30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备汇编
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CN103163226 A
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申
CN 201110417088 请
号
公
2013年6月19日开
日
申
请
2011年12月14日日
期
优
2011年12月14日先
权
日
公开号201110417088.3, CN 103163226 A, CN 103163226A, CN 201110417088, CN-A-103163226, CN103163226
A, CN103163226A, CN201110417088, CN201110417088.3
发
明
者
刘丽宏, 李鹏飞, 李丹, 张绪得, 陶蓓蓓
申
请
人
刘丽宏, 李鹏飞, 李丹
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引
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BiBTeX, EndNote, RefMan
被以下专利引用(4), 分类(2), 法律事件(3)
外部链接: 中国国家知识产权局, 欧洲专利数据库 (Espacenet)
30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备
CN 103163226 A
摘要
本发明提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒及其制备方法。复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇衍生化处理，吹干复溶后，采用C18键合相硅胶为固定相，以含七氟丁酸和甲酸的乙腈水为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测。本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到10ng/ml，各项方法学指标均可满足氨基酸临床检验、工业生产和科学研究等定量需要。
权利要求(8)
1.一种高灵敏30种氨基酸同时定量检测试剂盒，其特征在于由特定浓度的稳定同位素内标样本、质控样本、衍生化试剂、流动相调节液组成。
2.根据权利I所述的30种氨基酸同时定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤:(1)稳定同位素内标冻干粉的制备；(2)质控样本的配制；(3)衍生化试剂的制备；(4)流动相调节液的配制。
3.—种30种氨基酸同时定量检测方法，包括: (1)浓缩储备液和日常工作液的配制: 取“稳定同位素内标冻干粉”用有机溶剂充分溶解，混匀，即为浓缩储备液，使用效期I个月；浓缩储备液用有机溶剂稀释适宜倍数，即为日常工作液，使用效期I周。(2)样本预处理: 取一定量的样本，加入日常工作液，涡流，高速离心取上清液，吹干或冻干或挥干，加入适量的衍生化试剂衍生化一定时间，吹干或冻干或挥干，加入复溶液复溶。(2)液相分离: a.采用C18、C8或氰基键和硅胶作固定相；b.流动相:甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸铵；甲酸铵；二乙胺?’三乙胺；等度或梯度洗脱；控制流速。(3)质谱测定:电喷雾离子源；大气压化学电离源；正离子方式。
4.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于同时定量检测30种氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、Y-氨基丁酸、丝胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、焦谷氨酸)中的一种或多种，包含且不限于此30种氨基酸。
5.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用乙腈、甲醇、三氯醋酸或高氯酸等蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀。
6.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用盐酸正丁醇进行衍生化处理。
7.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用稳定同位素内标进行定量检测。
8.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于其所使用的流动相为:甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸铵；甲酸铵；二乙胺；三乙胺；反相色谱等度或梯度分离。
说明
30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备
所属技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)开发的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，更具体地说是采用液相色谱-串联质谱技术对样本中30种氨基酸进行高灵敏度定量检测的方法。[0002] 本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。
背景技术
[0003] 氨基酸(Amino acid)是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。自然界中已发现的氨基酸有180多种，人体内重要的氨基酸有30多种。生命的产生、存在和消亡，无一不与蛋白质有关，而氨基酸正是蛋白质的基本单位，所以如果人体氨基酸发生变化，不在正常值范围
内，就会导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，最后导致疾病。目前氨基酸代谢障碍所引起的疾病已超过400多种，涉及代谢、肿瘤、免疫、心脑血管、神经系统、肾病、糖尿病、亚健康、老年病等各类疾病和人体生长发育、营养健康、肌肉骨骼生长、激素分泌、解毒功能等各个健康环节。
[0004] 氨基酸在医药上也有广泛应用。目前用作药物的氨基酸有一百几十种，其中包括构成蛋白质的氨基酸有20种和构成非蛋白质的氨基酸有100多种。因此，检测复杂样本中氣基酸的含量对临床检验、工业生广和科学研究等都具有重要意义。
[0005] 1958年Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后却三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，新的氨基酸分析方法不断涌现，柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法、毛细管电泳法、液相色谱法等相继应用于氨基酸分析。传统的氨基酸分析技术已很难满足极微量氨基酸的准确和高通量检测需求。
[0006] 液相色谱-串联质谱技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，样本在液相色谱质谱部分分别被分离及离子化，经检测器得到质谱图，具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点，日渐成为体内外定性和定量分析的实用方法。研究开发一种结果准确、严格区分同分异构体、分析通量高、价格低廉、操作简便、易于推广的30种氨基酸LC-MS/MS同时定量检测试剂盒，使其能广泛应用于
