药行业中，用于检测细菌内毒素。目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂和东方鲎鲎试剂两大类。
美国药典(USP)规定的色谱柱编号
美国药典(USP)规定的色谱柱编号 L1和L8是美国药典(USP)规定的色谱柱编号，其实就是ODS柱和NH2柱。下面是USP规定的编号所对应的色谱柱类型。 L1：十八烷基键合多孔硅胶或无机氧化物微粒固定相，简称ODS柱 L2：30～50m m表面多孔薄壳型键合十八烷基固定相，简称C18柱 L3：多孔硅胶微粒，即一般的硅胶柱 L4：30～50m m表面多孔薄壳型硅胶柱 L5：30～50m m表面多孔薄壳型氧化铝柱 L6：30～50m m实心微球表面包覆磺化碳氟聚合物，强阳离子交换柱 L7：全多孔硅胶微粒键合C8官能团固定相，简称C8柱 L8：全多孔硅胶微粒键合非交联NH2固定相，简称NH2柱 L9：强酸性阳离子交换基团键合全多孔不规则形硅胶固定相，即SCX柱 L10：多孔硅胶微球键合氰基固定相（CN），简称CN柱 L11：键合苯基多孔硅胶微球固定相，简称苯基柱 L12：无孔微球键合季胺功能团的强阴离子交换柱 L13：三乙基硅烷化学键合全多孔硅胶微球固定相（C1），简称C1柱 L14：10m m硅胶化学键合强碱性季铵盐阴离子交换固定相，简称SAX柱 L15：已基硅烷化学键合全多孔硅胶微球固定相，简称C6柱 L16：二甲基硅烷化学键合全多孔硅胶微粒固定相 C2柱 L17：氢型磺化交联苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,强阳离子交换柱 L18：3～10m m全多孔硅胶化学键合胺基（NH2）和氰基（CN）柱 L19：钙型磺化交联苯乙烯－二乙烯基苯共聚物，强阳离子交换柱 L20：二羟基丙烷基化学键合多孔硅胶微球固定相（Diol），简称二醇基柱 L21：刚性苯乙烯－二乙烯基苯共聚物微球填料柱
中国药典版《细菌内毒素检查法》.pdf
中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
细菌内毒素的检测
细菌内毒素的检测 摘要:本文研究了注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素的检测。 本文是在通过调查大量的科技文献的基础上，按照中国药典2000版二部附录XI E细菌内毒素检查法所规定的试验方法而进行的。实验方案是根据注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的细菌内毒素限度，并结合现有的实验条件而确定的。注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠(Cefoperazone Sodium and Tazuobatanna)为头孢类抗生素头孢哌酮与β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠组成的复方注射用无菌粉针，在临床上用于治疗下呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、腹腔盆腔感染、以及其他感染。质量标准[国家食品药品监督管理局标准（试行）YBH0538 2003]中控制热原的方法仍为家兔热原法，鉴于家兔热原法有影响因素复杂、操作繁琐、检验成本高等缺点，而用细菌内毒素检查法来控制产品中的热原具有操作简便快捷、检验灵敏度高等优点[1]。为了在大范围内开展本品的细菌内毒素检查，我们对本品进行了细菌内毒素检查凝胶法的研究。本品细菌内毒素限值为0.15Eu/ml，在1.667至0.400mg/ml的浓度范围内，本品对细菌类毒素与鲎试剂的反应无干扰。我们对3批样品进行了检验，并与家兔热原法进行对比，结果一致都为阴性，认为本品可用细菌内毒素检查凝胶法代替家兔热原法。
关键词：注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素鲎试剂灵敏度复核试验干扰预试验干扰实验热原检查 0引言 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。(附图1) 附图1 内毒素脂多糖结构示意图 <一>、O—特异性链：位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由3—5个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。因此，它决定菌体热原的特异性。
美国药典USP31 71 无菌检查法中文版
美国药典USP31-NF26无菌检查法《71》.doc 71 STERILITY TESTS 无菌检查法 此通则的各部分已经与欧洲药典和/或日本药典的对应部分做了协调。不一致的部分用符号（）来标明。 下面这些步骤适用于测定是否某个用于无菌用途的药品是否符合其具体的各论中关于无菌 检查的要求。只要其性质许可，这些药品将使用供试产品无菌检查法项下的膜过滤法来检测。如果膜过滤技术是不适合的，则使用在供试产品无菌检查法项下的培养基直接接种法。除了具有标记为无菌通道的设备之外，所有的设备均须使用培养基直接接种法进行检测。在结果的观测与理解项下包含了复验的规定。 由于无菌检查法是一个非常精确的程序，在此过程中程序的无菌状态必须得到确保以实现对结果的正确理解，因此人员经过适当的培训并取得资质是非常重要的。无菌检查在无菌条件下进行。为了实现这样的条件，试验环境必须调整到适合进行无菌检查的方式。为避免污染而采取的特定预防措施应不会对任何试图在检查中发现的微生物产生影响。