蛋白质和氨基酸的测定

5.5蛋白质和氨基酸的测定

5.1 概述

（1）食品中的蛋白质含量及测定意义

（2）蛋白质系数

（3）蛋白质测定方法

5.2 凯氏定氮法

5.3氨基酸氮的测定

自学引导题

1、蛋白质系数是如何计算出来的？

2、蛋白质的测定方法有哪些？国家标准是哪一种方法？

3、为什么说用凯氏定氮法测出的是粗蛋白的含量？

蛋白质的测定意义

测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。

蛋白质系数

不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。

不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。

蛋白质含量测定最常用的方法

凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋白质用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。

凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。

此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定

凯氏定氮法：常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法

微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。

目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。

在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、

简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。

常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。

凯氏定氮法

(1) 原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

消化反应方程式如下：

2NH2(CH)2COOH ＋13H2SO4 ＝(NH4)2SO4 ＋6CO2 ＋12SO2 ＋16H2O

浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。

浓硫酸又具有氧化性,将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫

2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋2H2O ＋CO2

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3 ＝(NH4)2SO4

②蒸馏

在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：

2NaOH＋(NH4)2SO4＝2NH3＋Na2SO4 ＋2H2O

③吸收与滴定

加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方程式如下：

2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

(2)测定方法

①样品消化

：样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后，完全转入容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。

观察与思考：

1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？

2、消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么？

3、瓶颈有什么颜色的有毒烟产生？

4、如何判断消化的终点？

②蒸馏

按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

在接受瓶中加入10ml 40g/L 硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。

③ 滴定

取下接受瓶，以0.01000mol/L 盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。

(3) 结果计算

式中W —蛋白质的质量分数，%；

V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL ；

V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL ；

V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL ；

C —盐酸标准液的浓度，mol/L ；

0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol ；

F —蛋白质系数；

m —样品质量，g 。

(4)样品的分解条件

（1）K2SO4或Na2SO4 ：提高溶液的沸点

(2)催化剂 ：CuSO4

氧化汞和汞 良好的催化剂，但剧毒；

硒粉

（3）氧化剂 过氧化氢

硫酸钾的作用

加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO4

2KHSO4=K2SO4+H2O ↑+SO3

一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C 以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高。

但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4

2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O

硫酸铜的作用

① 催化剂 2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2

C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑

Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。

② 可以指示消化终点的到达

%100100014.0)(201?????-=V m F c V V W

③下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

注意事项

（1）所用试剂应用无氨蒸馏水配制。加指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性。

（2）若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大量泡沫应加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。

（3）若样品消化液不易澄清透明，可加入300g/L2~3ml 过氧化氢后再加热。

（5）硫酸铜起到催化作用，加速氧化分解。硫酸铜也是蒸馏时样品液碱化的指示剂，若所加碱量不足，分解液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量。

（6）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。

（7）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。一般消化至透明后继续30分钟即可.

（8）蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。

（9）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。

（10）混合指示剂在碱性溶液中呈兰绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。

氨基酸的一般定量测定

（一）甲醛滴定法

1.原理：氨基酸本身有碱性—NH2基，又有酸性—COOH 基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与—NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定—COOH 基。

2．特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）

3．双指示剂：

①36%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。

②0.1%百里酚酞乙醇溶液，

③0.1%中性红50%乙醇溶液，

④0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。

4．操作：同时取两份样：

①+ 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和

样液中其它酸性物质。

②+ 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了

样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总

和。二者之差可计算氨基酸含量

（二）电位滴定法

（三）茚三酮的比色法

原理：α-氨基酸与水合茚三酮共热，可生成蓝紫色化合物（与脯氨酸、羟脯氨酸反应为黄色），并释放CO2，其颜色的深浅及释放出ＣＯ２多少，均可用于氨基酸的定性和定量测定。

(四）紫外吸收

色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的最大吸收峰在280 nm 附近。

大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中氨基酸含量的快速简便的方法。

氨基酸的分离与测定

一．薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法）

简介：

近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。

（一）原理：

取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。

（二）优点：

①展开时间短，一般在20—30分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。

②层析后得到的斑点小而清晰。

③能够使用多种显色剂。

④点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10—100倍）精确到0.01ug。

⑤也可用于大量分离＞500 mg，作为样品制备层析。

?缺点：Rf值重现性比纸上层析差。

?分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。

（三）操作方法：

①薄层板制备

②样品液制备

③点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为

原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时

展开，点与点之间间隔1～2cm。

a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一个点干了再点另一个点。

④展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度10～30°，下

端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。

a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的2～3种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。

b.展开剂的选择方法：

Ⅰ.微量圆环法。

Ⅱ.用小载波片试验，微量展开剂展开5cm。

Ⅲ.图解法：

样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。

样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。

?有机溶剂极性由小到大为：

石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。

c.展开的方式：

上行法、下行法、双向展开、单向多次展开、双向多次展开。

⑤显色：

a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。

b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。

c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。

（涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中）