复杂样本中氨基酸临床、科研和工业生产，将有助于提高氨基酸检测质量、促进检测方法标准化和规范化。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，以满足临床检验、工业生产和科学研究等对氨基酸定量检则的需要。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。[0009] 技术方案
[0010] 本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定复杂样本中30种氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、Y-氨基丁酸、丝胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、焦谷氨酸)浓度的新型试剂盒。复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇为衍生化试剂进行处理，吹干复溶后上清液进行LC-MS/MS检测，记录氨基酸和内标的峰面积。根据氨基酸对应稳定同位素内标浓度、样本中的氨基酸/对应同位素内标峰面积比值即可计算出每种氨基酸的浓度。测定结果为复杂样本中氨基酸浓度。
[0011] 本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤:
[0012] 1.稳定同位素内标冻干粉:12种稳定同位素标记氨基酸对照品冻干粉(含2H4 ;5-13C-精氨酸、2H3-亮氨酸、2H3-甲硫氨酸、13C6-苯丙氨酸、2H3-天门冬氨酸、2H2-瓜氨酸、2H3-谷氨酸、2H8-缬氨酸、13C6-酪氨酸、2H4-丙氨酸、2H3-鸟氨酸均0.5pmoL ;含15N ；2-13C-甘氨酸2.5pmoL),贴签标记,完成操作。
[0013] 2.质控样本A的配制:精密称取IOmg精氨酸对照品，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成Img.mL—1的精氨酸储备液。精密量取精氨酸储备液871 μL，置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成17.42 μg.πιΓ1的精氨酸(lOOymol/L)质控样本，分装，贴签标记，完成操作。
[0014] 3.质控样本B的配制:精密称取IOmg苯丙氨酸对照品，置IOmL 容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成Img.mL—1的苯丙氨酸储备液。精密量取苯丙氨酸储备液413 μL,置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成8.26 μg *mL_1的苯丙氨酸(50 μmol/L)质控样本，分装，贴签标记，完成操作。
[0015] 4.衍生化试剂组分A:色谱纯正丁醇，分装，贴签标记，完成操作。[0016] 5.衍生化试剂组分B:12mol/L盐酸，分装，贴签标记，完成操作。
[0017] 6.流动相调节液A的配制:色谱纯甲酸，分装，贴签标记，完成操作。
[0018] 7.流动相调节液B的配制:色谱纯七氟丁酸，分装，贴签标记，完成操作。
[0019] 本发明的试剂盒使用方法如下:
[0020] 取10 μL样本置于1.5mL EP管中，加入日常工作液100 μL，13200r/min离心2min。将离心后的上清液直接转移到另一1.5mL EP 管中，氮气保护下50°C吹干，加入60 μL衍生化试剂，密封，涡旋30s，瞬时离心，65°C孵育15min进行衍生化。衍生后的溶液再次瞬时离心，在氮气保护下5011C吹干。加入100 μL复溶液复溶,润旋30s, 13200r/min离心2min,进样5 μL进行LC-MS/MS分析。[0021] 有益效果
[0022] 本发明试剂盒采用LC-MS/MS同时定量检测复杂样本中30种氨基酸的浓度，建立了一种高灵敏度(pmol级)和准确性的30种氨基酸LC-MS/MS定量方法，同分异构体基本都能基线分离，方法操作简单、快速、高通量，可用于临床检验、工业生产和科学研究中样本的检测。同时，本发明试剂盒首次实现多种氨基酸LC-MS/MS定量检测技术国产化，它的推广应用将有助于提氨基酸检测质量、促进检测方法标准化和规范化。
附图说明
[0023] 图1氨基酸样本处理和检测过程[0024] 图230种氨基酸总离子流图
[0025] 图3氨基酸同分异构体基线分离图
具体实施方式
[0026] 1、适用仪器
[0027] 液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，配备电喷雾离子源(ESI)。[0028] 2、样本要求
[0029] 血浆样本:采集静脉全血样本，置于抗凝管中，采血后立即颠倒混匀5?6次，于30min以内离心分离血浆，_20°C冰冻保存待测。[0030] 尿样、脑脊液:取样后直接-20°C冰冻保存待测。
[0031] 组织样本:生物组织或研磨或匀浆处理并用有机溶剂充分提取后，高速离心取上清液，用提取试剂稀释到合适的浓度，-20°C冰冻保存待测。
[0032] 其它需测定游离氨基酸的样本:充分溶解或浸泡后，用甲醇水(I: lv/v)充分提取，高速离心取上清液，用提取试剂稀释到合适的浓度，-20°C冰冻保存待测。
[0033] 其它需测定全部氨基酸的样本:称取一定量样本，加入适量的盐酸^mol/L)，密封，110°C高温水解24h，水解完自然冷却后，取出水解液过0.45 μm水系滤膜。所得滤液取一定量在50°C下氮气吹干，用甲醇水(I: lv/v)复溶并稀释到合适的浓度，-20°C冰冻保存待测。[0034] 3、检验前准备
[0035] 浓缩储备液的配制:取“稳定同位素内标冻干粉”用2mL甲醇充分溶解，混匀，即为浓缩储备液，分装，密封4°C保存待用，使用效期I个月。
[0036]日常工作液的配制:取浓缩储备液，甲醇稀释100倍，分装，密封4°C保存待用，使用效期I周。
[0037] 衍生化试剂的配制(盐酸正丁醇):衍生化试剂组分A-衍生化试剂组分B (95: 5v/v)，混匀，密封4°C保存待用。
[0038] 复溶液的配制:乙腈-水(4: lv/v)，混匀，密封4°C保存待用。[0039] 4、检验方法
[0040] 全血样本前处理:
[0041] 取10μL样本置于1.5mL EP管中，加入日常工作液100 μL，13200r/min离心2min。将离心后的上清液直接转移到另一1.5mL EP管中，氮气保护下50°C吹干，加入60 μL衍生化试剂，密封，涡旋
30s，瞬时离心，65°C孵育15min进行衍生化。衍生后的溶液再次瞬时离心，在氮气保护下5(TC吹干。加入100 μL复溶液复溶,润旋30s, 13200r/min离心2min,进样5 μL进行LC-MS/MS分析。
[0042] 质谱条件:
[0043] 离子源:电喷雾离子源(ESI)，正离子方式检测；离子喷射电
压:5500V;温度:5800C ;源内气体I (GSl，N2)压力:55ps1.;气体2(GS2，N2)压力:60ps1.;气帘气体(N2)压力:20ps1.;扫描方式为多重反应监测(MRM);碰撞气(N2)压力=Medium ;解簇电压(DP)为:35V ;碰撞能量(CE)为:30eV ;30种氨基酸用于定量分析的离子对见表I,同位素标记的氨基酸内标及用于定量分析的离子对见表2。[0044] 表130种氨基酸及用于定量分析的离子对
[0045]
[0046] 色谱条件:
[0047]色谱柱:C18 柱(150 X 4.6mm，5 μm 粒径);
[0048] 流动相:含0.1 %流动相调节液A和0.01 %流动相调节液B的乙腈-含0.1 %流动相调节液A和0.01 %流动相调节液B的水溶液，梯度洗脱；
