高效液相色谱_线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中_2_受体激动剂及_阻断剂类药物残留

中国科学B辑:化学 2009年第39卷第8期: 774~784 https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html, https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html,

774 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS

高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留

吴永宁①②*, 苗虹①*, 范赛①②, 赵云峰①②

①中国疾病预防控制中心营养与食品安全所, 北京100021;

②中国农业大学动物医学院, 北京100193

* 通讯作者, E-mail: wuyncdc@https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html,; miaohong0827@https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html,

收稿日期：2009-04-26; 接受日期：2009-05-26

摘要利用高效液相色谱-线性离子阱质谱(HPLC-ITMS)以同位素稀释技术测定了肌肉组织中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂. 肌肉样品经5%的三氯乙酸溶液酸解提取, 以弱阳离子固相萃取柱进行净化. 以甲醇和含0.1%甲酸的水溶液为流动相在液相色谱柱上梯度洗脱分离, 采用ESI源正离子模式在选择离子监测(SRM)模式下进行扫描. 以9种经氘代同位素标记的β2-受体激动剂为内标进行定量. 猪肉中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的线性范围为5~200 μg/L, 相关系数(r)大于0.995, 各化合物在肌肉中的检出限均能达到0.2 μg/kg. 以空白猪肉样品进行的加标水平为5、10、20 μg/kg的加标回收试验, 各化合物的回收率在47.3%~123.7%之间, 相对标准偏差在3.2%~25.7%之间. 对猪肉样品和鸡肉样品进行了测定, 得到了满意的结果. 该方法灵敏度高, 定性准确, 可以用于畜禽肌肉中β2-受体激动剂和β-阻断剂类药物残留的确证检测. 关键词

β2-受体激动剂β-阻断剂

肌肉

检测

HPLC-ITMS

1引言

β2-受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物(phenthylamines, PEAs), 具有苯乙醇胺结构母核, 苯环上连接有碱性的β-羟胺侧链. 由侧链上取代基的差异, 划分为不同的药物. β2-受体激动剂在临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量, 可用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎等症状. 20世纪80年代初, 一系列的动物实验表明, 当用药剂量超过治疗剂量5倍时, 该类药物如克伦特罗、沙丁胺醇等可以起到促进动物生长, 提高瘦肉率的作用[1~3], 随之而来的被大量非法添加于饲料中, 以促进家畜生长及提高瘦肉率, 因而导致β2-受体激动剂在动物体内的蓄积, 进一步引起食物中毒的情况发生. 自1983年西班牙首次发生克伦特罗食物中毒事件以来, 20世纪90年代, 欧洲因克伦特罗污染引起食物中毒的时间超过500起[4,5], 我国自1998年香港出现克伦特罗中毒事件后亦多次发生, 伴随着国内外对克伦特罗监管的加强, 利益的驱使促使不法分子, 将其他β2-受体激动剂[6], 如沙丁胺醇、马布特罗、溴布特罗和莱克多巴胺等非法添加与动物饲料及饮水中. 因此, 建立β2-受体激动剂多组分残留的测定方法是非常重要的. β-阻断剂类药物则被广泛用于动物运输过程中防治由于动物应激而造成的突然死亡, 由于该类化合物往往是在动物屠宰前的数小时注射使用的, 因此该类化合物

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相对其他的兽医用药可能对消费者造成的健康风险更大. 长期食用高残留的动物组织除会造成消费者如焦虑、头痛、食欲减退等精神症状外, 还会造成消费者对药物的依赖性. 因此各国对β-阻断剂类药物在动物饲养中的使用也都有明确的规定[7]. 欧盟的96/23/EC 指令[8]规定动物性食品中不得检出β-兴奋剂类药物残留; 我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中将克伦特罗及其盐、沙丁胺醇及其盐和酯、西马特罗及其盐和酯列为禁止使用的兽药, 并规定在动物性食品中不得检出[9].

目前用于测定β2-受体激动剂的方法较多, 多采用包括免疫亲和层析、固相萃取(SPE)以及固相基质萃取(MSPD)等方法进行净化, 通过色谱或色谱与质谱串联的手段进行检测[10~19], 但净化之前多采用β-葡萄糖醛酸酶或其他方式进行酶解, 仅有少数报道采用酸解或碱性水解的方式使目标化合物解离[18,19]; 为了满足快速筛查的要求, 有关免疫分析法(ELISA 、RIA)也有报道, Elliott CT 等人采用酶联免疫法(ELISA)对莱克多巴胺进行了检测[20], 沈建忠等人采用时间分辨荧光免疫分析法 (TR-FIA) 对猪组织中的莱克多巴胺进行检测, 检测限可以达到0.1 μg/kg [21], 但免疫分析方法的单一性, 不适应多残留的检测. 对β-阻断剂的检测方法的报道较少, 主要对环境中的β-阻断剂进行检测, M. Dolores Hernando [22]以LC-MS 测定了污水及地表水中的11个β-阻断剂; Hing-Biu Lee [23]采用基质固相萃取技术测定了废水中的12个β-阻断剂和β2-受体激动剂. 有关动物性食品中的β-阻断剂的测定还未见报道. 本文的目的是建立一种高灵敏、快速的对多种β2-受体激动剂和β-阻断剂类药物进行同时测定的分析方法, 以满足对市场动物性食品中β-兴奋剂类药物监管的要求.

2 实验部分

2.1 试剂及标准溶液

甲醇、乙酸乙酯(色谱纯, J.T.Baker 公司), 甲酸(纯度为99%, Ameisensaeure 公司), 高氯酸(优级纯, 北京化工厂)、三氯乙酸(优级纯, 北京化学试剂公司)、氢氧化钠(优级纯, 北京化学试剂公司)、浓氨水(优级纯, 天津市东方化工厂); 实验用水均为超纯水,

电阻率为18.2 MQ·cm (Millipore 公司超纯水器制备). β2-受体激动剂标准品：溴布特罗(brombuterol- HCl, 纯度>99%), 克伦异磅特罗(clenisopenterol- HCl, 纯度>99%)、克伦赛罗(clencyclohexerol hy- drochloride, 纯度>99.5%)、(clenhexerol, 纯度>99%)、塞布特罗(cimbuterol, 纯度>99%)、马贲特罗(mapenterol hydrochloride, 纯度>99%)购自WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH, 德国; 马布特罗(mabuterol, 纯度>99.1%)、塞曼特罗(cimaterol, , 纯度>99.5%)购自Boehringer Ingekheim. 沙美特罗(salmeterol, 纯度>98%)购自Toronto Research Chemical Inc., 美国; 克伦普罗(clenproperol, 纯度>99%)、克伦磅特罗(clenpenterol, 纯度>99%)购自EU Reference Laboratory, 德国; 异丙喘宁(metaproterenol, 纯度>99.9%)、特布他林(terbutaline, 纯度>98%)、沙丁胺醇(salbutamol, 纯度>98%)、丙卡特罗(procaterol, 纯度>99%)、非诺特罗(fenoterol, 纯度>98%)、克仑特罗(clenbuterol, 纯度>95%)、莱克多巴胺(ractopamine, 纯度>95.6%)、

妥布特罗(tulobuterol, 纯度>98%)、福莫特罗(formoterol fumarate, 纯度>98%)、班布特罗(bambuterol hydrochloride, 纯度>98%)、利托君(ritodrine hydrochloride, 纯度>99%)购自Sigma 公司.

β-阻断剂标准品：美托洛尔(metoprolol, 纯度>98%)、拉贝洛尔(labetalol hydrochloride, 纯度>98%)、普萘洛尔(propranolol hydrochloride, 纯度>98%)、倍他洛尔(betaxolol, 纯度>98%)、喷布洛尔(penbutolol sulfate, 纯度>98%)购自Sigma 公司, 美国.

氘代同位素标准品：D 7-Cimaterol 、D 6-Salbuta- mol 、D 9-Cimbuterol 、D 7-Clenproperol 、D 5-Ractopa- mine 、D 9-Mabuterol 、D 11-Mapenterol 、D 6-Clenbuterol 购自EU Reference Laboratory, 德国; D 3-Salmeterol 购自Cambridge Isotope Laboratories Inc, 美国.

β2-受体激动剂及β-阻断剂标准溶液储备液的配制：精确称取标准品各约0.0100 g, 分别用甲醇溶解并定容至10 mL, 浓度为1000 mg/L, 于?18℃冰箱中保存. 需要时将各标准储备液制成浓度为10 mg/L 的混合标准工作液, 使用时用甲醇稀释成1 mg/L 的混合标准使用液, 使用后置于?18℃冰箱中保存. 氘代

同位素标准品, 直接用 1 mL 甲醇溶解, 除D 3-

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Salmeterol(1000 mg/L)外制成10 mg/L 的标准溶液, 使用时用甲醇制成1 mg/L 的内标混合使用液, 使用后置于?18℃冰箱中保存.