通过在工作区域作适当取样并进行适当控制，来定期监测进行此试验的工作条件。 这些药典规定程序自身的设计不能确保一批产品无菌或已经灭菌。这主要是通过灭菌工艺或者无菌操作程序的验证来完成。 当通过适当的药典方法获得了某物品中微生物污染的证据，这样获得的结果是该物品未能达到无菌检验要求的结论性证据，即便使用替代程序得到了不同的结果也无法否定此结果。如要获得关于无菌检验的其他信息，见药品的灭菌和无菌保证<1211> 按照下面描述的方法配制实验用培养基；或者使用脱水培养基，只要根据其制造商或者分销商说明进行恢复之后，其能够符合好氧菌、厌氧菌、霉菌生长促进试验的要求即可。使用经过验证的工艺对培养基进行灭菌操作。 下面的培养基已经被证实适合进行无菌检查。巯基醋酸盐液体培养基主要用于厌氧菌的培养。但其也用于检测好氧菌。大豆酪蛋白消化物培养基适合于培养霉菌和好氧菌。 Fluid Thioglycollate Medium 巯基醋酸盐液体培养基
细菌内毒素USP(清晰整齐)
BACTERIAL ENDOTOXINS TEST <85> USP35 Portions of this general chapter have been harmonized with the corresponding texts of the European Pharmacopoeia and/or the Japanese Pharmacopoeia. Those portions that are not harmonized are marked with symbols () to specify this fact. 这一章节已经和欧洲药典（EP）与日本药典（JP）统一。没有统一的部分已经用标记出 来。 The Bacterial Endotoxins Test (BET) is a test to detect or quantify endotoxins from Gram-negative bacteria using amoebocyte lysate from the horseshoe crab (Limulus polyphemus or Tachypleus tridentatus). 细菌内毒素检查法（BET）是通过鲎的阿米巴细胞溶解产物来检测或定量来自革兰氏阴性菌的内毒素。 There are three techniques for this test: the gel-clot technique, which is based on gel formation; the turbidimetric technique, based on the development of turbidity after cleavage of an endogenous substrate; and the chromogenic technique, based on the development of color after cleavage of a synthetic peptide-chromogen complex. Proceed by any of the three techniques for the test. In the event of doubt or dispute, the final decision is made based upon the gel-clot technique unless otherwise indicated in the monograph for the product being tested. The test is carried out in a manner that avoids endotoxin contamination. 细菌内毒素检查法有3种：凝胶法，基于凝胶的形成；浊度法，
USP《671》美国药典-包装容器——性能检测译文
《671》包装容器——性能检测 本章规定了用来包装的塑料容器及其组件功能性质上的标准(药品、生物制剂、营养补充剂和医疗器械)，定义了保存、包装、存储和标签方面的凡例与要求。本文提供的试验用于确定塑料容器的透湿性和透光率。盛装胶囊和片剂的多单元容器章节适用于多单元容器。盛装胶囊和片剂的单位剂量容器章节适用于单位剂量容器。盛装胶囊和片剂的多单元容器(没有密封) 的章节适用于没有密封的聚乙烯和聚丙烯容器。盛装液体的多元和单元容器的章节适用于多元的和单元的容器。 一个容器想要提供避光保护或作为一个符合耐光要求的容器，由具有耐光的特殊性质的材料组成，包括任何涂层应用。一个无色透明或半透明的容器通过一个不透明的外壳包装变成耐光的(见凡例和要求 )，可免于对光的透射要求。在多单元容器和封盖与水泡的单位剂量容器由衬垫密封情况下，此处使用的术语“容器”指的是整个系统的组成。 盛装胶囊和片剂的多元容器 干燥剂——放置一些颗粒4—8目的无水氯化钙在一个浅的容器里，仔细剔除细粉，然后置于110°干燥，并放在干燥器中冷却。 试验过程——挑选12个类型和尺寸一致的容器，用不起毛的毛巾清洁密闭表面，并打开和关闭每个容器30次。坚决每次应用容器密闭一致。通过扭矩关闭螺旋盖容器，使气密性在附表规定的范围内。10个指定的测试容器添加干燥剂，如果容器容积大于等于20mL，每个填充13mm以内封闭；如果容器的容积小于20毫升，每个填充容器容量的三分之二。如果容器内部的深度超过63mm，惰性填料或垫片可以放置在底部来最小化容器和干燥剂的总重量；干燥剂层在这样一个容器中深度不低于5cm。添加干燥剂之后，立即按附表中规定的扭矩封闭螺旋帽容器。剩余的2个指定为对照容器，每个添加足够数量的玻璃珠，重量约等于每个测试容器的重量，并用附表中规定的扭矩封闭螺旋帽容器。记录各个容器的重量，如果容器的容积小于20毫升，精确到0.1毫克；如果容器容积为20毫升或以上但小于200毫升，精确到毫克；如果容器容积为200毫升及以上，精确到厘克（10毫克）；在相对湿度75±3%和温度23±2°的环境下存储。[注意——浓度为35g/100mL的氯化钠溶液放在干燥器底部的渗透系统来维持指定湿度。其他的方法可以用来维护这些条件。] 336±1小时（14天）后，用同样的办法记录每个容器的重