[0049]柱温:50°C ;进样量:5 μL0
[0050] 测定法:
[0051] 取处理好的质控样本和待测样本溶液各5μL注入液质联用仪，记录色谱图。
[0052] 质控要求:
[0053] 每I分析批样本随行2个质控样本(质控样本A和质控样本B)。质控样本测定结果偏差应小于20%。如质控样本测定结果不符合上述要求，则该分析批样本测试结果作废，重新检测。
[0054] 表2氨基酸内标及用于定量分析的离子对
[0055]
[0058] 5、结果计算:
[0059]回收率的计算:计算质控样本A 和质控样本B 对应的精氨酸和苯丙氨酸的浓度。质控样本回收率的计算公式为:回收率(％)=测定浓度/标示浓度X100，回收率(％)应在100±20%范围内。
[0060] 样本结果计算:提取30种氨基酸对应的样本和内标的MRM 离子流图，进行积分处理。每5μ L 进样中，含有12.5pmol 从日常工作液中带入的精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸同位素内标衍生物，62.5pmol 甘氨酸同位素内标衍生物，没有同位素内标的18种氨基酸采用色谱峰比较邻近的同位素来进行定量，以校正系数K(特定校正系数，与使用的内标有关和加入体积有关)进行校准。
[0061] 氨基酸浓度=样本氨基酸峰面积X 内标氨基酸浓度XK/内标氨基酸峰面积
被以下专利引用
引用专利 申请日期 公开日 申请人 专利名 CN103940936B * 2014年1月20日 2015年7月1日 天津市敬业精细化工有限公司 一种4α-羟基-L-脯氨酸及其中痕量L-脯氨酸的检测方法 CN104181251A * 2014年9月1日 2014年12月3日 湖北新生源生物工程股份有限公司
一种hplc 检测胱氨酸中酪氨酸含量的方法 CN104198643A * 2014年9月21日 2014年12月10日 上海海洋大学 一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的方法 CN104215707A * 2014年92014年12福建中医药大栝楼桂枝汤的质量检测
引用专利申请日期公开日申请人专利名
月2日月17日学方法
* 由审查员引用
分类
国际分类号G01N30/02, G01N27/62
法律事件
日期代
码
事件
说
明
2013年6月
19日
C06 Publication
2013年7月
24日
C10 Request of examination as to substance
2015年2月18日C02
Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
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氨基酸测定方法
4.1 光度分析法[5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 4.1.1试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc －HAc 缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取1.020 g β-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L 标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取0.5g 茚三酮溶于100ml 蒸馏水中，得到5g/L 的茚三酮水溶液。 4.1.2标准曲线的确定 分别准确移取0.30ml 、0.40ml 、0.50ml 、0.60ml 、0.70ml 、0.80ml 、0.90ml 、1.00ml 标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml 再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 4.1.3样品的测定 稀释待测液于0.24mg/ml —0.73mg/ml,调pH 值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 4.1.4 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml —0.73mg/ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1： 0.20.30.40.50.60.70.80.9 1.0 1.1 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 吸光度加入标液体积(ml) B 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热10min ，β-氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH=6.00 4.1.5样品的测定分析 将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的
利用串联质谱鉴定氨基酸突变的生物信息学算法_余庆
中国科学: 生命科学 2014年 第44卷 第11期: 1113 ~ 1124 SCIENTIA SINICA Vitae https://www.360docs.net/doc/9414548553.html, https://www.360docs.net/doc/9414548553.html, 引用格式: 余庆, 吴松锋, 马洁, 等. 利用串联质谱鉴定氨基酸突变的生物信息学算法. 中国科学: 生命科学, 2014, 44: 1113–1124 Yu Q, Wu S F, Ma J, et al. Bioinformatics algorithms for identification of amino acid mutations in tandem mass spectrometry. SCIENTIA SINICA Vitae, 2014, 44: 1113–1124, doi: 10.1360/N052014-00099 《中国科学》杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 评 述 利用串联质谱鉴定氨基酸突变的生物信息学算法 余庆 ①② , 吴松锋 ②③ , 马洁 ②③ , 朱云平 ②③* , 舒坤贤① * ① 重庆邮电大学生物信息学研究所, 重庆 400065; ② 北京蛋白质组研究中心, 蛋白质组学国家重点实验室, 北京 102206; ③ 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京 100850 * 联系人, E-mail: zhuyunping@https://www.360docs.net/doc/9414548553.html,; shukx@https://www.360docs.net/doc/9414548553.html, 收稿日期: 2014-03-05; 接受日期: 2014-04-22; 网络版发表日期: 2014-09-17 国家自然科学基金(批准号: 21105121, 21275160)、国家高技术研究发展计划(批准号: 2012AA020409, 2012AA020201)和北京市自然科学基金(批准号: 5122013)资助项目 doi: 10.1360/N052014-00099 摘要 氨基酸突变能够改变蛋白的结构和功能, 影响生物体的生命过程. 基于串联质谱的鸟枪法蛋白质组学是目前大规模研究蛋白质组学的主要方法, 但是现有的质谱数据鉴定流程为了提高鉴定结果的灵敏度往往会有意压缩数据库中的氨基酸突变信息. 