2.2 仪器与设备

高效液相色谱-线性离子阱质谱仪(LTQ, Thermo- fisher 公司, 美国), 离心机(Sigma3K-15型, Sigma 公司, 美国), Oasis MCX 固相萃取柱(6 mL, 150 mg, waters 公司, 美国), N2-浓缩仪(N-EVAP, analytical evaporator Associates INC., 美国).

2.3 提取

精确称取匀浆后的肌肉样品约5.0 g, 加入5%的三氯乙酸溶液10 mL, 涡旋混匀, 置于80℃水浴中加热超声提取30 min, 以10000 r/min 0℃离心10 min, 吸取上清液于25 mL 试管中. 沉淀用5%的三氯乙酸溶液5 mL 再提取一次, 再以10000 r/min 0℃离心10 min. 合并提取液, 待进行净化处理.

2.4 净化

Waters Oasis MCX 柱(6 mL,150 mg)依次用6 mL 甲醇、6 mL 水活化后, 将提取液上MCX 柱, 弃去流出液, 依次用2 mL 0.1 mol/L 的高氯酸溶液、1 mL 甲醇淋洗, 用6 mL 含5%浓氨水的甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 将洗脱液置于N2-浓缩仪上浓缩至近干, 用1 mL 甲醇-0.1%甲酸水溶液 (10︰90, V ︰V

)充分溶解

残渣, 将此溶液过0.22 μm 的有机滤膜待进行LC-MS 测定.

2.5 基质匹配的标准工作曲线的制备

准确吸取1 mg/L 的混合标准使用液, 用初始流动相配比复溶的空白基质溶液制成5、10、20、40、80、160和200 μg/L 的标准系列溶液. 空白基质溶液的制备：称取与试样基质相应的阴性样品5.0 g, 与试样同时进行提取、净化和复溶得到.

2.6 仪器条件 2.6.1 液相色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis ? T3柱, 150 mm×2.1 mm, 3 μm; 流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱, 参考梯度洗脱条件见表1, 流速：250 μL/min, 柱温：30, ℃

表1 液相色谱参考梯度条件

时间(min) 0.1%甲酸水溶液(%)

甲醇(%)

0 90 10

45 30 70

46 5 95

47 10 90

55 90 10

进样量：10 μL.

2.6.2 质谱参考条件

离子化模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+); 质谱扫描方式：选择离子监测(SRM), 喷雾电压：4 kV; 鞘气流速：35 arb, 辅助气流速：15 arb, 毛细管温度：325℃, 毛细管电压：50 V. 线性离子阱参数: 全扫描目标离子数10000.0; 选择离子监测目标离子数5000.0; 多级质谱目标离子数 (MSn) 5000.0; 精确扫描目标离子数3000.0. 其余质谱参数见表2.

3 结果与讨论

3.1 样品提取

有些β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物在动物组织中会以硫酸轭合物或葡萄糖醛酸轭合物等形式存在, 因此样品要先进行水解, 使待测物游离或从组织中释放已进行后续的提取. 尤其是沙丁胺醇、异丙喘宁等苯酚型药物的轭合物比例较高, 必须经水解后进行提取和净化. 常用的水解方法主要有酶水解[15]、酸水解[18]和碱水解[19]. 本研究采用酸解方式, 一方面三氯乙酸可以起到水解轭合物的作用, 另一方面三氯乙酸具有较强的蛋白沉淀能力, 减少了酶水解中酶制剂本身及其水解后的样品中产生的蛋白类物质对目标化合物的干扰. 样品提取液的 pH 值在3.6~ 4.0之间, 可以直接上经活化后的Waters Oasis MCX 固相萃取柱进行净化.

3.2 净化

动物源性样品基质较为复杂, 存在着对目标化合物的严重干扰, 本方法采用三氯乙酸提取, 并结合低温高速离心的方式对蛋白物质进行沉淀, 应用固相萃取的方式进行净化. β2-受体激动剂是含氮激素

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表2 β2-受体激动剂及β-阻断剂质谱采集参数a)

化合物保留时间(min) 母离子(m /z )

对应内标

Segment 定量离子(m /z )

定性离子(m /z ) 碰撞能量(%)扫描范围(m /z )

Metaproterenol 3.15 212 D7-Cimaterol 1 194 152 27 149~215 D7-Cimaterol 5.03 227

2 209

? 19 206~230 Cimaterol 5.14 220 D7-Cimaterol 2, 3 202

26 199~223

Terbutaline 6.13 226 D6-Salbutamol 3 152 170,208 26 149~230 D6-Salbutamol 6.22 246

3 228 167,148 18 165~250

Salbutamol 6.46 240 D6-Salbutamol 3 222 166 20 163~243 D9-Cimbuterol 9.71 243

4 225

161 18 155~250 Cimbuterol

9.87 234 D9-Cimbuterol 4 216

160

21 155~240

Procaterol 12.14 291 D9-Cimbuterol 5 273 232,216 21 213~295 Fenoterol 12.46 304 D9-Cimbuterol 5 286 135,107 24 105~308 Ritodrine 13.09 288 D7-Clenproperol 5 270 150 21 145~292 Clencyclohexerol 13.46 319 D7-Clenproperol 5 301 ? 20 298~323 D7-Clenproperol 15.28

270

252

? 17 248~273 Clenproperol 15.42 263 D7-Clenproperol 6 245 ? 22 242~266 D6-Clenbuterol 19.43 283 7 265 204 16 201~286 Clenbuterol 19.60 277 D6-Clenbuterol 7 259 203 22 75~280 D5-Ractopamine 18.99 307 7 289 167 18 165~310 Ractopamine 19.02 302 D5-Ractopamine 7 284 164 21 160~305 Bromchlorbuterol 21.20

323 D5-Ractopamine

305

249

246~326

Metoprolol 21.45 268 D5-Ractopamine

8 191 116 34 113~271

Tulobuterol 22.15 228 D9-Mabuterol 8 154 172 28 150~231 Formoterol 21.94 345 D9-Mabuterol 8 327 149 22 145~350 Brombuterol 22.72 367 D9-Mabuterol 8 349 293 18 290~370 D9-Mabuterol 23.13 320

8, 9 302

238

15 235~325

Clenpenterol 23.29 291 D9-Mabuterol 8, 9 273 203 21 200~295 Mabuterol 24.17 311 D9-Mabuterol 9 293 237 20 235~315 Bambuterol

26.61 368 D11-Mapenterol 10 312

294 20 290~371 Clenisopenterol 27.07 291 D11-Mapenterol 10 273 ?

21 270~295 D11-Mapenterol 27.46 336 10 318

238

17 235~340

Mapenterol 27.73 325 D11-Mapenterol 10, 11307 237 19 235~330 Labetalol 28.00 329 D11-Mapenterol 11 311

207

19 205~333

Propranolol

29.83 260 D11-Mapenterol

11 183 116,157 31 113~265 Betaxolol 31.66 308 D11-Mapenterol 11, 12116 177,231 31 113~311 Clenhexerol 33.38 305 D11-Mapenterol 12 287

17 284~310 Penbutolol

41.31 292 D3-Salmeterol 13 236

201 25 197~295 D3-Salmeterol 41.71 419 13 401

383 19 380~422 Salmeterol

41.76 416 D3-Salmeterol 13 398

380

18 375~420

a) 碰撞能量(%)为归一化能量; ?表示母离子被施予能量打碎后只有一个碎片离子. 分离窗口宽度为2(m /z ), Q 值为0.25

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中的苯乙胺类药物, 均具有苯乙醇胺结构的母核, 按照苯环上取代基不同, 常将其分为苯胺型和苯酚型, 由于含有氨基或酚羟基, 故通常具有极性, 但由于取代基的不同, 极性差异较大, 如结构中具有芳伯氨基, 则多表现为中等极性. 而Waters Oasis MCX 固相萃取柱是具有混合型阳离子交换反相吸附剂的固相萃取柱, 考虑到β2-受体激动剂具有的苯乙醇胺母核及取代基, 在偏酸性情况下对β2-受体激动剂以及β-阻断剂类化合物多能与H +结合形成阳离子, 被MCX 柱的填料吸附, 从而具有高的选择性和灵敏度[14], 起到较好的净化效果.

3.3 质谱参数的优化

通过流动注射200 μg/L 的以甲醇?0.1%甲酸水溶液(50︰50, V /V )为溶剂的单标标准, 并同时开启液相色谱流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液(50︰50, V /V

流速为250 μL/min, 对碰撞能量及质谱参数如喷雾电压, 毛细管电压、毛细管温度、鞘气及辅助气流速等参数进行了优化, 具体优化结果见2.6.2节的质谱参参数. 经过优化后, 选择离子监测(SRM)模式下, 23 种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂均得到了较高的响应值.