内毒素知识介绍
内毒素知识介绍 (2010-01-16 10:00:17) 转载 分类：精彩推荐展示 标签： 抗体 细胞因子 蛋白 酶 试剂盒 信号转导 凋亡 生化 试剂 干细胞 生物 ips 细菌内毒素，英文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A 细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin 最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。 细菌英文叫Bacteria ：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌
分为G+菌和G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表： 关于细菌细胞壁结构，尤其G+/G-菌不同之处见下图所示： 由以上结构模式图可以发现，G+菌与G-菌有不同之处，其中对于G-菌来说： 细胞壁较薄，厚约10－15nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。 （1）脂蛋白（lipoprotein）由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。 （2）外膜（outer membrane）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成（图1-8），位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。
usp美国药典结构梳理
USP35-NF-30结构整理 vivi2010-10-02 USP总目录： 1 New Official Text修订文件 加快修订过程包括勘误表，临时修订声明（IRAS），修订公告。勘误表，临时修订声明，修订公告在USP网站上New Official Text部分刊出，勘误表，临时修订公告也会在PF上刊出2front matter前言 药典与处方集增补删减情况，审核人员，辅料收录情况 3凡例
药典， 1标题和修订 2 药典地位和法律认可 3标准复合性 4专论和通则 5 专论组成 6 检验规范和检验方法 7 测试结果 8 术语和定义 9 处方和配药 10 包装存储与标签 4通则 4.1章节列表 4.2一般检查和含量测定（章节编号小于1000）
检查和含量分析的一般要求 检查和含量分析的仪器， 微生物检查，生物检查和含量测定， 化学检查和含量测定， 物理检查和测定 4.3一般信息（章节号大于1000） 5食物补充剂通则 6试剂（试剂，指示剂，溶液等） 7参考表 性状描述和溶解性查询表（按字母顺序） 8食品补充剂各论（字母顺序） 9NF各论（辅料标准） 10 USP各论 11术语 附件：通则的章节中文目录（使用起来比较方便，直接找对应章节号即可）一、通用试验和检定 （1）试验和检定的总要求 1 注射剂 11 参比标准物 （2）试验和检定的装置 16 自动分析方法 21 测温仪 31 容量装置，如容量瓶、移液管、滴定管，各种规格的误差限度
41 砝码和天平 （3）微生物学试验 51 抗菌效力试验 55 生物指示剂：耐受性能试验 61 微生物限度试验 61 非灭菌制品的微生物检查：计数试验 62 非灭菌制品的特定菌检查，如大肠杆菌、金葡菌、沙门氏菌等 71 无菌试验 （4）生物学试验和检定 81 抗生素微生物检定 85 细菌内毒素试验 87 体外生物反应性试验：检查合成橡胶、塑料、高聚物对哺乳类细胞培养的影响 88 体内生物反应性试验：检查上述物质对小鼠、兔iv、ip或肌内植入的影响 91 泛酸钙检定 111 生物检定法的设计和分析 115 右泛醇检定 121 胰岛素检定 141 蛋白质——生物适应试验，用缺蛋白饲料大鼠，观察水解蛋白注射液和氨基酸混合物的作用 151 热原检查法 161 输血、输液器及类似医疗装置的内毒素、热原、无菌检查 171 维生素B12 活性检定 （5）化学试验和检定 A 鉴别试验 181 有机含氮碱的鉴别 191 一般鉴别试验 193 四环素类鉴别 197 分光光度法鉴别试验 201 薄层色谱鉴别试验 B 限量试验
细菌内毒素