因此, 如何挖掘数据中的氨基酸突变信息成为当前质谱数据鉴定的一个重要部分. 当前应用于氨基酸突变鉴定的串联质谱鉴定方法大致可以分为3大类: 基于序列数据库搜索的方法、基于序列标签搜索的算法以及基于图谱库搜索的算法. 本文首先详细介绍了这3种氨基酸突变鉴定算法, 并分析了各种方法的特点和不足, 然后介绍了氨基酸突变鉴定的研究现状和发展方向. 随着基于串联质谱的蛋白质组学的不断发展, 蛋白序列中的氨基酸突变信息将被更好地解析出来, 从而得以深入探讨由氨基酸突变引起的蛋白结构和功能改变, 为揭示氨基酸突变的生物学意义奠定基础. 关键词 氨基酸突变 串联质谱 鸟枪法蛋白质组学 氨基酸突变鉴定 单核苷酸变异(single nucleotide variations, SNVs)是由DNA 序列上单个碱基变异产生的, 包括碱基的缺失、插入、转换及颠换等. SNVs 是基因组序列变异的主要形式[1], 同时也是生物体生理和病理变异的遗传基础[2]. 从遗传学的角度看, SNVs 既可以存在于具有遗传性的生殖细胞中, 也可以存在于不具有遗传性的体细胞中. 其中, 只有位于基因编码区的SNVs 能够影响蛋白的编码. 位于编码区的SNVs 可以分为3类: (ⅰ) 同义SNVs, 不改变相应的氨基酸种类; (ⅱ) 无义SNVs, 突变成为终止密码子, 提早 结束编码; (ⅲ) 非同义SNVs(nonsynonymous SNVs, nsSNVs), 改变氨基酸的种类. nsSNVs 能够改变蛋白的结构、功能、表达以及亚细胞定位等[3], 进而对多种遗传性的特征、疾病以及癌症等产生影响[4~9], 如人类耳垢的类型[6]、腋窝的气味[7]、癌症与肿瘤的发生[8]、阿尔茨海默病[9]以及镰刀形红细胞贫血症[10]等. 因此, 对SNVs 展开研究可以揭示出基因与表型多样性和基因与疾病间的关系, 并且有可能研发出治疗疾病的新方法. 目前, 全基因组关联研究(genome- wide association studies, GWAS)[11]虽然在基因变异与
氨基酸测定
食物中氨基酸的测定方法 测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。 一、氨基酸自动分析仪法 1.原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。 2.适用范围 GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。 本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定 3.仪器和设备 3.1真空泵 3.2恒温干燥箱 3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。用去离子水冲洗干净并烘干。 3.4真空干燥器（温度可调节） 3.5氨基酸自动分析仪。 4.试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 4.1浓盐酸：优级纯 4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。 4.3苯酚：需重蒸馏。 4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L 4.5缓冲液： 4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2 4.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。 4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 4.6茚三酮溶液 4.6.1 pH 5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.2。 4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1）50ml
PITC法氨基酸的测定
氨基酸的测定（） 检验标准：□ GB/T 5009.124-2003 □其他 检验日期：年月日温度：℃湿度： % 仪器名称和编号：电子天平（编号：） 高效液相色谱仪（编号：） 氨基酸对照品溶液和供试品溶液的配制： 正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸 mg，加0.02mol/L盐酸溶液100ml溶解。（每1ml 相当于 1.0 mg） 对照品溶液：取氨基酸贮备溶液（含各种氨基酸μmol/ml，公司、批号） 0.6 ml，加色氨酸对照品溶液〔取色氨酸（中检所，批号）mg置50ml量瓶中，加0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀〕 0.2 ml，加正亮氨酸内标溶液加 0.1 ml，再加 0.1 ml0.02 mol/L盐酸溶液, 混匀，得对照品溶液。 供试品溶液：取本品，按下述方法试验：□方法1 □方法2。取样量（单位：□g□ml） □方法1：置顶空瓶中，加入6mol/L盐酸溶液 ml，抽真空或充氮气，封管，放入110℃烘箱中，水解24小时，冷却，打开封口，将水解液转移到 ml量瓶中，用水洗涤顶空瓶，合并洗涤液至量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 ml，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用0.02 mol/L盐酸溶液溶解并定容至 ml。 □方法2：置 ml量瓶中，再加正亮氨酸内标溶液 ml，用0.02 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。 溶液配制： （1）三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4ml，加乙腈（色谱纯）8.6ml，混匀（1mol/L三乙胺乙腈溶液）。 （2）异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯25μl，加乙腈（色谱纯）2ml，混匀（0.1mmol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液）。 氨基酸对照品溶液和供试品溶液的衍生：
氨基酸含量测定
茚三酮比色测定氨基酸含量 一、实验原理 氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。 二、实验试剂 （1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2?H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。 （2）pH 8.04磷酸缓冲液： Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。 Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。 Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。 （3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。 三、实验方法及步骤 （1）标准曲线绘制 准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为
基于液相色谱鄄串联质谱的氨基酸代谢组学方法