表2 β2-受体激动剂及β-阻断剂质谱采集参数表中Cimaterol 、Clencyclohexerol 、Clenproperol 、Clenisopenterol 、Clenhexerol 的二级质谱碎片均只有一个, 分别为202、301、245、273和287. Shao 等[15]采用waters 公司的三重四极杆质谱测定了猪肝、猪肾及猪肉中的16种β2-受体激动剂, 其中Cimaterol 的质谱碎片离子为159.7和142.7、Clencyclohexerol 的质谱碎片离子为300.9和202.8、Clenproperol 的质谱碎片离子为245和203、Clenisopenterol 的质谱碎片离子为273.0和216.9. 由于离子阱质谱与四级杆质谱的工作原理不同, 对液质联用方法来说常会发生裂解碎片不同的情况, 但本实验中只有一个二级碎片离子不能满足质谱确证的要求. 在今后的实验工作中可以增加二级质谱的碰撞能量或发挥离子阱质谱的优势做三级质谱扫描来解决此问题.

3.4 线性方程、检出限及定量限

为了更好的降低基质效应的干扰, 本研究采用

了基质匹配的标准溶液进行线性实验. 按照2.5配制基质匹配的系列标准系列溶液并注入液质联用仪进行分析, 记录各化合物的色谱峰面积(A )和内标的色谱峰面积(A i ), 以A 和A i 的比值(氘代同位素内标除对应各自的化合物外, 其他化合物按色谱保留时间顺序以相近的氘代同位素化合物为内标)对相应的标准溶液中化合物的浓度进行线性回归计算, 得出线性方程、线性范围和相关系数(r ), 结果见表 3. 由结果可见, 在5~200 μg/L 范围内, 各物质均取得良好线性相关, 相关系数(r )大于0.995. 浓度为80 μg/L 的基质匹配标准溶液的选择离子监测(SRM)的总离子流图见图1, 各化合物的定量离子提取色谱图见图2.

采用空白基质加标的方式, 以信噪比(S /N )为3的含量定为方法的检出限(LOD), 以信噪比(S /N )为10的含量定为方法的定量限(LOQ), 23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的检出限及定量限结果列于表 3中.

3.5 加标回收实验结果

加标回收试验采用空白猪肉样品进行试验, 加标水平分别为5、10和20 μg/kg. 测定结果列于表4中, 加标水平为 5 μg/kg 时, 各化合物的回收率在47.3%~111.5%之间, RSD 在7.2%~23.5%之间; 加标水平为10 μg /k g 时, 各化合物的回收率在47.3%~123.7%之间, RSD 在4.8%~25.7%之间; 加标水平为20 μg /k g 时, 各化合物的回收率在52.2%~117.7%之间, RSD 在3.2%~23.0%之间. β2-受体激动剂分为苯胺型和苯酚型, 由于含有氨基或酚羟基通常具有极性, 但由于取代基的不同, 极性差异较大. 且本方法同时检测28种化合物, 加上9个氘代同位素内标, 共有37个化合物, 从梯度洗脱的液相色谱的保留时间上从3 min 开始出峰到42 min 第37个化合物沙美特罗出峰, 也可以看出各化合物的极性差异, 因此可能在MCX 柱上的保留量和洗脱量会因极性差异而有所不同. 多次试验我们都发现在色谱上最后一个出峰的沙美特罗回收率均较低, 由于沙美特罗取代基类型为水杨醇型, 极性较弱不易与H +结合形成阳离子, 故在MCX 柱上保留较差. 另外加标水平较低为5 μg/kg 时, 受基质效应的影响有些化合物的回收率也较低, 但平行测定结果之间的精

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表3 线性方程、相关系数及检出限和定量限

化合物线性方程相关系数(r ) 检出限(LOD, μg/kg)

定量限(LOQ, μg/kg)

Metaproterenol Y = 0.0736x + 0.0736 0.9995

0.10

0.25

Cimaterol Y = 0.0237x + 0.6583 0.9958 0.20 0.50 Terbutaline Y = 0.0869x + 0.0854 0.9971 0.20

0.90

Salbutamol Y = 0.0756x ? 0.0092 0.9972 0.05 0.20 Cimbuterol Y = 0.0311x + 0.0100 0.9997 0.20 0.50 Procaterol Y = 0.0508x + 0.0843 0.9957 0.20 1.00 Fenoterol Y = 0.0276x + 0.0048 0.9992 0.20 1.00 Ritodrine

Y = 0.1259x + 0.1179 0.9980 0.15 0.50 Clencyclohexerol Y = 0.0364x + 1.3427 0.9964 0.10 0.20 Clenproperol Y = 0.0379x + 0.0203 0.9992 0.20 1.00 Ractopamine Y = 0.0606x + 0.0253 0.9996 0.20 0.50 Clenbuterol

Y = 0.0367x + 0.0388 0.9970 0.20

0.50

Bromchlorbuterol Y = 0.0316x ? 0.0057 0.9966 0.20 1.00 Metoprolol Y = 0.0249x + 0.0248 0.9991 0.10 0.25 Formoterol Y = 0.0695x + 0.0563 0.9966 0.20

1.00

Tulobuterol Y = 0.0576x ? 0.0002 0.9993 0.10 0.20 Brombuterol Y = 0.0393x + 0.0412 0.9982 0.20 1.00 Mabuterol Y = 0.0993x + 0.0831 0.9994 0.20 0.50 Clenpenterol Y = 0.0455x + 0.0697 0.9965 0.20 1.00 Bambuterol Y = 0.0826x + 0.1578 0.9981 0.10 0.20 Clenisopenterol Y = 0.0457x + 0.0834 0.9953 0.20 1.00 Mapenterol Y = 0.0417x + 0.0246 0.9991 0.20 1.00 Labetalol Y = 0.0633x + 0.1315 0.9961 0.20 1.00 Propranolol Y = 0.0307x + 0.0643 0.9964 0.10 0.20 Betaxolol Y = 0.0245x + 0.0486 0.9975 0.10 0.20 Clenhexerol Y = 0.0487x + 0.0912 0.9980 0.20 1.00 Penbutolol Y = 0.1649x + 0.3397 0.9969 0.20 0.50 Salmeterol

Y = 0.1117x + 0.0671

0.9958

0.20

1.00

图1 基质匹配的混合标准溶液(80 μg/L)的SRM 总离子流图

1. Metaproterenol;

2. Cimaterol;

3. D 7-Cimaterol;

4. Terbutaline;

5. Salbutamol;

6. D 6-Salbutamol;

7. Cimbuterol;

8. D 9-Cimbuterol;

9. Procaterol;

10. Fenoterol; 11. Ritodrine; 12. Clencyclohexerol; 13. Clenproperol; 14. D 7-Clenproperol; 15. Ractopamine; 16. D 5-Ractopamine; 17. Clen-buterol; 18. D 6-Clenbuterol; 19. Bromchlorbuterol; 20. Metoprolol; 21. Tulobuterol; 22. Formoterol; 23. Brombuterol; 24. Mabuterol; 25. D 9-Mabuterol; 26. Clenpenterol; 27. Bambuterol; 28. Clenisopenterol; 29. Mapenterol; 30. D 11-Mapenterol; 31. Labetalol; 32. Propranolol; 33. Betaxolol; 34. Clenhexerol; 35. Penbutolol; 36. Salmeterol; 37. D 3-Salmeterol.

吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留

780

图2基质匹配的混合标准溶液( 8 0μg / L )的S R M 定量离子提取色谱图

中国科学 B 辑: 化学 2009年第39卷第8期

781

表4 β2-受体激动剂及β-阻断剂在猪肉样品中的加标回收实验结果

加标水平(5 μg/kg)

加标水平(10 μg/kg) 加标水平(20 μg/kg)

化合物

平均回收率(%, n =6)

RSD(%)

平均回收率(%, n =6)

RSD(%)

平均回收率(%, n =6)

RSD(%)

Metaproterenol 101.3 9.2 70.9 5.3 109.4 7.0

Cimaterol 88.6 7.5 91.8 14.6 85.8 13.7

Terbutaline 62.3 18.1 95.8 19.1 117.7 3.2

Salbutamol 68.0 9.2 107.5 7.7 87.4 4.7

Cimbuterol 57.0 8.5 58.2 21.5 93.7 6.0

Procaterol 111.5 20.3 102.6 8.2 101.7 10.9

Fenoterol 69.8 17.3 79.3 11.3 103.5 16.0 Ritodrine 104.9 9.7 86.3 11.8 100.2 14.1

Clencyclohexerol 70.3 12.1 117.8 7.3 112.5 18.7

Clenproperol 56.2 11.8 70.9 9.9 81.2 17.2

Ractopamine 77.5 14.4 70.5 13.9 86.4 3.9 Clenbuterol 105.8 7.2 85.5 9.8 85.4 6.1

Bromchlorbuterol 98.9 17.3 77.7 5.3 88.0 13.3

Metoprolol 84.5 7.8 123.7 6.0 99.4 14.2

Tulobuterol 51.6 11.3 56.7 11.7 62.3 14.7

Formoterol 73.1 11.0 82.8 15.2 84.7 9.6

Brombuterol 47.3 8.0 67.3 10.4 79.1 5.0

Mabuterol 51.5 17.8 105.4 8.8 100.4 7.1

Clenpenterol 53.9 11.0 69.7 8.7 76.2 9.5 Bambuterol 59.6 8.8 118.6 4.8 99.2 9.9

Clenisopenterol 51.8 22.4 59.4 14.4 66.5 15.2

Mapenterol 47.9 8.5 121.6 6.0 98.4 7.7

Labetalol 54.6 9.3 83.3 10.0 76.2 7.7

Propranolol 50.5 12.0 81.0 8.6 71.5 7.7

Betaxolol 52.0 9.9 122.8 5.5 101.8 6.0

Clenhexerol 50.0 20.3 57.2 25.7 59.6 23.0

Penbutolol 50.2 14.1 69.0 11.4 66.9 6.3

Salmeterol 47.4 23.5 47.3 22.1 52.2 7.7

密度良好. 加标回收实验结果表明本方法的精密度和准确度基本良好, 除个别物质外, 基本符合欧盟2002/657/EC [24]对残留检测方法的规定.

