放线菌分离与筛选方法的研究进展

2010年20（4）生物技术

制了其应用范围，如真菌漆酶蛋白分子需要糖基化，不能用原核表达系统来高效表达，真菌漆酶只在pH偏酸性条件下具有活性而且热稳定性差，不能直接处理工业废水，因为大多数工业废水排放时温度高、pH呈碱性，而大多数细菌生长在碱性环境中，其漆酶在碱性条件下仍具有活性，而且热稳定性好，可以直接用于处理工业废水，在环境的生修方面发挥重要的作用。

细菌漆酶的基因可以在原核表达系统中进行高效表达，为获得更多的细菌漆酶蛋白提供可能，但细菌漆酶的研究还比较少，产漆酶细菌的筛选方法、细菌漆酶的结构特征、催化机理及细菌漆酶基因的克隆及外源表达方面的研究还有待加强。随着筛选方法的不断改善，将会有更多的产漆酶的细菌菌株被分离到，克隆到的细菌漆酶的基因中，将会有水溶性强、易于大量表达的蛋白被发现。另外，漆酶的氧化作用在介体的参与下会增强，如1－羟基苯并三唑（HBT）或ABTS作为介体应用于纸浆脱木素，但是对处理纸浆和造纸废水的介体研究得很少，有待于开发出高效的介体应用于环境污染的治理及生物修复等众多领域中。

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放线菌分离与筛选方法的研究进展

冯轶男，杨润清

（东北农业大学资源与环境学院，黑龙江哈尔滨150030）

摘要：该文综述了放线菌的分离筛选方法的最新研究进展，并对放线菌分离筛选方法众多因素优缺点进行比较。

关键词：放线菌；分离；筛选

中图分类号：Q936文献标识码：A doi：10．3969/j．issn．1004－311X．2010．04．144

59

生物技术2010年20（4）

收稿日期：2010－05－30；修回日期：2010－07－29作者简介：冯轶男（1982－），男，在读硕士生。

放线菌是一种能产生多种有益代谢产物且具有很高经济价值的菌种，如放线菌是产生抗生素活性物质最大的、具有很大经济价值的一类原核微生物。迄今，在工业、医学和农业上都有许多利用抗生素的成功实例。井冈霉素防治水稻、麦类

的纹枯病、菌核病等，每年应用面积1333万hm 2

以上，投放市场已30多年，一直对纹枯病高效，未发现抗药性。土壤中的

放线菌是拥有巨大应用价值的一类微生物类群，

放线菌及其有益代谢产物的研发与应用具有十分广阔的前景。

1

放线菌分离

1．1

土样预处理

土样的预处理是放线菌分离工作中至关重要的一环，在与处理方法中土样的风干与加热处理是在杂菌抑制中较为常

用的两种预处理方法，

这在国内外都研究得比较多。姜成林等将土样在室温条件下风干20d 后研碎过筛，

结果表明，土样中90%的细菌被杀死，同时对放线菌的出菌率也有很大的提高［1］

。司美茹等研究采用了同样的与处理时间，改变了不同的预处理温度作比较，结果表明，一定时间的加热预处理能较

好地抑制细菌的数量，

并可以促进放线菌的孢子萌发［2］

。在加热处理方面，母连军等把土样在120?下加热1h ，不仅可以更有效地去除细菌和真菌，并且可以促进放线菌孢子萌发以

及分离耐高温放线菌，

比如小双孢菌、高温单孢菌等［3］

。史学群等将室温下风干1 10d 处理与120?加热1h 处理的效果

进行比较，

结果表明风干处理得到的放线菌种类和数目均多于加热处理，因此怀疑由于加热处理温度过高杀死了部分不耐热的放线菌［4］

。闫建芳等将室温下风干的土样分别进行40、60、80、100、120?加热处理1h ，结果表明，放线菌的种类和数量随着对土样加热处理温度的升高而增多，其中100?加热

处理的土样获得放线菌数量最多［5］

。郑雅楠等将土样进行了

室温下风干10d 、

室温下风干20d 、50?下加热1h 与120?下加热1h 等处理，

结果发现室温下风干10d 与20d 土样中放线菌数目无明显变化，

20d 处理的土样中细菌菌落数较少；在120?高温处理1h 后的土样中，真菌、细菌以及放线菌全部被杀死；在50?高温处理1h 后的土样中，细菌数量较多，影响放线菌的分离效果，根据研究结果，他们认为室温风干10d 或者