DOI :10.3724/SP.J.1096.2013.20743 基于液相色谱?串联质谱的氨基酸代谢组学方法 研究黄芪注射液治疗脑缺血 吴宏伟1 高健2 李韶菁1 唐力英1 许海玉1 唐仕欢1 杨洪军*1 1 (中国中医科学院中药研究所,北京100700) 2 (河北医科大学药学院,石家庄071002) 摘 要 建立了基于液相色谱?串联质谱技术的氨基酸代谢组学分析方法三选用Diamonsil C 18色谱柱,乙腈?0.1%甲酸为流动相,梯度洗脱,三重四级杆质谱检测器,MRM 扫描方式,12min 内对血浆中12种氨基酸进行定量分析三应用本方法对脑缺血模型和黄芪注射液的治疗作用做出评价三通过偏最小二乘判别分析统计发现,脑缺血12h,其血浆中的氨基酸代谢表达存在显著差异,结合载荷图及VIP 值确定丝氨酸二天冬氨酸二甘胺酸等7种脑缺血生物标识物;采用黄芪注射液治疗后,从得分图上可以看到氨基酸代谢的轨迹发生了较大变化;与脑缺血模型组比较,丝氨酸二天冬氨酸二甘胺酸等生物标识物均向正常水平趋近三关键词 氨基酸代谢组;液相色谱?串联质谱;脑缺血;黄芪注射液 2012?07?17收稿;2012?10?15接受 本文系中国中医科学院自主选题研究项目(No.Z02067)资助*E ?mail:hongjun0420@https://www.360docs.net/doc/9414548553.html, 1 引 言 代谢组学是对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的学科[1,2]三随着转化 医学理念的不断深入,代谢组学的分析目标应更加具有针对性三从所有小分子代谢产物中筛选出与疾病具有明确相关性的目标成分群进行分析,不仅可以降低分析的难度二增加准确性,而且可以使找到的生物标识物更有可能应用于临床及药物的评价三 氨基酸在脑代谢的过程中具有重要的生理功能三研究表明,兴奋性氨基酸的大量释放与脑缺血时神经元的损伤具有密切关系[3,4]三本研究建立了一种基于高效液相色谱?串联质谱检测血浆中多种氨基酸的分析方法三本方法与其它衍生化分析法比较[5,6],操作简单,分析时间短三在此基础上对脑缺血的模型及黄芪注射液治疗作用作了评价,脑缺血12h 后,血浆中氨基酸整体表达存在显著差异,确定了丝氨酸二天冬氨酸二甘胺酸等7种生物标识物;经黄芪注射液治疗后,从得分图上可以看到氨基酸代谢的轨迹发生了较大变化;与脑缺血模型组比较,丝氨酸二天冬氨酸二甘胺酸等生物标识物均向正常水平趋近三 2 实验部分 2.1 仪器、试剂与材料 6410三重四级杆质谱(ESI ?QQQ/MS ,Agilent 公司);台式高速离心机(美国Labnet 公司)三酌?氨基丁酸(Gaba ),甘氨酸(Gly ),丙氨酸(Ala ),丝氨酸(Ser ),谷氨酸(Glu ),天冬氨酸(Asp ),同型半胱氨酸(Hcy ),蛋氨酸(Met ),酪氨酸(Tyr ),N ?乙酰天门冬氨酸(Naa ),苯丙氨酸(Phe ),色氨酸(Trp ),氘代丙烯酰胺(Acrylamide ?d 3,内标)标准品(Sigma 公司);甲醇(色谱纯,Fisher 公司);实验用 水为Milli ?Q Water System (Millipore ,Bedfo ?rd ,MA ,ΜSA )过滤后的纯水三实验动物为Wistar 大鼠(雄性,体重180~220g ,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)三黄芪注射液(神威药业有限公司),生产批号:10083041)三 2.2 动物实验 选取Wistar 雄性大鼠,共分为5组,分别为假手术对照组二脑缺血模型组二黄芪注射液给药组(高二中二低3个剂量),每组10只三脑缺血造模方法为的线栓法致局灶性脑缺血(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)[7]给药方法为腹腔注射给药,中剂量相当于药品说明书中标识的临床有效剂量,高剂 第41卷2013年3月 分析化学(FENXI HUAXUE ) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第3期344~348
食物中氨基酸的测定方法
食物中氨基酸的测定方法 测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。 一、氨基酸自动分析仪法 1.原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。 2.适用范围 GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。 本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定 3.仪器和设备 3.1真空泵 3.2恒温干燥箱 3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。用去离子水冲洗干净并烘干。 3.4真空干燥器（温度可调节） 3.5氨基酸自动分析仪。 4.试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 4.1浓盐酸：优级纯 4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。 4.3苯酚：需重蒸馏。 4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L 4.5缓冲液： 4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2
4.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。 4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 4.6茚三酮溶液 4.6.1 pH 5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOH.H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠调节pH至5.2。 4.6.2茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液（2.6.1）50ml加入4g 水合茚三酮（C9H4O3.H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O6.2H2O）搅拌至完全溶解。 4.7高纯氮气：纯度99.99%。 4.8 冷冻剂：市售食盐与冰按1：3混合 5.操作步骤 5.1样品处理：样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用。 5.2称样：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。均匀性好的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在10～20mg范围内；均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。将称好的样品防于水解管中。 5.3水解：在水解管内加6mol/L盐酸10～15ml（视样品蛋白质含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。 打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50ml 容量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1ml于5ml容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用1～2ml水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1mlpH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。 5.4测定：准确吸取0.200ml混合氨基酸标准，用pH2.2的缓冲液稀释到5ml，此标准稀释浓度为5.00nmol/50μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标