3.6 实际样品分析

利用建立的检测方法, 采集北京地区不同区域、不同市场的猪肉及鸡肉样品进行检测, 只有一例鸡肉样品同时检出克伦特罗(clenbuterol)与莱克多巴胺(ractopamine), 含量分别为2.31和2.17 μg/kg, 未检出其他β2-受体激动剂及β-阻断剂. 其SRM 定量离子提

取的色谱图见图 3. 检出率虽然较低, 但暴露出新的问题, 饲料中添加的β2-受体激动剂类药物已由单一添加改为多种药物同时添加, 饲料中单一药物剂量减少, 导致畜禽体内单一药物的蓄积量减少, 而蓄积动物体内的β-兴奋剂类药物种类增多, 造成引起食物中毒的情况并未得到有效缓解, 不同药物的协同毒性可能更甚于单一药物. 因此, 本文建立的灵敏度高, 多组分同时检测的方法, 能够更好的应用于市场动物性食品中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留的监管.

吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留

782

图3 鸡肉样品的SRM定量离子提取色谱图

4结论

随着克伦特罗与莱克多巴胺在国内外的禁用和监控的加强, 利益的驱使将促进不法分子将其他β2-受体激动剂, 如沙丁胺醇、西玛特洛、溴布特罗等非法添加与动物饲养和饮水中. 除单组分残留测定外, 多组分残留测定方法的建立是β2-受体激动剂残留分析的重要发展方向. 本文建立了HPLC-MS同时检测肌肉中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的分析方法. 该方法简便快速, 可以同时检测23种β2-受体激动剂和5种β-阻断剂药物残留, 具有较高的灵敏度高, 最低检出限均可以达到0.2 μg/kg, 实际样品在 5 μg/kg的加标水平下基本能达到较好的回收率, 更适用于动物性食品中β-兴奋剂的多残留分析检测, 能够更好的应用于市场动物性食品中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留的监管.

致谢本工作得到国家自然科学重点基金(批准号：20837003)和“十一·五”国家科技支撑计划(编号：2006BAK02A27, 2006BAK01A02-5)项目资助, 特此一并致谢.

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L221

783

吴永宁等: 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留

Determination of 23 β2-agonists and 5 β-blockers in animal muscle by High Performance Liquid Chromatography-linear ion trap mass spectrometry

WU YongNing1,2, MIAO Hong1, FAN Sai1,2 & ZHAO YunFeng1,2

1. Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Centre for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China;

2. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China

Abstract: A delicate method has been developed for the simultaneous determination of 23 β2-agonists and 5 β-blockers illegal drugs in muscle tissues by high performance liquid chromatography-linear ion trap mass spec-trometry using isotope dilution technique. The muscle samples are acid hydrolyzed and extracted with 5% tri-chloracetic acid in water, and then cleaned up using MCX solid phase extraction (SPE) cartridge. Methanol and 0.1% formic acid are used as mobile phases for gradient elution, a Waters Atlantis?T3 column is used for separation, and ESI positive ion scan mode is used with selective reaction monitor(SRM). 9 β2-agonists labeled by the deuterium isotope were used as internal standards for quantification. The linear ranges of 23 β2-agonists and 5 β-blockers are 5~200 μg/L, the coefficient of correlation is not less than 0.995, and the limit of detection for each compound in the muscle tissue is below 0.2 μg/kg. The recoveries of each compound in the spiked samples at three levels 5, 10, 20 μg/kg are in the range of 47.3%~123.7%, and the relative standard deviations are in the range of 3.2%~25.7%. The developed method is sensitive and specific for the determination of β2-agonists and β-blockers in pork and chicken muscle samples.

Keywords: β2-agonists, β-blockers, muscle, determination, HPLC-ITMS

784

离子阱质谱

= 安捷伦 G6300 系列LC/MSD Trap 现场培训教材质谱数据系统毛细管电泳液相色谱气相色谱

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G6300A 系列离子阱软件概述以及开机关机操作仪器硬件概述 1.1典型配置 1.2仪器原理简介 1.2.1离子阱的主体包含一个环电极和两个端电极，环电极和端电极都是绕Z轴旋转的双曲面，并满足r20=2Z20（ r0为环形电极的最小半径，Z0为两个端电极间的最短距离）。射频电压V rf加在环电极上，两个端电极都处于零电位。 1.2.2与四极杆分析器类似，离子在离子阱内的运动遵循马修方程，也有类似四极杆分析器的稳定图。在稳定区内的离子，轨道振幅保持一定大小，可以长时间留在阱内，不稳定区的离子振幅很快增长，撞击到电极而消失。离子阱的操作只有射频RF电压，没有直流DC电压，因此离子阱的操作只对应于稳定图上的X轴。对于一定质量的离子，在一定V rf下，不同质量数的离子按照m/z由小到大在稳定图的X轴上

自右向左排列。当射频电压从小到大扫描时，排在稳定图上的离子自左向右移动，振幅逐渐加大，依次到达稳定图右边界，从离子阱中抛出，经过高能打拿极然后由电子倍增器检测。 1.3仪器硬件概述 1.3.1离子源 1.3.2离子源原理 1.3.3仪器构造-示意图

离子阱质谱和四极杆质谱的原理

离子阱质谱和四极杆质谱的原理分析质荷比的原理四极杆（Quadrupole）：由四根带有直流电压（DC）和叠加的射频电压（RF）的准确平行杆构成，相对的一对电极是等电位的，两对电极之间电位相反。当一组质荷比不同的离子进入由DC和RF组成的电场时，只有满足特定条件的离子作稳定振荡通过四极杆，到达监测器而被检测。通过扫描RF场可以获得质谱图。四极杆成本低，价格便宜，虽然目前日常分析的质荷比的范围只能达到3000，但由于分析器内部可容许较高压力，很适合在大气压条件下产生离子的ESI离子化方式，并且，ESI电离最突出特点是产生多电荷，蛋白质和其他生物分子电喷雾电离所产生的电荷分布一般在3000以下，所以四极杆广泛地与ESI联用。另外，三重四极杆由于可以做多级质谱，定量也方便，使用极为广泛。离子阱（Ion trap）：由一对环形电极（ring electrod）和两个呈双曲面形的端盖电极（end cap electrode）组成。在环形电极上加射频电压或再加直流电压，上下两个端盖电极接地。逐渐增大射频电压的最高值，离子进入不稳定区，由端盖极上的小孔排出。因此，当射频电压的最高值逐渐增高时，质荷比从小到大的离子逐次排除并被记录而获得质谱图。离子阱质谱可以很方便地进行多级质谱分析，对于物质结构的鉴定非常有用。我们单位就用的ESI-四极杆分析多肽，请问三重四极杆原理又是什么？说来比较复杂，我有相关的文献，需要的话我可以发信给你。有本英文的书"Practical aspects of ion trap mass spectrometry" Thomas Cairns主编的，很详细，可以到国家图书馆借到。简单得说，离子阱能囚禁的离子质量与所用射频的频率的平方成反比，与其幅度成反比。通常是固定频率，从小到大扫描幅度，其囚禁的离子以质量从小到大的次序就出来了。简单得说，离子阱能囚禁的离子质量与所用射频的频率的平方成反比，与其幅度成反比。通常是固定频率，从小到大扫描幅度，其囚禁的离子以质量从小到大的次序就出来了。 ---------------------------------------------------------------- 还有点我不明白：就是SI M scan或MS/MS模式isolating ions时m/z大于要监测的离子的是怎么被eject的？还有Endcap上的tailored RF wav ef orm和resonance eject RF都是什么样的电压，怎么作用的？ “还有点我不明白：就是SIM scan或MS/MS模式isolating ions时m/z大于要监测的离子的是怎么被eject的？” 我来试试看解释一下这个问题其实加载到四级杆上的DC和RF电压使得四级杆内产生一个变化的电场，而变化的电场又产生变化的磁场（电磁感应现象）。带点离子通过的时候，其实就是切割磁力线的匀速运动。在选定的m/z下，这个能量场只允许某一个或某一范围内的m/z离子通过。更大的m/z离子因为场给予的能量不足将逐渐减速而从四级杆空隙跑出。更小的m/z离子因场能大于其自身能量，而加速飞离四级杆。故而最后达到检测器的仅是你选定的m/z离子