20d 的处理效果要好于高温加热处理［6］

。Nonomura H 等采用有机物质溶液处理土样的方法分离放线菌，例如使用6%酵母膏溶液处理土样中促进放线菌孢子萌发而分离到新放线菌种属［7］

。杨宇等将土样与碳酸钙以10：1的比例混合，

他们认为这样可以促进瓜类枯萎病拮抗性放线菌孢子萌发以进行筛选［8］

。闫建芳等分别用0．01%、

0．05%、0．10%、0．20%SDS 溶液处理风干后的土壤样品20min ，结果发现其中用0．05%SDS 处理的土壤样品所获得的放线菌数量较多，并且细菌和

真菌也得到了较好的抑制［5］

。郑雅楠等用酵母膏、

蛋白胨与SDS 处理土壤悬浮液，并进行振荡培养。认为这样有利于土

壤种放线菌孢子的萌发。结果发现，

在土壤悬浮液中加6%酵母膏以及0．05%SDS 并在40?振荡培养20min 的分离方法可以较好地分离放线菌，而经过在土壤悬浮液内加入6%蛋白胨、

0．05%SDS 并于50?下振荡培养10min 的处理后分离效果也有很大提高。来航线等利用2%的腐殖酸溶液和1%的

酪蛋白水解物溶液处理土样，40?振荡20min ，这种分离方法

得到的放线菌数量较对照增加了22．77%和17．08%［9］

。1．2培养基成分

放线菌分离培养基中的营养物质对于放线菌的分离效果有着重要影响。一种培养基中不可能含有适合所有放线菌生

长的营养物质，因此如何改变培养基中各营养物质的组分含

量是关系到放线菌分离工作成败的关键，必须在实际分离中根据自己的目的不断改变培养基成分，以便更好地分离到目的放线菌。闫建芳等利用7种不同的分离培养基对土壤拮抗放线菌进行分离，结果表明，在7种培养基中高氏一号培养基、淀粉琼脂培养基以及HVG 培养基分离效果明显好于其他

培养基［5］

。司美茹等利用高氏一号等8种培养基进行放线菌

分离工作。结果表明在8种培养基中，

营养物质比较全面的培养基有高氏一号培养基以及秸秆腐解物培养基两种，仅仅使用这两种培养基就可以从土壤中分离到绝大部分的放线菌；因此他们认为高氏一号培养基和秸秆腐解物培养基所分

离的放线菌基本上能反映土壤种放线菌资源信息［2］

。来航线等使用高氏一号等9种培养基对特殊环境中的放线菌进行稀

释平板法分离，

并观察每个梯度的平板上细菌、真菌以及放线菌的生长情况，并比较不同分离培养基的分离效果，结果发现高氏一号培养基分离该土样所获得的放线菌种类及数量最多。此外，用葡萄糖－天门冬氨酸培养基和精氨酸－甘油培养基所分离得到的放线菌种类和数量均显著高于其他基础培

养基［9］

。Nonomura H 等人利用腐殖酸（Hv ）为分离培养基主

要成分，

再辅以一些化学试剂来分离放线菌，可分离到指孢囊菌、小双孢菌、小四孢菌、孢囊链霉菌等多种稀有放线菌［7］

。1．3杂菌抑制剂

放线菌分离工作中，在培养基中加入一定的杂菌抑制剂可以有效降低细菌和真菌的数量，从而减少它们对放线菌分

离的干扰。大量细菌生长在一起能形成菌苔，

会严重影响放线菌的挑取；而真菌蔓延速度迅速的特点也使其成为放线菌分离工作的障碍。因此如何有效地抑制细菌和真菌的生长，是杂菌抑制方法主要需要解决的问题。司美茹等以不同浓度