《氨基酸测定》
《氨基酸测定》 1 主题内容与适用范围 本标准规定了用氨基酸自动分析仪测定食物中氨基酸的方法。 本标准适用于食物中的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十六种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。 本标准不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的氨基酸测定。 2 原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 3 试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。 3.1 浓盐酸：优级纯。 3.2 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。 3.3 苯酚：须重蒸馏。 3.4 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L。 3.5 缓冲液 3.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na 3C 6 H 5 O 7 ·2H 2 O)和 16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。 3.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。 3.5.3 pH 4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水 稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。 3.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。 3.6 茚三酮溶液 3.6.1 pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H 2 O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2。 3.6.2 茚三酮溶液：取150mL二甲基亚砜(C 2H 6 OS)和乙酸锂溶液 (3.6.1)50mL加入4g水合茚三酮(C 9H 4 O 3 ·H 2 O)和0.12g还原茚三酮(C 18 H 10 O 6 ·2H 2 O) 搅拌至完全溶解。 3.7 高纯氮气：纯度99.99%。 3.8 冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。 4 仪器和设备 4.1 真空泵。 4.2 恒温干燥箱。 4.3 水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。用去离子水冲洗干净并烘干。 4.4 真空干燥器(温度可调节)。 4.5 氨基酸自动分析仪。
氨基酸含量分析法
新增附录 附录XX 氨基酸分析法 氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。 根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，具体水解方法由各品种项下规定。蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。 本法包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一种茚三酮柱后衍生法。不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。 由于本法衍生过程中衍生溶液量较少，且容易挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采用内标法进行测定，内标的确定由各品种项下规定。在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理，使其转化为稳定地产物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生测定，具体方法由各品种项下规定。在测定过程中，可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类，对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。 第一法 PITC柱前衍生氨基酸分析法 本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～1.25μmol/ml。 试剂（1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。（2）流动相B 乙腈－水（8：2）。 对照品溶液按各品种项下规定的方法制备。 供试品溶液按各品种项下规定的方法制备。 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm，5μm）；流速为每分钟 1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下：
氨基酸检测
氨基酸检测 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，在食品、医药、 饲料添加剂、化妆品及工农业等诸多方面有着广泛 的应用。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为21 世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越 大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。 科标检测中心在氨基酸检测方面具有资深经验，为 广大客户提供专业、全面的检测服务，并出具权威的检测报告。 1、脂肪族氨基酸：丙、缬、亮、异亮、蛋、天冬、谷、赖、精、甘、丝、苏、半胱、天冬酰胺、谷氨酰胺 2、芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸 3、杂环族氨基酸：组氨酸、色氨酸 4、杂环亚氨基酸：脯氨酸 检测对象 豆类谷物、药材、鱼类、肉类、饲料、食用菌类、保健品、化妆品等等。 检测项目 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸、胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺。 相关标准 标准代号标准名称 GB/T14924.10-2008实验动物配合饲料氨基酸的测定 GB/T15399-1994饲料中含硫氨基酸测定方法--离子交换色谱法 GB/T15400-1994饲料中色氨酸测定方法--分光光度法 GB/T17419-1998含氨基酸叶面肥料 GB/T18246-2000饲料中氨基酸的测定 科标检测致力于推动检测行业的规范化、科学化发展，秉承“敢为人先、开拓创新、同心协力、勇承重载”