分散固相萃取-离子阱质谱法(QuEChERS-GCMSMS)

分散固相萃取-离子阱质谱法（QuEChERS-GCMSMS ）分析中药中的农药多残留 Application Notes_C_GCMS-31 吕建霞余翀天赛默飞世尔科技（中国）有限公司引言中药为我国的传统中医特有药物，为我国的民族文化瑰宝。据统计，我国用于饮片和中成药的药材有1000-1200余种，其中约有20%的中药材来自人工栽培[1]。随着人工栽培过程中农药的使用，使得中药材极可能受到农药的污染，中药材中农药残留的存在直接危害着人类的健康。《中国药典（2015版）》[2]中提供了多种农药残留的同时检测方法，采用分散固相萃取的前处理方法，气相色谱串联质谱法的检测手段进行检测。本文依据此方法建立了分散固相萃取-气相色谱串联质谱法对中药中60种有机氯、有机磷及拟除虫菊酯农药残留同时检测，结果表明该方法灵敏度好，回收率高，线性范围好。仪器 Trace1310-ITQ 气相色谱离子阱质谱仪，配EI 源（Thermo Scientific ）；AS1310 自动进样器（Thermo Scientific ）均质器、离心机、天平、漩涡混合器、氮吹仪（Thermo Scientific ）耗材色谱柱：TG-5MS （30 m ×0.25 mm ×0.25 μm ）（Thermo Scientific ）QuEChERS 产品：萃取管，50 mL 含6.0 g 无水硫酸镁和1.5g 醋酸钠（PN ：60105-210）；净化管，15 mL 含900 mg 无水硫酸镁、150 mgPSA 、150 mgC18（PN ：60105-227）（Thermo Scientific ）关键词分散固相萃取；离子阱质谱；TG-5 sil 色谱柱；中药；农药残留目标建立高效的气相色谱串联质谱检测方法，灵敏、快速的测定中药中的多种农药残留；样品中的农药经分散固相萃取净化，离子阱质谱采用二级质谱模式检测，灵敏度高试剂与标准品农药标准溶液购自国家标准物质中心，浓度100 mg/L 。乙腈：色谱级。冰醋酸。 0.1%醋酸-乙腈溶液：加10 mL 冰酯酸到990 mL 的乙腈。标准溶液的制备单一农药标准溶液各取适量，用正己烷稀释定容，得浓度为1 mg/L 的混合标准溶液。样品前处理取试样可食用部分，粉碎并混合均匀，准确称取3 g （精确至0.01 g ），加入10 mL 水浸泡，转移到QuEChERS 萃取管中，加入15 mL0.1%冰醋酸/乙腈溶液，均质提取2 min 。以10000 r/min 离心10 min 。准确吸取10 mL 提取液于离心管中，N 2吹干，用2.0 mL 乙腈涡混溶解残渣。将上述溶液转移到净化管中，涡混2 min ，5000 r/min 离心3 min 。用一次性注射器取上清液，过0.45 μm 滤膜，供气相色谱-质谱测定。

质谱离子阱

离子阱的基本原理：离子阱的发展历史：最早是三维离子阱，它模拟了理想的四极场，但其内表面是双曲面的，加工非常困难。慢慢有人做了简化，比如柱形离子阱(有商用的仪器)，这还是三维离子阱。后来发展的线性离子阱是在四极杆轴向上加一个直流，比如商用的LTQ 。但LTQ 这样的线性阱里面的结构也是双曲面的，加工也非常困难，要求精度很高。线性离子阱经过简化后，可以变成矩形离子阱，加工比较简单，加工成本也不高，我国国内也可以加工。当然，所有离子阱的核心都是从双曲面的离子阱来的，所以先介绍一下传统的双曲面三维离子阱。它由一个环形电极和上下两个端盖电极组成，加上前端的离子源入射和检测器。它的内表面是双曲面的，加工很困难。离子阱能够储存(捕获)离子，根据马修方程，当离子在r 径向和 z 轴向两个方向都稳定时，离子就能够被离子阱稳定地捕获。根据离子稳定图，当离子在两个方向都稳定时就被捕获了，通常利用的是第一稳定区(如图)。当离子处于稳定位置时，根据马修方程中a 和q 的关系式，a 和q 同离子的质荷比m/z 、所加射频场的频率、场半径、射频电压、直流电压有关。商用仪器通常不加直流(即a=0)，离子在一条线上运行，如图所示，质量数越小，越靠近右侧。当扫描射频电压时，每个离子的q 逐渐由小变大，直到离子脱离稳定区，跑出离子阱，即可被检测。、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标等，要求技术交底。管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。对于调试过程中高中资料试卷技术问题，作为调试人员，需要在事前掌握图纸资料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料，并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。、电气设备调试高中资料试卷技术电力保护装置调试技术，电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时，需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全，并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围，或者对某些异常高中资料试卷工况进行自动处理，尤其要避免错误高中资料试卷保护装置动作，并且拒绝动作，来避免不必要高中资料试卷突然停机。因此，电力高中资料试卷保护装置调试技术，要求电力保护装置做到准确灵活。对于差动保护装置高中资料试卷调试技术是指发电机一变压器组在发生内部故障时，需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。

线性离子阱单向出射的方法研究

线性离子阱单向出射的方法研究质谱仪是一种具有高灵敏度、低检测限、定性和定量准确的现代分析仪器。它通过电场或磁场将离子化后的被测物质按质荷比(m/z)的不同进行空间、时间或频谱上的分离,从而得到质谱图,并对其分析后可获得被检测物质的化学成分、结构以及含量等信息。目前,质谱仪已广泛应用于食品安全、环境检测、医学诊断、蛋白组学、基因组学研究和航天、军事技术等领域。在众多种类的质谱仪中,离子阱质谱仪由于其具有结构简单、体积小和工作气压低等优势,是小型化质谱仪的最佳选择。然而传统的三维离子阱的高精度双曲面电极结构对加工和组装的要求过于严苛,同时其也受限于自身低离子储存容量和离子捕获效率。为了克服这些弱点和使得离子阱更加适用于小型化、廉价化的质谱仪,近年来多种简化结构的线性离子阱(二维离子阱)已经被开发出来。其中最为典型的是,Cooks等开发的矩形离子阱(Rectilinear Ion Trap),它采用了二维的电极结构,并采用了平板电极取代了传统线性离子阱中的双曲面电极。但与传统线性离子阱的双曲面电极相比,平板电极不可避免地会向离子阱内引入有害的高阶场成分,降低其分析性能。对此,Jiang等发明了印刷电路板(PCB)分压离子阱质量分析器(以下简称PCB分压离子阱)。这种新型线性离子阱上的电极被绝缘材料(peek)分成了不同的区域。可以通过调节不同区域的面积比以及各区域上所加射频(RadioFrequency,RF)电压比来优化离子阱内的电场,从而显著地改善其分析性能。本实验室也自主研发了一种分析性能较优的新型简化结构的线性离子阱:半

圆柱电极线性离子阱(Linear Ion Trap featuring Half round rod electrodes,HreLIT)。 HreLIT 采用半圆面的电极结构,因此相较于双曲面电极结构,其加工难度有所降低,加工精度也有所提高;同时,与平板电极结构的离子阱相比,其分析性能进一步地提高。然而,在现有的线性离子阱结构和工作方式下,离子在共振出射时沿着两个相反的方向出射(即双向离子出射),且沿着每个方向出射的概率为50%。因此,在商业化的台式线性离子阱质谱仪中在两个出射方向上各设置了一个离子检测器,用于同时检测两个方向上出射的离子。但是,这种离子检测方式不适用于小型化质谱仪中,因为这将大幅增加质谱仪的体积和功耗,检测电路也将成倍增加,同时也提高了制造成本。因此,现有已报道的所有简化结构的线性离子阱质谱仪中,均只使用了一个离子检测器进行离子检测,该检测方式的理论最高离子检测效率仅为50%,实际上的离子检测效率必然小于该数值,这严重影响小型化离子阱质谱仪的最终检测的灵敏度和动态检测范围。为解决小型化线性离子阱质谱仪的离子检测效率问题,本文提出了两种基于线性离子阱实现离子单向出射的方法:构建非对称几何结构的线性离子阱和配置非对称的射频电压。该方法可以向离子阱内引入奇次阶场成分,从而使得离子阱内射频电场的场中心发生偏移,进而使得束缚在场中心的离子距离其中一端的离子出射槽更近, 最终诱导了离子的单向出射。理想情况下,该方法可以在仅使用一个离子检测器和不损失质量分辨率的条件下成倍地提高离子的检测效率。因此,这一方法不仅可以提高质谱仪的灵敏度这一关键性能指标,也有利于离子阱质谱仪的小型化。本研究课题正是基于这样的方法和考虑,以分析性能较