Portions of this general chapter have been harmonized with the corresponding texts of the European Pharmacopoeia and/or the Japanese Pharmacopoeia. Those portions that are not harmonized are marked with symbols () to specify this fact. 这一章节已经和欧洲药典（EP）与日本药典（JP）统一。没有统一的部分已经用标记出来。 The Bacterial Endotoxins Test (BET) is a test to detect or quantify endotoxins from Gram-negative bacteria using amoebocyte lysate from the horseshoe crab (Limulus polyphemus or Tachypleus tridentatus). 细菌内毒素检查法（BET）是通过鲎的阿米巴细胞溶解产物来检测或定量来自革兰氏阴性菌的内毒素。 There are three techniques for this test: the gel-clot technique, which is based on gel formation; the turbidimetric technique, based on the development of turbidity after cleavage of an endogenous substrate; and the chromogenic technique, based on the development of color after cleavage of a synthetic peptide-chromogen complex. Proceed by any of the three techniques for the test. In the event of doubt or dispute, the final decision is made based upon the gel-clot technique unless otherwise indicated in the monograph for the product being tested. The test is carried out in a manner that avoids endotoxin contamination. 细菌内毒素检查法有3种：凝胶法，基于凝胶的形成；浊度法，
美国药典USP31(921)翻译版(上)
921WATER DETERMINATION水分测定 Many Pharmacopeial articles either are hydrates or contain water in adsorbed form. As a result, the determination of the water content is important in demonstrating compliance with the Pharmacopeial standards. Generally one of the methods given below is called for in the individual monograph, depending upon the nature of the article. In rare cases, a choice is allowed between two methods. When the article contains water of hydration, the Method I (Titrimetric), the Method II (Azeotropic), or the Method III (Gravimetric) is employed, as directed in the individual monograph, and the requirement is given under the heading Water. 很多药典物品要么是水合物，要么含有处于吸附状态的水。因此，测定水分含量对于证实与药典标准的符合性是很重要的。通常，在具体的各论中会根据该物品的性质，要求使用下面若干方法中的一个。偶尔，会允许在2个方法中任选一个。当该物品含有水合状态的水，按照具体各论中的规定，使用方法I（滴定测量法）、方法II（恒沸测量法）、或方法III（重量分析法），这个要求在标题水分项下给出。 The heading Loss on drying (see Loss on Drying 731) is used in those cases where the loss sustained on heating may be not entirely water. 在加热时的持续失重可能不全是水分的情况下，使用标题干燥失重（见干燥失重<731>）。 METHOD I (TITRIMETRIC) 方法I（滴定测量法） Determine the water by Method Ia, unless otherwise specified in the individual monograph. 除非具体各论中另有规定，使用方法Ia来测定水分。 Method Ia (Direct Titration) 方法Ia（直接滴定） Principle— The titrimetric determination of water is based upon the quantitative reaction of water with an anhydrous solution of sulfur dioxide and iodine in the presence of a buffer that reacts with hydrogen ions. 原理：水分的滴定法检测是基于水与二氧化硫的无水溶液以及存在于缓冲液中与氢离子反应的碘之间的定量反应。 In the original titrimetric solution, known as Karl Fischer Reagent, the sulfur dioxide and iodine are dissolved in pyridine and methanol. The test specimen may be titrated with the Reagent directly, or the analysis may be carried out by a residual titration procedure. The stoichiometry of the reaction