GB/T18654.11-2008 养殖鱼类种质检验第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定 GB/T23296.12-2009 食品接触材料高分子材料食品模拟物中11-氨基十一酸的测定高效液相色谱法 GB/T28722-2012氨基酸中铁和铅的测定原子吸收光谱法GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的测定 GB/T8314-2013茶游离氨基酸总量的测定 NY1429-2010含氨基酸水溶肥料 NY/T1618-2008鹿茸中氨基酸的测定氨基酸自动分析仪法NY39-1987饲料级L-赖氨酸盐酸盐 NY/T56-1987谷物籽粒氨基酸测定的前处理方法 QB/T2409-1998化妆品中氨基酸含量的测定 QB/T4356-2012黄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法 SN/T0930-2000 进出口花粉中全氨基酸的测定方法氨基酸自动分析仪法 YC/T282-2009烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法 YC/T448-2012 烟草及烟草制品游离氨基酸测定离子色谱-积分脉冲安培法 科标检测致力于推动检测行业的规范化、科学化发展，秉承“敢为人先、开拓创新、同心协力、勇承重载”
串联质谱
串联质谱技术在新生儿疾病筛查中的应用 遗传性代谢病( inborn error of metabolism，IEM)是一类涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、类固醇等多种物质代谢的疾病。其种类繁多，是儿科临床的疑难杂症。虽然其单一病种患病率较低，但总体发病率较高，对人口素质、家庭乃至社会的发展构成了极大的威胁。其诊断主要依赖实验室的特异性检查。我国每年出生约2200万新生儿，仅高苯丙氨酸血症（包括苯丙酮尿症）这类疾病，每年就新增患儿1600~1800例。LC-MS/MS 技术的发展使得这类疾病在发病前进行干预成为可能。即在新生儿出生后体内某些代谢产物出现异常,而尚未出现临床症状或者症状不明显时就早期明确诊断，并进行及时而有效的对症治疗，以避免患儿的重要脏器出现不可逆性损害，进而保障儿童正常的体格发育和智能发育。这就是新生儿疾病筛查（neonatal screening）。国际新生儿疾病筛查发展趋势逐步提高到以串联质谱（MS/MS）技术为中心的筛查，如欧美等国目前已经广泛采用LC-MS/MS法对新生儿遗传疾病筛查。串联质谱即两个质谱仪串联后一次进行二级质谱检测,利用超敏性、高特异性、高选择性和快速检验的串联质谱技术，能在2~3 min内对1个标本进行几十种代谢产物分析，通过对这些产物的分析,可以对40种左右遗传性代谢病(包括氨基酸代谢紊乱、有机酸代谢紊乱和脂肪酸代谢紊乱性疾病)进行筛查和诊断。2004年12月美国食品药品管理局（FDA）专门制订了“用串联质谱法分析新生儿氨基酸,游离肉毒碱和酰基肉碱筛选检测系统”的指导性文件。串联质谱技术不仅实现了“一项实验检测一种疾病”向“一项实验检测多种疾病”的转变，提高了检测的效率,同时使筛查过程中常见的假阳性或者假阴性的发生率显著降低,使新生儿疾病筛查在内容和质量上都提高到一个新的水平。串联质谱在临床遗传性代谢病高危患儿选择性筛查方面也发挥着重要作用，上海第二医科大学附属新华医院新生儿筛查中心检测了1000多例全国各地送检的遗传性代谢病高危标本，发现阳性标本达9% ~10%，在22700例新生儿中筛查出阳性病例6例。因此，串联质谱技术是目前开展新生儿筛查和临床遗传性代谢病高危患儿筛查诊断较好的方法和发展方向。目前，LC-MS/MS技术检测相对发生率比较高的一些新生儿代谢疾病如下：中链脂肪酸脱氢酶缺乏症、短链脂肪酸脱氢酶缺乏症、长链脂肪酸代谢异常、卡尼丁（肉碱）吸收障碍、卡尼丁结合酶缺乏、卡尼丁穿透障碍、丙酸血症、甲基丙二酸血症、异戊酸血症、戊二酸血症、3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria、中链槭糖尿症(MCAD)、短链槭糖尿症(SCAD)、长链槭糖尿症(LCAD)、超长链槭糖尿症(VLCAD)、瓜氨酸血症、酪氨酸代谢紊乱、高胱氨酸尿、高苯丙氨酸血症、精氨酸酶缺乏症、精氨琥铂酸尿症、高甲硫氨酸血症、苯丙酮尿症、Argininosuccinic acidemia、非酮性高甘胺酸血症、Glutaric Acidemia、3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-lyase De?ciency、?-Ketothiolase De?ciency、Multiple Carboxylase De?ciency等。检测方法与原理：方法一，衍生化法：通过把样品进行“一步法”衍生，可以减少干扰，提高灵敏度。取1~2个滤纸血点(直径3 mm的干血滤纸片，相当于3.2 μL全血)，置于96孔过滤板中，每孔加入含氨基酸和酰基肉碱同位素内标的无水甲醇100 μL，室温放置20 min，以提取血片中的氨基酸和酰基肉碱，然后离心至另一个96孔板中，氮气保护下50℃吹干，加入60 μL正丁醇（（含3 mol/L HCl），密封，65℃孵育15 min进行衍生化。氨基酸衍生反应：
氨基酸测定方法
光度分析法[5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 的NaAc －HAc 缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取 g β-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=缓冲溶液中，得到C = g/L 标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取茚三酮溶于100ml 蒸馏水中，得到5g/L 的茚三酮水溶液。 标准曲线的确定 分别准确移取、、、、、、、标准液于8个比色管中，用pH=的缓冲溶液稀释到再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 样品的测定 稀释待测液于ml —ml,调pH 值到，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在ml —ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1： 吸光度加入标液体积(ml) 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热10min ，β-氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH= 样品的测定分析 将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=
游离氨基酸测定(完整版)