离子阱质谱仪使用流程

液质联用离子阱质谱仪使用流程 1. 使用质谱须知在使用质谱仪前请确认并检查以下条件： ● 仪器已经正确安装并且经过厂商工程师的检测； ● 质谱仪属于精密贵重仪器，未经专门培训人员不得擅自开启使用，更不得随意“调校”氮气和氦气压力或更改仪器参数等； ● 检查液氮罐和氦气钢瓶是否有一定压力，以便为测试样品提供符合流速和压力要求的氮气（喷雾气体和干燥气体）和氦气（碰撞气体）； ● 常规ESI源已安装完毕 ● 样品溶液必须澄清透明，不含有固体微粒，不得将粗提物直接用于测定，以免堵塞喷雾针或者污染毛细管。测试用的液相溶剂体系不得含有不挥发性的酸、碱、盐。 2. 测样前仪器准备 2.1 启动trapcontrol软件 2.1.1. 单击桌面图标或者通过程序目录启动trapcontrol软件； Start – Programs – Bruker Daltonics – esquireControl 软件可能要求输入操作人员的姓名。

2.1.2. 选择软件中质谱仪处于操作状态 2.1. 3. 调用方法: Method -> Open -> DEFAULT.ms 3. 测样方式——直接进样测定部分对于标准品或相对较纯或混合组分较少并且不含盐的药物样品，如果仅需要进行鉴定，可以采用直接进样方法测定。 3.1 样品用标准溶剂（50%H2O，50%乙腈或甲醇，0.1%甲酸）溶解或稀

释 3.2 将配好的样品或标准品吸入进样器（针），将进样器（针）放置于进样泵中。注意：进样器（针）内不能有气泡 3.3 将进样器（针）直接与离子源连接（如图）注意毛细管与注射器之间需紧密连接。进样器内不能有气泡 3.4 设置进样泵的流速为120～180微升/小时 3.5 参数调节，初学者建议采用Tune -> Smart 模式，调节下图蓝色标识部分。 A 雾化气、干燥气流量和温度，建议以下列值为基准调节： Nebulizer 5 psi – 15 psi Dry Gas 5 l/min Dry Temp 300 °C B 设置正负离子模式，或者正负离子交替模式。

离子阱

离子阱离子阱并不是一个很新颖的装置，早在50年代末它就被应用于改进光谱测量的精确度。设法提高光谱精确度是每个从事原子光谱研究的科学家所追求的「圣杯」，有人曾这么比喻：如果哪一天上帝允诺帮每个人实现一个愿望，十个原子光谱学家中，大概有九个都会希望上帝做同一件事──以他伟大的神力把一个原子或分子一动也不动地固定在空间中某一点，好让这些科学家把光谱线量到无比精确。这当然只是一个梦想，一个在真实世界中永远无法实现的愿望。由于测不准原理的作祟，DE不可能无限小，所以谱线不可能量到无限准。但是如果我们能使Dt够大，DE还是可以很小，换言之，想要量到更精准的谱线，测量时间必须拉长，因此必须设法局限住待测物体。于是离子阱因应而生，它的原理十分简单：利用电荷与电磁场间的交互作用力来牵制带电粒子的运动，以达到将其局限在某个小范围内的目的。离子阱，又称离子陷阱，是一种利用电场或磁场将离子（即带电原子或分子）俘获和囚禁在一定范围内的装置，离子的囚禁在真空中实现，离子与装置表面不接触，应用最多的离子阱有“保罗阱”（四

极离子阱，沃尔夫冈·保罗）和“Penning阱”。离子阱可以应用于实现量子计算机，量子计算机以粒子的量子力学状态，如原子的自旋方向等表示0和1，称为“量子比特”，离子阱利用电极产生电场，将经过超冷处理的离子囚禁在电场里，实现量子比特。离子阱(Ion trap)，由一对环形电极(ring electrod)和两个呈双曲面形的端盖电极(end cap electrode)组成。在环形电极上加射频电压或再加直流电压，上下两个端盖电极接地。逐渐增大射频电压的最高值，离子进入不稳定区，由端盖极上的小孔排出。因此，当射频电压的最高值逐渐增高时，质荷比从小到大的离子逐次排除并被记录而获得质谱图。离子阱质谱可以很方便地进行多级质谱分析，对于物质结构的鉴定非常有用。这种由一对环电极和两个双曲面端电极形成的离子阱称为三维离子阱，离子聚焦的位置是在中心的一个点上，具有比较大的空间电荷效应，常规的三维离子阱的离子存储数目为几千个。为了避免空间电荷效应和简化电极结构，后来人们使用四级杆的

2、高效液相色谱_电喷雾_离子阱质谱法快速推定硫酸奈替米星中有关物质的结构

高效液相色谱电喷雾离子阱质谱法快速推定硫酸奈替米星中有关物质的结构袁耀佐1,张玫1,钱文1,谭力1,赵恂1,周晓华1,张正行2(1 江苏省食品药品检验所,南京210008;2 中国药科大学药物分析教研室,南京210009) 摘要:目的应用高效液相色谱电喷雾离子阱质谱(H PLC ESI I T M S n)法及TFA fi x技术,快速鉴定硫酸奈替米星样品中有关物质的结构。方法 A g il ent SB C 18 (4 6mm 150mm,3 5 m)色谱柱,水三氟乙酸甲醇(84115)为流动相,流速0 5mL!m i n-1;离子肼质谱仪正离子检测,柱后分流(32)进样,电喷雾离子源,离子源温度350?,雾化室压力275 8kP a,干燥气流速9L!m i n-1,采用T FA fix技术,即在柱后添加丙酸异丙醇(2080)溶液,改善流动相中三氟乙酸对电喷雾离子化的抑制作用;对有标准品的有关物质,其结构通过与对照品的色谱质谱行为来确定;对无对照品的有关物质,主要以奈替米星和西索米星质谱行为为模板,根据它们多级质谱信息来推定。结果硫酸奈替米星原料中检出9个有关物质,推定出其中7个物质的结构,分别为西索米星、去甲基西索米星、1 N 乙基加洛糖胺、5 O 乙基奈替米星、2# N 乙基奈替米星、3? N 乙基奈替米星、3 N 丙基依替米星,解析了另两物质的部分结构。结论建立的方法可以用于硫酸奈替米星原料中有关物质结构的快速推定,为奈替米星质量控制和工艺优化研究提供了可靠快速的分析手段。关键词:硫酸奈替米星;有关物质;结构推定;高效液相色谱电喷雾离子阱质谱法中图分类号:R917 文献标志码:A 文章编号:1001-2494(2010)18-1428-06 R api d Character izati o n of t he Re l a ted Substances i n N etil m ic i n Sulf ate Sa m ple by HPLC ESI I T M S n YUAN Yao zuo1,Z HANG M e i1,Q I A N W en1,TAN L i1,Z HHAO Xun1,Z HOU X iao hua1,Z HANG Zheng x i n g2 (1 J iangsu Instit u te for D rug Control,N anjing210008,Ch i na;2 D epart m ent of Pharmaceutical A nal y sis,Chi na Phar m aceutical Uni versit y,N anjing210009,China) ABSTRACT:O BJECT I VE T o character ize rap i d l y t he re l a ted substances i n ne til m i c i nsu lfate samp l e by a H PLC ESI I T M S n m eth od w it h a TFA fi x techno logy M ETHODS T he m ethod was carried out usi ng an ag ilent SB C 18 (4 6mm 150mm,3 5 m)co l u mn and a m obil e phase containi ng a m i x ture o fw ater,tr ifluo roacetic ac i d and m ethano l(84115)at a fl ow rate of0 5mL!m i n-1 Two fifth o f the colu mn e l uentw as sent i nto t he M S fo r peak charac teriza tion by sp litti ng mode T he i den tificati on o f related substances i n the ne til m i c i nsulfa te bulk sa m ple was perfo r m ed w ith a i on trap m ass spec trom eter,w it h an electrospray ionization(ES I)source i n the positive i on m ode,t he te m pera t ure o f ES I i on source is350?,nebulizi ng pressure i s275 8kPa,and dry gas flow is9L!m i n-1, a so l u tion co taini ng prop i onic ac i d and i sopropano l(8020)w as i nfused i nto t he eluent through a T p i ece to decrease t he M S si gnal suppressi on of tr ifluo roacetic acid R elated substanes wh i ch the i r reference substances can be obta i ned were identifi ed by co m pa ri ng the i r chrom atog raph ic andM S behav iors w ith those o f correspond i ng re f e rence substances,the o t her unknow n related substances were deduced usi ng the collision i nduced disso ciati on(C I D)spectra o f as temp l a tes RESULTS A t o ta l o f n i ne compounds were were character ized i n comm ercial sa m ples,a m ong wh i ch seven i m pur ities w ere identifi ed,t hey are si so m i c i n,de N me t hy l siso m ici n,1 N ethy lgara m i ne,5 O e t hy l netil m ic i n,2# N ethy l netil m icin,3? N ethy l netil m ici n and3 N propy l eti m icin,respecti ve l y,and t he oth er t wo com pounds w ere deduced parti a lly,too CONCLUSI ON The estab lished me t hod is su itab le for the rap i d i dentifica ti on o f re l a ted substances i n netil m ic i nsulfate sa m ples and qua lity control KEY W ORDS:ne til m i c i n su lfate;related substances;character i zati on;H PLC ESI I T M S n 奈替米星(netil m icin)是在西索米星(siso m icin)的1位氨基上引入一个乙基的半合成氨基糖苷类抗生素,二者抗菌谱相似,但奈替米星对氨基糖苷乙酰转移酶稳定,且耳肾毒性低于其他同类产品[1],临床应用均为其硫酸盐。美国药典32版(USP32)、英国药典2009(BP2009)、日本药局方15版(JP% &)、?中国药典(2005年版(Ch P2005)等药典中均对有关物质进行了控制[2 5]。王建等[6]曾建立作者简介:袁耀佐,男,博士,副主任药师研究方向:抗生素质量研究 T e:l(025)86631609 E m ai:l yu anyaozuo@yahoo co m c n