85 细菌内毒素检查法USP37
<85>细菌内毒素试验USP37 装置 将用于验证过程的所有玻璃器皿和热稳定性材料置于干热灭菌箱中以除去热原。最小灭菌时间和温度一般为30min,250°。若需使用塑料器皿，例如微孔板或自动加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素且对试验无干扰的器械。【注：在本章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微量滴定管】试剂及试液 阿米巴溶解产物（鲎试剂）——鲎试剂是一种由寄生于鲎（中国鲎或美洲鲎）中的阿米巴虫的溶解产物（白血细胞）获得的冻干产品。该试剂符合有关法规要求。 【注：鲎试剂会对一些除内毒素外的β-葡葡聚糖起反应。可利用鲎试剂不与葡聚糖反应，通过移除阿米巴溶解产物中会与葡聚糖反应的G因子或抑制阿米巴溶解产物的G因子反应系统和用于存在葡聚糖的内毒素试验。】 细菌内毒素检查用水（BET）——用注射用水或其他不与鲎试剂反应的在灵敏限度内的水。溶菌液供试液——在缓慢搅拌下，阿米巴溶解产物（鲎试剂）溶于BET检查用水或鲎试剂生产商建议的缓冲液中，根据生产需要贮存重组的鲎试剂，冷藏或冷冻。 溶液的制备： 标准内毒素储备液——标准内毒素储备液是根据包装上的说明书，制剂标签上标准内毒素储备液的储存和制备，用现行的WHO国际标准校准过的USP内毒素标准品制备的。内毒素用EU 表示。【注：1EU=1IU】 内毒素标准液——将内毒素储备液混合均匀，再用细菌内毒素检查用水对其作适当的系列稀释。尽快使用稀释液，以避免因吸附而失去活性。 供试液——供试溶液是通过用细菌内毒素检查用水溶解、稀释药物制备。某些物质或制剂可能在其他水溶液中被更适当地溶解、稀释。如有必要，调节待测溶液的pH值，使鲎试剂和样品的混合物pH在由鲎试剂生产者定的pH范围内。通常使用于pH范围在6.0-8.0的产品。pH 的调节可以用鲎试剂生产者推荐的酸、碱或适当的缓冲液。酸和碱可以在已去除内毒素的容器中用浓缩液或固体和细菌内毒素检查用水制备。缓冲剂必须进行验证无内毒素和干扰因子。最大有效稀释液（MVD）测定 最大有效稀释液是指内毒素限度待测样品的允许的最大范围的稀释液。用下列公式测定MVD：MVD = (内毒素限度×供试液浓度)/（λ） 内毒素限度——注射药品的内毒素限度取决于剂量，等于K/M2，其中K是每千克体重内毒素的阈值热剂量；M是每千克体重产品的最大推荐剂量。当进行间隔频繁注射和连续输液时，M 是指每小时给药的最大总剂量。在药典中，注射药品的内毒素限度规定为EU/mL, EU/mg, EU/单位生物活性，等。供试液浓溶液—— mg/mL内毒素规定为重量（EU/mg）的情况下；Units/mL内毒素规定为重量（EU/单位生物活性）的情况下；mL/mL内毒素规定为重量（EU/mL）的情况下。λ凝胶法（EU/mL）或者用于浊度法和显色法标准曲线的最低浓度的标示灵敏度。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公
美国药典USP气相色谱柱对照表
美国药典USP气相色谱柱对照表 L62 C30硅胶键合于完全多孔球状硅胶，粒径3~15μm。 G48 Highly polar, partially cross-linked cyanopolysiloxane. Rt-2560 G46 14% 氰丙基苯基- 86% 甲基聚硅氧烷 CB-1701MXT?-1701Rtx?-1701VF-1701ms OV-1701CBX-1701DB-1701DB-1701P G43 6% 氰丙基苯基- 94% 二甲基聚硅氧烷 MXT?-624DB-624MXT?-Volatiles CBX-1301 MXT?-1301OV-1301CB-624Rtx?-1301 VF-624ms/VF-1301ms Rtx?-624CB-1301CBX-624 G42 35% 苯基- 65% 二甲基乙烯聚硅氧烷 DB-35Rtx?-35MXT?-35CBX-35 HP-35DB-35MS G38 固定相G1 加减尾剂 MXT-1Rtx?-1MS Rtx?-1 G36 1% 乙烯基- 5% 苯基甲基聚硅氧烷 Rtx?-5MS Rtx?-5CBX-5MXT?-5 G35 聚乙二醇和硝基对苯二甲酸二乙二醇酯 DB-FFAP HP-FFAP CB-FFAP G32 20% Phenylmethyl-80% dimethylpolysiloxane. MXT?-20 G27 5% 苯基- 95% 甲基聚硅氧烷 CB-5XTI?-5Rtx?-5SIL MS VF-5ms Rtx?-5PONA HP-5MS HP-5DB-5MS SE-52DB-5SE-54 G25 聚乙二醇TPA（Carbowax 20M 对苯二酸） FFAP CBX-FFAP G19 25% 苯基- 25% 氰丙基甲基聚硅氧烷 OV-225Rtx?-225VF-23ms CBX-225 G17 75% 苯基- 25% 甲基聚硅氧烷 MXT?-65 G16 聚乙二醇（平均分子量15,000） DB-WAX CBX-Wax CB-WAX Stabilwax?PEG-20M Stabilwax?-DB Stabilwax?-DA MXT?-WAX