总游离氨基酸测定（完整版） 实验原理：游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化合物二酮茚－二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉. 仪器与用具：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶研钵；刻度吸管：0.1ml×1、1ml×2、2ml×2、5ml×1;沸水浴；具塞刻度试管20ml×10;分光光度计. 一、试剂 1.水合茚三铜：称重结晶的茚三铜0.6g,装入烧杯，加入正丙醇15ml，使其溶 解加入正丁醇30 ml、乙二醇60 ml、乙酸-乙酸钠缓冲液（pH=5.4）9 ml,混匀，棕色瓶冰箱保存，10天内有效。 2.乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4g，加入无氨蒸馏水 100 ml，电炉加热至沸，使其体积减半，冷却后加冰乙酸30 ml，加蒸馏水定容至100 ml。 3.氨基酸标准溶液：精确称取80℃烘干至恒重的亮氨酸0.0234g溶于10％异 丙醇并定容至50ml。取此液5ml蒸馏水稀释到50ml，即为5μg/ml氨基酸标液。 4.0.1%抗坏血酸：称取0.050g抗坏血酸，溶于50 ml蒸馏水中，即配即用。 5.10％乙酸 二、标准曲线制备 加塞子密封于沸水中加热15分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化褪去，待呈现兰紫色时，用60％乙醇定容至20ml，摇匀于570nm波长下比色。以吸光
度为纵坐标，氨基氮ug数为横坐标，绘标准曲线 三、实验步骤： 1.烟末0.5g于研钵中加入5 ml10%乙酸，研磨匀浆后用蒸馏水定容 100 ml，用滤纸过滤到三角瓶中备用。 2.1ml滤液加入到20ml 干燥试管中，加1 ml蒸馏水，水合茚三铜 3ml, 0.1%抗坏血酸0.1ml, 加塞子密封于沸水中加热15分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化褪去，待呈现兰紫色时，用60％乙醇定容至20ml，摇匀于570nm波长下比色。 四. 计算： 求三重复的平均值，由标准曲线得知各样的氨基酸ug数，代入公式计算。 氨基酸含量（mg/g干样）=｛氨基酸ug数×（提取液总体积/测定体积）｝/（样品g数×1000）
氨基酸态氮的测定
氨基酸态氮的测定 1概述 2氨基酸态氮的测定 一、概述 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，虽然从各种天然源中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，而在构成的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。 随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。 二、氨基酸态氮的测定 （1）双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、测定方法、结果计算 （2）电位滴定法：原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算 1、双指示甲醛滴定法 （1）原理 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。 （2）方法特点及应用 此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。普氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高;溶液中若有存在也可与甲醛反应，往往使结果高。 （3）试剂 ①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂， 用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。 ②0.1%百里酚酞乙醇溶液 ③0.1%中性红50%乙醇溶液 ④0.1%mol/L氢氧化钠标准溶液 （4）操作步骤 1）含氨基酸溶液20-30mg→250ml锥形瓶中→中性红指示剂2-3滴，滴0.01mol/lNAOH 滴定终点（红→琥珀色） 2）含氨基酸溶液20-30mg→250ml锥形瓶中→百里红酚酞3滴/中性甲醛20ml→摇匀，滴0.01mol/lNAOH滴定终点（淡蓝色） 3）分别记录两次消耗碱液的用量 （5）结果计算
氨基酸测定方法
光度分析法 [5] [6] β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 试剂的配制： 缓冲液的配制：配制pH= 的NaAc －HAc 缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制： 用电子天平准确称取 g β-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=缓冲溶液中，得到C = g/L 标准溶液。 茚三酮试剂的配制：称取茚三酮溶于100ml 蒸馏水中，得到5g/L 的茚三酮水溶液。 标准曲线的确定 分别准确移取、、、、、、、标准液于8个比色管中，用pH=的缓冲溶液稀释到再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。 样品的测定 稀释待测液于ml —ml,调pH 值到，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。 标准曲线的测定结果 β-氨基丙酸浓度在ml —ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1： 吸光度 加入标液体积(ml) 图 1 标准曲线的测定 Fig 1 Determination of the standard curve 注：在沸水中加热10min ，β-氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH= 样品的测定分析 将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=的缓冲液稀释到5ml 再加入1ml 茚三酮水溶液，在沸水中加热10min,测得如下数据如表3： 表3 样品的测定 待测液序号 待测液所对应的反应时间 吸光度A 1 10h 2 20h 3 22h
茚三酮显色法测定氨基酸含量
茚三酮显色法测定氨基酸含量 一、目的 学习茚三酮显色法测定氨基酸含量的方法 二、原理 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。 该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm 处的光密度，测定氨基酸的含量。 三、试剂与材料 （1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L 溶液。 （2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。用pH 检查校正。 （3）茚三酮显色液：称取85mg 茚三酮和15mg 还原茚三酮，用10mL 乙二醇甲醚溶解。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。 还原型茚三酮按下法制备：称取5g 茚三酮，用125mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。 将5g 维生素C 用250mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。 （4）60％乙醇。 （5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。 （6）分光光度计。 （7）水浴锅。 四、操作步骤 1．标准曲线的制作 分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。 以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 2．氨基酸样品的测定 取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）。