羟基多环芳烃的电喷雾电离离子阱串联质谱检测

Vol.34高等学校化学学报No.82013年8月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1840~1844 doi:10.7503/cjcu20130427羟基多环芳烃的电喷雾电离离子阱串联质谱检测李　雪1,2,方小伟2,李银萍1,陈焕文2 (1.上海大学环境与化学工程学院,环境污染与健康研究所,上海200444;2.东华理工大学江西省质谱科学与仪器重点实验室,南昌330013)摘要　采用电喷雾电离离子阱串联质谱检测了1?/2?羟基萘二2?羟基芴二2?/3?/4?/9?羟基菲二6?羟基屈和3?羟基苯并[a]芘等9种不同环数的羟基多环芳烃(OH?PAHs,2~5环),考察了碰撞诱导解离操作参数活化值Q 和相对碰撞能量对羟基多环芳烃各单体碎片离子产率的影响.通过优化活化值Q 和相对碰撞能量,得到了3?羟基苯并[a]芘的碎片离子,提高了1?羟基萘二2?羟基芴二3?/9?羟基菲和6?羟基屈碎片离子的产率,并发现活化值Q 是电喷雾电离离子阱串联质谱检测不同环数PAHs 的关键参数. 关键词　多环芳烃;生物标志物;羟基多环芳烃;离子阱串联质谱;碰撞诱导解离中图分类号　O657 文献标志码　A 收稿日期:2013?05?07. 基金项目:国家自然科学基金(批准号:21107066)二国家重大科学仪器设备开发专项(批准号:2011YQ170067)二上海高校青年教师培养资助计划和上海大学创新基金资助. 联系人简介:李　雪,女,博士,助理研究员,主要从事新兴有机污染物分析方法及其健康风险评价研究. E?mail:zlpamylee@https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html, 陈焕文,男,博士,教授,博士生导师,主要从事有机质谱分析和仪器研究.E?mail:chw8868@https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html, 多环芳烃(PAHs)是备受关注的致癌性环境有机污染物[1].PAHs 可以在职业环境(如炼焦厂等)和日常生活(如烧烤二吸烟等)中通过呼吸二皮肤接触和饮食等方式进入人体,危害人体健康[2].羟基多环芳烃(OH?PAHs)是PAHs 在人体内的重要代谢产物,也是目前使用最广泛的PAHs 内暴露生物标志物[3,4],其在PAHs 暴露及其健康风险评价研究中具有重要意义[5].电喷雾电离串联质谱(ESI?MS 2)因具有选择性好二灵敏度高二检出限低及样品无需衍生化等特点,在现有的OH?PAHs 检测技术中优势显著[6,7].但在采用离子阱串联质谱(IT?MS 2)和三重四级杆串联质谱(Tri Q?MS 2)检测OH?PAHs 如2?羟基芴(2?OHFlu)和羟基苯并[a]芘(OH?BaPs)时,仍存在无法获得碎片离子或碎片离子产率低等情况[8~12],从而影响该方法的选择性和灵敏度.因此获取OH?PAHs 碎片离子是进行串联质谱分析的必要前提.与Tri Q?MS 相比,IT?MS 更适用于多级质谱分析.在进行IT?MS 2分析时,通过调节碰撞诱导解离(CID)的操作参数[活化值Q (AQ)和相对碰撞能量(NCE)]可以提高碎片离子的产率[13~16].其工作原理可概述为:在CID 过程中,AQ 与离子阱捕获母离子的能量有关,增大AQ 可增强系统施加于母离子的能量,进而提高后续过程的碎裂概率;NCE 与共振激发的电压相关,增大NCE 可增强共振激发电压,提高母离子的平动动能,增加母离子与阱中阻尼气体(氦气)的碰撞次数,从而提高母离子内能及产生碎片离子的产率. 本文系统考察了采用ESI?IT?MS 2检测9种不同环数OH?PAHs(2~5环)时,AQ 和NCE 对各单体碎片离子产率的影响.通过优化AQ 和NCE,获得了3?OHBaP 的碎片离子,提高了2?OHFlu, 1?OHNap,3?/9?OHPhe 和6?OHChr 碎片离子的产率,并发现AQ 是ESI?IT?MS 2检测不同环数OH?PAHs 的关键参数.1　实验部分 1.1　试剂与仪器1?/2?OHNap 和2?/3?/4?/9?OHPhe(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司);2?OHFlu(美国Sigma?Aldrich

高效液相色谱_线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中_2_受体激动剂及_阻断剂类药物残留

中国科学B辑:化学 2009年第39卷第8期: 774~784 https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html, https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html, 774 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS 高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中β2-受体激动剂及β-阻断剂类药物残留吴永宁①②*, 苗虹①*, 范赛①②, 赵云峰①② ①中国疾病预防控制中心营养与食品安全所, 北京100021; ②中国农业大学动物医学院, 北京100193 * 通讯作者, E-mail: wuyncdc@https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html,; miaohong0827@https://www.360docs.net/doc/7e16471351.html, 收稿日期：2009-04-26; 接受日期：2009-05-26 摘要利用高效液相色谱-线性离子阱质谱(HPLC-ITMS)以同位素稀释技术测定了肌肉组织中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂. 肌肉样品经5%的三氯乙酸溶液酸解提取, 以弱阳离子固相萃取柱进行净化. 以甲醇和含0.1%甲酸的水溶液为流动相在液相色谱柱上梯度洗脱分离, 采用ESI源正离子模式在选择离子监测(SRM)模式下进行扫描. 以9种经氘代同位素标记的β2-受体激动剂为内标进行定量. 猪肉中23种β2-受体激动剂及5种β-阻断剂的线性范围为5~200 μg/L, 相关系数(r)大于0.995, 各化合物在肌肉中的检出限均能达到0.2 μg/kg. 以空白猪肉样品进行的加标水平为5、10、20 μg/kg的加标回收试验, 各化合物的回收率在47.3%~123.7%之间, 相对标准偏差在3.2%~25.7%之间. 对猪肉样品和鸡肉样品进行了测定, 得到了满意的结果. 该方法灵敏度高, 定性准确, 可以用于畜禽肌肉中β2-受体激动剂和β-阻断剂类药物残留的确证检测. 关键词 β2-受体激动剂β-阻断剂肌肉检测 HPLC-ITMS 1引言 β2-受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物(phenthylamines, PEAs), 具有苯乙醇胺结构母核, 苯环上连接有碱性的β-羟胺侧链. 由侧链上取代基的差异, 划分为不同的药物. β2-受体激动剂在临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量, 可用于治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎等症状. 20世纪80年代初, 一系列的动物实验表明, 当用药剂量超过治疗剂量5倍时, 该类药物如克伦特罗、沙丁胺醇等可以起到促进动物生长, 提高瘦肉率的作用[1~3], 随之而来的被大量非法添加于饲料中, 以促进家畜生长及提高瘦肉率, 因而导致β2-受体激动剂在动物体内的蓄积, 进一步引起食物中毒的情况发生. 自1983年西班牙首次发生克伦特罗食物中毒事件以来, 20世纪90年代, 欧洲因克伦特罗污染引起食物中毒的时间超过500起[4,5], 我国自1998年香港出现克伦特罗中毒事件后亦多次发生, 伴随着国内外对克伦特罗监管的加强, 利益的驱使促使不法分子, 将其他β2-受体激动剂[6], 如沙丁胺醇、马布特罗、溴布特罗和莱克多巴胺等非法添加与动物饲料及饮水中. 因此, 建立β2-受体激动剂多组分残留的测定方法是非常重要的. β-阻断剂类药物则被广泛用于动物运输过程中防治由于动物应激而造成的突然死亡, 由于该类化合物往往是在动物屠宰前的数小时注射使用的, 因此该类化合物