再论细菌内毒素限值的确定
再论细菌内毒素限值的确定 中国药品生物制品检定所北京 100050 王思理张国来蔡彤 国家药典委员会北京 100061 王平张莜红 中国药典2000年版已经正式出版，并将于2000年7月1日正式执行。细菌内毒素检查法应用指导原则及附件细菌内毒素定量检测法（动态浊度法和显色基质法）均被列入新版药典。指导原则中对细菌内毒素限值的确定有非常明确清楚的规定： "细菌内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L＝K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/u表示。K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·hr)表示。注射剂，K＝5 EU/(kg·hr)；其中放射性药品注射剂，K＝2.5 EU/(kg·hr)；鞘内用注射剂，K＝0.02 EU/(kg·hr)。M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml/ (kg·hr)、mg/(kg·hr)、 u/(kg·hr)表示，人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时，按1小时计算。 按人用剂量计算L值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际作必要调整。应该说，今后国内对细菌内毒素限值（L）的确定可以统一了。然而，从目前发表的文章和笔者审核的成果报告等都发现在药品的细菌内毒素检查法建立时对关键性的细菌内毒素限值（L）的确定尚存在不少问题。主要问题是对"M为人用每公斤体重每小时最大剂量"作了如下的解释： 其一、把最大剂量解释成"热原检查法剂量"。例如："注射用硝普钠中细菌内毒素的检查 注射用硝普钠的内毒素限值（L）：根据药品内毒素限值的计算方法，K=5.0EU/Kg，注射用硝普钠热原检查剂量M=1mg/Kg L=K/M=(5.0EU/Kg)/(1mg/Kg)=5EU/mg。显然，我们不能把热原检查剂量当作人用最大剂量。查阅美国药典24版（2000）规定的硝普钠和注射用硝普钠的细菌内毒素限值均为 0.05EU/μg。本例比美国严了10倍左右。
美国药典USP40-左氧氟沙星API
USP 40 Official Monographs / Levofloxacin 4831 Acceptance criteria: See Table 1. Sample solution: 1mg/mL of Levofloxacin in Mobile phase Chromatographic system Table 1(See Chromatography ?621?, System Suitability .)Relative Relative Acceptance Mode: LC Retention Response Criteria,Detector: UV 360 nm Name Time Factor NMT (%) Column: 4.6-mm × 25-cm; 5-μm packing L1Levodopa related Column temperature: 45°compound A 0.90.830.1Flow rate: 0.8mL/min Injection size: 25μL Levodopa 1.0——System suitability Levodopa related Sample: Standard solution compound B 2.8 0.83 0.5 Suitability requirements 5,6-Dihydroxy-in-Tailing factor: 0.5–1.5 dole-2-carboxylic Relative standard deviation: NMT 1.0%acid 6.0 2.5 0.1Analysis 0.1Samples: Standard solution and Sample solution individual Calculate the percentage of levofloxacin (C 18H 20FN 3O 4)— 0.3 total in the portion of Levofloxacin taken: Unknown impurities 1.0unknown Total impurities — — 1.1 Result = (r U /r S ) × (C S /C U ) × 100 r U = peak response of levofloxacin from the Sample ADDITIONAL REQUIREMENTS solution ?P ACKAGING AND S TORAGE : Preserve in tight, light-resistant r S = peak response of levofloxacin from the containers, in a dry place, and prevent exposure to ex-Standard solution cessive heat. C S = concentration of USP Levofloxacin RS in the ?USP R EFERENCE S TANDARDS ?11?Standard solution (mg/mL) USP