重铬酸钾、

青霉素以及链霉素组合加入高氏一号培养基中进行放线菌分离效果比较，

结果发现在放高氏一号培养基中加入75μg /mL K 2Cr 2O 7以及2μg /mL 青霉素可显著抑制细菌和

真菌生长，

且不影响放线菌数量和种类。此外他们还采用了化学抑制剂与加热的联合处理，结果表明，用这种方法分离出的细菌数量比纯化学抑制剂明显减少，而放线菌数量和种类

较纯化学抑制剂明显增加［2］

。郑雅楠等也用不同浓度的K 2Cr 2O 7对土壤中的放线菌进行分离，结果发现浓度为

150μg /mL 的K 2Cr 2O 7分离效果最好［6］

。史学群也研究了不同浓度的K 2Cr 2O 7对分离放线菌的影响，他研究的结果显示使用50μg /mL K 2Cr 2O 7时放线菌分离效果较好，对杂菌的抑

制也比较明显。闫建芳等使用常见几种抑制剂进行试验，

结果发现链霉素不适合作为放线菌分离过程中的杂菌抑制剂，

而1μg /mL 青霉素抑制杂菌效果相对明显［5］

。

2放线菌筛选方法的研究进展

土壤中的放线菌是拥有巨大应用价值的一类微生物类群。放线菌是一种能产生多种有益代谢产物且具有很高经济

价值的菌种

［10，11］

。到目前为止从放线菌发现的具有生物活性的物质大约有12000种，大约占整个天然生物活性物质的

50%左右，其中仅仅从链霉菌一个属就发现近万种

［12，13］

。因此，

放线菌的研究具有十分重要的科学价值和实用价值［14，15］

。2．1传统筛选方法

传统的放线菌筛选方法大多是以对某些如病原菌或杂草、昆虫等靶标的抑制和灭杀效果为标准来筛选产生活性物

质的放线菌

［16，17］

，即筛选拮抗放线菌。拮抗放线菌的筛选工作一般分为初筛和初筛后复筛两种，初筛是将经过分离得到的放线菌进行针对靶标的抑制活性筛选，这样做的好处是可以较早地知道是否筛选到了拮抗菌种，筛选范围广；而其缺点

是这种方法比较粗放，

且会浪费很多初始条件下不显示活性6

9

2010年20（4）生物技术

的菌株。复筛则是对初筛得到的阳性菌株进行进一步的改进，以便更有效地筛选出针对靶标的菌株。拮抗放线菌的筛选方法主要有以下几种：

（1）平板划线法［18］

将待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平半中央以划线法接种待测菌株，于28 30?下培养3 5d，将病原菌以垂直方向划线于待测菌生长线两侧，但不能与待测菌相连。在37?下培养24h后取出观察。如果待测菌株对于病原菌有抑制活性，则病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌的抑制，即产生了抑菌带。不同待测菌对病原菌的抑制活性强弱不同，因此形成的抑菌带长度也不一致，因此可以根据抑菌带的长短来判断待测菌疫情活性的强弱，选择抑制活性强的菌株进行进一步复筛。

（2）抑菌圈法或十字交叉法［19］

这是一种经常用于初筛的方法：首先将待测菌株接种在平板培养基上，待其长出成熟的菌落后，用打孔器将供试病原菌的菌苔打成直径为5 6mm的小菌块并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周。这样培养3 4d后，如果待测菌对病原菌有抑制活性，则在待测菌周围会形成一个没有生长病原菌的抑菌圈。如果菌块厚度和大小都是一致的，那么抑菌圈的大小可以直观地反应待测菌抑菌活性的强弱。

（3）纸片法或生长速率法［19］

这种方法主要用来测定发酵液的抑菌活性，即将相同的灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并粘贴在接种有病原菌的平板培养基上，经过一定时间的培养后观察有无抑菌圈或者抑菌圈的大小。

上述传统的筛选方法应用广泛，是目前主要采用的放线菌筛选方法。李新等采用平板对峙培养法从土壤中筛选出抑菌效果较好的拮抗放线菌［20］。高鹏等采用反向放置琼脂块的十字交叉法从黄土高原人工植被土壤中分离得到多种对辣椒疫霉、黄瓜枯萎、棉花枯萎及西瓜枯萎菌4种农作物土传病害有生防作用的放线菌［21］。潘争艳等从五味子、穿山龙、人参等19份辽宁药用植物土壤样品中共分离到放线菌272株，然后采用对峙培养法筛选到对穿山龙黑斑病病原菌有拮抗性菌株38株［22］。这些传统的放线菌筛选方法虽然目的性较强，但往往因为一些菌株在天然状态下产生活性物质的潜力没有被充分开发，因而不显示对靶标的活性而被闲置或销毁，造成了放线菌资源的极大浪费。