质谱离子阱

离子阱是怎样被选择的、如何作SIM和MS/MS：当然稳定区是假想的状态，是通过理论模拟的反映离子运动的一种方式，离子在阱里处于各种各样的状态。当射频电压固定在某一个值时，每个不同m/z的离子在其中有一个振动频率ω，ω=1/2βΩ，其中Ω是射频的频率，而一台离子阱仪器的振动频率是固定的，所以离子的振动频率仅与β(beta)有关。β和q有个关系式，所以只要知道q的值，就可以知道离子的振动频率。在稳定图上可看到q从0到0.908(0.908是其稳定区的边界)，每一个q值对应的点，都有一个对应的离子振动频率;也就是说，离子的振动频率和离子的m/z没有关系，而只和q有关系。第10张幻灯片讲的是β的q的关系式，有3种估值方法：当q<0.4时，用Dehmelt法估值;当q从0.4到0.7/0.8

四极杆、离子阱、飞行质谱和各种离子源比较

四极杆、离子阱、飞行质谱和各种离子源比较单四极质量分极器Q由四根严格平行并与中心轴乖间隔的圆柱形或双曲面柱状电极构成正负两组电极，其上施加直流和射频电压，产生一动态电场子有全扫描和选择离子检测方式SIM，后者比前者灵敏度提高几个量级，但在不熟识测量物质的情况下，有可能造成误判三重四极杆QQQ是由三组四极杆串接起来，第一和第三组是质量分析器，第二组是活化室。如果第二个质量分析器不加电压，QQQ就可以作用Q使用。当然也在第一个质量分析器后加一个检测器。作为Q使用有子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫描和多反应选择扫描MRM，MRM扫描主要用于定量分析，比单极的SIM灵敏度更高。离子阱分析器它是由环行电极和上、下两个端盖电极构成的三维四极场。原理：将离子储存在阱里，然后改变电场按不同质荷比将离子推出阱外进行检测。离子阱有全扫描和选择离子扫描功能，同时利用离子储存技术，可以选择任一质量离子进行碰撞解离，实现二级或多级MSn分析功能。但离子阱的全扫描和选择离子扫描的灵敏度是相似的。广泛应用于蛋白质组学和药物代谢分析。飞行时间质谱TOF-MS，它与离子的飞行速度和质量相关，线性同轴的飞行时间质量分析器由一段无场的飞行管构成。离子束被高压加速以肪冲方式推出离子源进入飞行管，自由漂移到达检测器，由于分了质量不同，获得的加速度不同，质量小的离子比大的具有较高速度，离子选到达检测器。 TOF理论上不存在质量上限，因此在高分子量分析应用中重要性是无敌的，目前主要应用在生物质谱领域。扇形场质量分析器：在离子源中生成的离子被几千伏高压加速，以一定的的曲率半径通过电场、磁场，其运动轨道半径取决于离子的动量、质荷比、加速电压、磁场强度，不同质量离子在变化的电、磁场或加速电压下被分离。

高效液相色谱-线性离子阱质谱联用仪

高效液相色谱-线性离子阱质谱联用仪仪器名称：高液相色谱-线性离子阱质谱联用仪 High Liquid Chromatography & Linear Ion Trap Quadrupole （简称LTQ） Mass Spectrometer 仪器型号：HPLC1260 & LTQ XL 仪器缩写：LTQ 生产厂家：美国Agilent公司、美国Thermo-fisher公司安装日期：2015-7-15, 2008-4-17 标签：小分子定性、定量分析。药物杂质、天然产物结构鉴定仪器简介： LTQ XL增强型二维线性离子阱质谱仪，拥有无与伦比的灵敏度和超快的周期时间，可以保证在最短的时间内用最少的样品得到最多的质谱信息。LTQ XL 提供的高质量的谱图和先进数据分析软件包联合可以为复杂结构确证研究提供完整的解决方案。LTQ XL同时扩展了离子阱质谱的功能和操作性能，新功能包括：可升级的电子转移裂解(ETD)模块可以提供传统裂解方法无法得到的蛋白质翻译后修饰信息脉冲碰撞能量诱导解离(PQD)功能可以提供低质量端的碎片离子信息高选择MS/MS分析给谱图在数据库和谱库检索更好的匹配，提高了结构确证的可靠性

快速极性切换、母离子相关MS3数据关联扫描，可以对代谢物组成的鉴定进行智能、快速分析可以和高端的回旋共振质谱组合成最先进的多级高分辨杂交质谱仪 LTQ XL使用最新的Xcalibur操作平台，和Mass Frontier、MetWorks和BioWorks等专业应用软件配合，是药物杂质鉴定、代谢物结构鉴定、天然产物结构分析、药物筛选过程中的定量、法医和临床检验等尖端领域的最佳选择方案。二维液相色谱中心切割技术可对复杂组分进行分析。半制备液相色谱-质谱分析可制备少量化合物，并采用柱后分流技术质谱在线检测制备所得样品。主要配置： Agilent公司的液相系统和光电二极管阵列检测器 Thermo公司的LTQ XL线性离子阱质谱仪性能指标： m/z范围：50-2 000 Da ESI全扫描MS/MS灵敏度：250 fg利血平，信噪比>100:1 分辨率：FWHM=0.5 Da MSn：自动1～10级质谱质量稳定度：+/-0.1Da /8hours 定量动态线性范围：10e5～10e6 DAD扫描波长范围190-600nm 应用范围：复杂中药、天然产物定性、定量分析药物杂质分析代谢物鉴定和定量翻译后修饰（PTM）研究药物筛选过程中的定量、法医和临床检验半制备液相色谱-质谱分析二维液相色谱-质谱分析来样须知：样品为极性或弱极性（含有极性基团），分子量范围100~4000amu，能溶于水、乙腈、甲醇、乙醇固体或冻干粉样品，含主要成分0.1~1mg（须注明使用的溶剂：水、乙腈、甲醇、乙醇）。溶液样品50~1000uL，浓度100~1000ug/mL，（须注明浓度及溶剂）样品中不得含有磷酸盐、硫酸盐、盐酸盐等不挥发性盐类样品中不得含有表面活性剂类（或去污剂。解释：我们的仪器要保证灵敏度测试代谢样品）、强酸、强碱样品中不得含有乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、苯、环己烷、DMSO等有机试剂样品中不得含有蛋白质、多糖、脂类物质样品中不得含有增塑剂类物质（解释：我们的仪器要保证灵敏度测试代谢样品）包天测试的样品（代谢组学、药代等样品）可以为血样、尿样、细胞组织样、微生物培养液等，样品必须经过去除蛋白质、脂类和多糖的操作，然后用流动相

离子阱

离子阱由于可以存贮所有从离子源产生进入阱中的离子，因此灵敏度很高；另外，离子阱的特有功能是容易产生MS n，对分子的结构解析非常有用；离子阱质谱还非常容易用软件实现全自动控制，人机接口非常简单。三维离子阱质谱的分析器由一对环形电极和两个呈双曲面形的端盖电极组成（见图1）。在环形电极上加基础射频电压（Fundemental rf）和直流电压；在端盖电极上加交流补充电压。由离子源产生的离子，通过脉冲离子门进入离子阱，通过调节射频电压和直流电压，离子可以稳定地存贮在离子阱中。阱中离子的数目可通过自动增益控制（AGC）技术进行有效控制。阱中离子数目太多，会引起空间电荷效应，导致电场的扭曲和整体性能的下降。离子阱中一般充入1 mTorr的氦气，它有两个作用，一是碰撞“冷却”降低初进入离子的动能，有效地捕获注入的离子；二是作为碰撞气体，从而产生多级MS。一个离子是否可稳定地存贮在阱中，取决于离子的荷质比，离子阱的大小（r），fundamental rf的谐振频率（ω），和环电极上的电压幅度（V）。离子行为的依赖性被描述为多维参数q z q z＝4eV/mr2ω2公式

图2显示了阱中离子“稳定区域图”，一个给定质荷比的离子将有一个q z 值，若落在稳定区的边界内，离子就被稳定捕获。若q z值落在边界外，则该离子会撞在电极上湮灭。通过扫描射频电压值（即从低到高加射频电压值），可以使阱中离子的轨道依次变得不稳定，因此可从低m/z到高m/z依次将离子甩出阱外检测。对于高质量数m/z的离子，用扫描射频电压无法使离子轨道不稳定，这时在端盖电极上加高幅的交流电压，如果交流电压频率与离子振荡频率一致，将会产生共振，离子振荡的振幅随时间线性增加，当振幅足够大时，离子将甩出阱外。结合这两种方式还可分离出特定m/z的离子，比如扫描范围为50～1500 m/z，若想分离出m/z＝500的离子，则先扫描射频电压，使50～499 m/z被甩出阱；再依次改变交流电压频率，使501～1500 m/z被甩出阱，这样就分离出m/z＝500的离子。若在端盖电极上加低幅的交流电压信号，将使被分离出的离子产生共振激发，与氦气碰撞，产生结构碎片信息。以肽分析为例，这个过程将引起沿肽骨架的随机断裂，在质谱上获得丰富的氨基酸序列碎片。