Levodopa RS C U = concentration of Levofloxacin in the Sample USP Levodopa Related Compound A RS solution (mg/mL) 3-(3,4,6-Trihydroxyphenyl)alanine.Acceptance criteria: 98.0%–102.0% on the anhydrous C 9H 11NO 5213.19 basis USP Levodopa Related Compound B RS 3-Methoxytyrosine.IMPURITIES C 10H 13NO 4211.22 ?R ESIDUE ON I GNITION ?281?: NMT 0.2%. Use a platinum crucible. Delete the following: Levofloxacin ??H EAVY M ETALS , Method II ?231?: NMT 10ppm ?(Official 1-Jan-2018) ?O RGANIC I MPURITIES , P ROCEDURE 1 [N OTE —Procedure 1 is recommended if levofloxacin N -ox-ide is a potential organic impurity. Procedure 2 and Pro-cedure 3 are recommended if levofloxacin related com-pound B is a potential organic impurity.] Solution A, Mobile phase, Sample solution, and Chro-matographic system: Proceed as directed in the C 18H 20FN 3O 4·1/2H 2O 370.38Assay . 7H -Pyrido[1,2,3-de ]-1,4-benzoxazine-6-carboxylic acid, System suitability solution: 1mg/mL of USP Levoflox-9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)-acin RS in Mobile phase 7-oxo-hydrate (2:1), (S )-; Sensitivity solution: 0.3μg/mL of USP Levofloxacin RS (?)-(S )-9-Fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methyl-1-piper-in Mobile phase azinyl)-7-oxo-7H -pyrido[1,2,3-de ]-1,4-benzoxazine-6-car-System suitability boxylic acid, hemihydrate [138199-71-0].Samples: System suitability solution and Sensitivity Anhydrous [100986-85-41]. solution Suitability requirements DEFINITION Relative standard deviation: NMT 1.0%, System suit-Levofloxacin contains NLT 98.0% and NMT 102.0% of ability solution C 18H 20FN 3O 4, calculated on the anhydrous basis.Signal-to-noise ratio: NLT 10, Sensitivity solution IDENTIFICATION Analysis ?A . I NFRARED A BSORPTION ?197K ? Sample: Sample solution ?B . The retention time of the major peak of the Sample Calculate the percentage of each individual impurity in solution corresponds to that of the Standard solution , as the portion of Levofloxacin taken: obtained in the Assay.Result = (r U /r S ) × (1/F ) × 100 ASSAY ?P ROCEDURE r U = peak response of each impurity Buffer: 8.5g/L of ammonium acetate, 1.25g/L of cu-r S = peak response of levofloxacin pric sulfate, pentahydrate, and 1.3g/L of L -isoleucine in F = relative response factor (see Table 1)water Acceptance criteria: See Table 1. Mobile phase: Methanol and Buffer (3:7) Standard solution: 1mg/mL of USP Levofloxacin RS in Mobile phase USP Monographs