2．2抗生素抗性筛选方法的研究

目前对于具有生物活性放线菌的筛选工作主要集中在两个方面：一是新领域微生物资源开发；二是新型筛选方法的建立上［23］。新型的具有生物活性放线菌筛选方法主要着眼于放线菌产抗基因的激活与诱变上。

链霉素、氯霉素、金霉素等多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。因此抗生素产生菌的产抗水平受到自身所产抗生素的严格限制，一株高产抗生素产生菌必然应具备对自身所分泌的抗生素的抗性，非抗性菌株一般很难绕过这一机制。所以要得到高产菌株，除采用提高自身耐受性的发酵条件外，还要选育对自身抗生素脱敏的突变株，使这种突变株不仅生长不受影响，而且可以在高浓度自身代谢产物存在下提高产量，这样就可以使抗生素的反馈调节作用失效，从而使抗生素大量积累。因此筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。筛选金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株，从而使抗生素产量有数倍增加的实验结果已有不少报道。如卢文玉等采用激光诱变与链霉素抗性筛选法联合筛选出了达托霉素高产菌株，且提高了筛选效率［24］。郭卫寰等应用紫外和吖啶橙诱变，结合抗生素的抗性筛选，得到稳定高产的利迪链菌素产生菌株［25］。

菌种的抗性基因可通过其产物灭活胞内或胞外的抗生素，保护自身免受所产生的抗生素的杀灭作用，有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的合成，抗性基因经常和生物合成基因连锁，而且它们的转录有可能也是紧密相连的，是激活生物合成基因进行转录的必须成分。抗性基因必须首先进行转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才能进行。为某些菌种引入抗生素抗性，可激活原来无活性的抗生素生物合成基因。目前科学家已经从土壤中分离出很多原本无抗菌能力，但经过抗性突变而产生了抗生素的菌株。科学家还发现，从土壤中分离出的50%的菌株经过抗性筛选可以成为抗生素产生菌［26］，如表1所示。

表1100株放线菌的抗性筛选结果

Table1Results of resistant screening for the100actinomycetes strains Starting date：02/06/2000Finishing date：05/09/2000 Number of strains tested

100

No．618749to No．618892 Number of strains producing drug－resistant

mutants

95

Number of strains producing mutants that pro-

duce antibiotics

45

Number of strains producing the mutants to act

on E．coli K12

6

Number of strains producing the mutants to act

on C．albicans

17

Number of strains producing the mutants to act

on S．aureus209P

38

Number of strains producing the mutants to act

on B．subtilis6633

39

沈玲等以天然的12株无活性或活性微弱的放线菌为材料，引入链霉素耐药性突变，得到一株对植物病原真菌和细菌都具有较好抗菌活性的耐药突变株，试验结果表明，利用链霉素耐药性突变作用于微生物的核糖体，使之发生变化并改变其次生产物的代谢途径，可以获得具有农药开发价值的活性化合物［27］。然而，很少有利用多种抗生素进行放线菌抗性筛选的报道。

试验证明在筛选过程中，引入三种抗生素抗性是最合适的（26）。抗生素比较适宜的引入组合方式有以下3种：①两种不同种类的氨基糖苷类抗生素；②一种氨基糖苷类抗生素和一种安莎霉素类抗生素；③两种氨基糖苷类抗生素和一种安莎霉素类抗生素。其中比较典型的氨基糖苷类抗生素有链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素等。比较典型的安莎霉素类抗生素如：利福平、曲张霉素、康乐霉素A等。

目前新型放线菌的分离筛选工作进入了瓶颈阶段。但是从现代分子生物学的研究结果看，未知放线菌仍然无穷无尽。因此，不断设计新的简便、有效的分离程序，分离未知菌仍然是放线菌资源开发的关键之一。为此，第一，要不断改变培养基的成分，尤其是碳源的种类和量，设计新的培养基。第二，不断选用专一性的选择性抑制剂。第三，更新平板稀释法，创造完全新型的分离方法。

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生物技术

（双月刊，1991年创刊）2010年8月第20卷第4期（总119期）

BIOTECHNOLOGY

（Bimonthly，Started in1991）Vol．20No．4Aug．2010（Total No．119）

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